一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法。


背景技术：

2.人羊膜是源自胚泡内细胞团(icm)的胎儿来源组织，由较厚基底膜上的单层上皮细胞(人羊膜上皮细胞，hamec)和含有间充质细胞的胶原海绵层(人羊膜间充质细胞，hammsc)组成，通常在受精后第8或9天，icm分化为两层，即外胚层和下胚层，外胚层后来构成羊膜上皮的小细胞出现在滋养层和胚胎盘之间，外胚层产生羊膜以及胚胎的所有胚层(miki和strom，2006；miki等，2005)。因此，hamec细胞保持原肠胚细胞的可塑性，并被认为具有分化成各种组织的潜力。多项研究表明，hamec是干细胞标志物阳性的异源群体，它们显示出多向分化潜能，可分化为内胚层(肝、肺上皮)、中胚层(骨、脂肪)和外胚层(神经细胞)的细胞。
3.由于人羊膜为胚胎来源，故有干细胞特性，且羊膜上皮细胞缺少主要的组织相容性抗原，所以haecs已广泛用于多种疾病的临床前研究，包括烧伤愈合、糖尿病、中枢神经系统损伤与疾病、肝损伤、肺损伤、急性肾损伤(aki)、卵巢损伤、角膜损伤和肿瘤等。将羊膜从胎盘上剥离后，通常采用酶消化法获得羊膜上皮细胞。例如，专利cn106520676b公开一种从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用，将胎盘用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒；用手术镊撕取胎膜外层羊膜置玻璃皿中，用基础平衡盐溶液清洗表面污血，剪碎成，小块；膜小块均匀贴于培养皿，羊膜上皮层朝下，晾干后，添加完全培养基，培养；2天后补液，继续培养；待能看到上皮细胞爬出，去组织，换液继续培养；待出现多处典型的上皮细胞群，局部融合率达90％时，进行传代培养；收获：用胰酶消化后收集细胞，计数，冻存，得到人羊膜上皮细胞。专利cn104818244b公开一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，羊膜组织分离和消毒；羊膜上皮细胞分离；羊膜上皮细胞纯化培养，得到高纯度p0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，短时间培养后进行两次胰酶消化，获得高纯度羊膜上皮细胞。但是，现有技术中，消化下来的细胞通过镜下观察和流式细胞仪检测，结果显示杂细胞非常多，主要是一些不能贴壁的血细胞和小颗粒，它们会延长上皮细胞的贴壁时间，而且对细胞的生长和观察都有极大的干扰，所以要尽量将其去除，基于此完成了本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法，采用percoll密度梯度离心进行羊膜上皮细胞的分离与培养，可以有效去除其中杂细胞和小颗粒，从而获得较均一的目标细胞群，有效提高目标细胞的纯度。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法，包括以下步骤：
7.步骤1、用酶消化法收集原代羊膜上皮细胞；
8.步骤2、采用percoll密度梯度离心方法对步骤1收集的原代羊膜上皮细胞进行分
离纯化为上、下两层细胞；
9.步骤3、分别收集步骤2中上层细胞和下层细胞，上层是目标细胞，下层是杂细胞。
10.作为优选，步骤1中，所述酶消化法收集原代羊膜上皮细胞的方法包括：
11.(1a)收到羊膜后，在生物安全柜中用灭菌后的镊子将羊膜夹放到平皿中，用生理盐水或pbs洗净血污；
12.(1b)取灭菌好的齿镊和不锈钢剪刀，将羊膜组织切成5cm
×
5cm大小的块；
13.(1c)将羊膜组织放入50ml离心管中，加入0.25％胰酶，37℃消化1h；
14.(1d)加入含10％血清的pbs终止消化，500g
×
5min离心，收集细胞；
15.(1e)重复步骤(1c)和步骤(1d)一次；
16.(1f)合并两次消化收集的细胞。
17.作为优选，步骤2中，所述percoll密度梯度离心方法包括：
18.(2a)准备percoll分离液：用生理盐水将percoll稀释到75％和55％两个浓度；用移液管将两种浓度的percoll缓慢加到15ml离心管中，其中75％的percoll 2.5ml加到下层，55％的percoll 2.5ml加到上层；
