一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物及其制备方法和用途

1.本发明涉及天然产物领域，特别是一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物及其制备方法和用途。
背景技术：
：：2.灰毡毛忍冬(loniceramacranthoideshand.-mazz.)是忍冬科忍冬属藤本植物，为我国特有种类，其干燥花蕾或带初开的花为中药山银花药材的主要来源，具有清热解毒，疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。三萜皂苷类化合物是灰毡毛忍冬的特征性成分，主要存在于灰毡毛忍冬花蕾中(李锦燊等，北方药学，2014，11(02):71-73.)。现有发现的灰毡毛忍冬中多个皂苷类化合物具有抗肿瘤活性，如灰毡毛忍冬次皂苷乙表现出显著体内外抗肿瘤活性(wang,jetal.foodchem.toxicol.47,1716-1721；shan,y.,etal.nutr.cancer.68,280-289)。因此，有必要进一步挖