19.(2b)加入细胞：将步骤1收集的细胞以500g
×
5min离心，生理盐水重悬至10ml，缓慢加在percoll上层，调整离心机参数为：离心力：500g；离心时间：15min；升速：1；降速：0；离心完成后细胞分为两层，下层为小的细胞或者颗粒杂质，上层为大的细胞。
20.本发明还提供所述原代羊膜上皮细胞的纯化方法得到的羊膜上皮细胞在制备细胞制剂或药物中的应用。
21.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
22.本发明提供一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法，先用酶消化法收集羊膜上皮细胞，然后采用percoll密度梯度离心方法将分离的原代羊膜上皮细胞分为上下两层细胞，对上层和下层细胞分别收集并检测其特性，确定上层是目标细胞，下层是杂细胞，该方法可以有效去除杂细胞和小颗粒，从而避免它们延长上皮细胞的贴壁时间以及干扰细胞的生长和观察等，获得较均一的目标细胞群，应用于多种疾病的临床研究。
附图说明
23.图1为实施例中不同状态的羊膜上皮细胞表征图，其中，a：羊膜上皮细胞酶消化之后且分离纯化之前的状态；b：羊膜上皮细胞用percoll分离后的下层细胞；c：羊膜上皮细胞用percoll分离后的上层细胞。
24.图2为实施例中密度梯度离心纯化细胞的照片，其中下层为小的细胞或者颗粒杂质，上层为较大的目标细胞。
25.图3为实施例中羊膜上皮细胞用percoll分离后细胞的流式fscvsssc结果，其中，a：羊膜上皮细胞用percoll分离后下层细胞；b：羊膜上皮细胞用percoll分离后上层细胞。
26.图4为实施例中羊膜上皮细胞用percoll分离后上层细胞的表征结果，其中，a：上层细胞的fsc-ssc结果；b：上层细胞的cd45阴性表达；c：上层细胞的cd324阳性表达；d：上层细胞的ssea4阳性表达。
27.图5为实施例中羊膜上皮细胞用percoll分离后下层细胞的表征结果，其中，a：下层细胞的fsc-ssc结果；b：下层细胞的cd45阴性表达；c：下层细胞的cd324阴性表达；d：下层
细胞的ssea4阴性表达。
具体实施方式
28.下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
29.实施例1
30.一、材料：
31.试剂：胰酶(cat.25200072gibco)、percoll(cat.p4937 sigma-aldrich)、cd45(cat.304008biolegend)、cd324(cat.324108biolegend)、ssea4(cat.330406biolegend)、fbs(fbs-0500达柯为)。
32.仪器：倒置显微镜(leica dm3000)、流式细胞仪(cytoflexbeckman coulter)、离心机(thermo fisher sorvall st16)、co2培养箱(thermo fisher heracell 150i)。
33.二、方法：
34.1、细胞收集
35.(1)收到羊膜后，在生物安全柜中用灭菌后的镊子将羊膜夹放到大小合适的平皿中，用生理盐水或pbs，仔细洗净血污。
36.(2)取灭菌好的齿镊和不锈钢剪刀，将羊膜组织切成大约5cmx5cm大小的块。
37.(3)将羊膜组织放入50ml离心管中，加入0.25％胰酶，37℃消化1h。
38.(4)加入含10％血清的pbs，终止消化，500g
×
5min离心，收集细胞。
39.(5)重复步骤(3)和步骤(4)一次。
40.(6)合并两次消化收集的细胞，准备密度梯度离心。
41.如图1所示，其中羊膜上皮细胞酶消化之后且分离纯化之前的状态如图1a所示，羊膜上皮细胞用percoll分离后的下层细胞如图1b所示，可见是一些形态较小的细胞，羊膜上皮细胞用percoll分离后的上层细胞如图1c所示，该层细胞是形态较大的细胞，小细胞去除的比较干净。
42.2、密度梯度离心纯化细胞
43.(1)准备percoll：(a)用生理盐水将percoll稀释到75％和55％两个浓度；(b)用移液管缓慢将两种浓度的percoll加到15ml离心管中，其中75％的percoll2.5ml加到下层；55％的percoll2.5ml加到上层。
44.(2)加入细胞：(a)将之前收集的细胞以500g
×
5min离心，生理盐水重悬至10ml，缓慢加在percoll上层；(b)调整离心机参数：离心力：500g；离心时间：15min；升速：1；降速：0；(c)离心完成后，可见细胞分为两层，如图2所示，下层为小的细胞或者颗粒杂质，上层为较大细胞，即目标细胞。
45.(3)用移液器小心收集上层细胞和下层细胞。
46.三、结果：
47.1、羊膜上皮细胞percoll分离后的形态学观察，通过倒置显微镜观察上层和下层细胞的不同，如图1所示。
48.2、细胞功能分析
49.用流式细胞术检测percoll分离后的上层和下层两种细胞的不同表型，结果如下：
50.(1)通过流式细胞仪的fsc和ssc可以观察到，下层细胞是一些个体较小且胞内结构不复杂的细胞(图3a)，上层细胞是一些个体较大且胞内结构相对复杂的细胞(图3b)。
51.(2)上层的大细胞fsc-ssc结果和cd45阴性表达结果分别如图4a和4b所示，cd324和ssea4表达量分别为88.05％(图4c)和89.73％(图4d)，确定是目标细胞。
52.(3)下层的小细胞fsc-ssc结果表明，该细胞群体是一种个体较小、结构简单的细胞颗粒(图5a)，下层细胞的cd45、cd324和ssea4的阴性表达结果分别图5b-d所示，结果表明关键指标都不表达，故非所需细胞。
53.四、结论：
54.本发明中采用percoll密度梯度离心方法去除分离的羊膜上皮细胞中杂细胞，从而获得较均一的目标细胞群应用于多种疾病的临床研究，经测试证明是一种很有效的方法。
55.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、用酶消化法收集原代羊膜上皮细胞；步骤2、用percoll密度梯度离心方法分离纯化步骤1收集的原代羊膜上皮细胞，分为上、下两层细胞；步骤3、分别收集步骤2中上层细胞和下层细胞，上层是目标细胞，下层是杂细胞。2.根据权利要求1所述原代羊膜上皮细胞的纯化方法，其特征在于，步骤1中，所述酶消化法收集原代羊膜上皮细胞的方法包括：(1a)收到羊膜后，在生物安全柜中用灭菌后的镊子将羊膜夹放到平皿中，用生理盐水或pbs洗净血污；(1b)取灭菌好的齿镊和不锈钢剪刀，将羊膜组织切成5cm
×
5cm大小的块；(1c)将羊膜组织放入50ml离心管中，加入0.25％胰酶，37℃消化1h；(1d)加入含10％血清的pbs终止消化，500g
×
5min离心，收集细胞；(1e)重复步骤(1c)和步骤(1d)一次；(1f)合并两次消化收集的细胞。3.根据权利要求1所述原代羊膜上皮细胞的纯化方法，其特征在于，步骤2中，所述percoll密度梯度离心方法包括：(2a)准备percoll：用生理盐水将percoll稀释到75％和55％两个浓度；用移液管将两种浓度的percoll缓慢加到15ml离心管中，其中75％的percoll 2.5ml加到下层，55％的percoll2.5ml加到上层；(2b)加入细胞：将步骤1收集的原代羊膜上皮细胞以500g
×
5min离心，生理盐水重悬至10ml，缓慢加在percoll上层，调整离心机参数后离心，细胞分为两层，下层为小的细胞或者颗粒杂质，上层为大的细胞。4.根据权利要求3所述原代羊膜上皮细胞的纯化方法，其特征在于，调整离心机参数包括：离心力为500g，离心时间为15min，升速为1，降速为0。5.权利要求1至4任一项所述原代羊膜上皮细胞的纯化方法得到的羊膜上皮细胞在制备细胞制剂或药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法，包括：用酶消化法收集原代羊膜上皮细胞；采用Percoll密度梯度离心方法对收集的原代羊膜上皮细胞进行分离纯化为上、下两层细胞；分别收集上层细胞和下层细胞，上层是目标细胞，下层是杂细胞。本发明对分离纯化的上层和下层细胞分别收集并检测特性，确定上层是目标细胞，下层是杂细胞，该方法可以有效去除杂细胞和小颗粒，从而避免它们延长上皮细胞的贴壁时间以及干扰细胞的生长和观察，获得较均一的目标细胞群可以用于制备细胞制剂或药物，用于多种疾病临床研究。于多种疾病临床研究。于多种疾病临床研究。


技术研发人员：周鑫磊 苏苗苗 姬广超 庞永 王晓明
受保护的技术使用者：上海安库生医生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/9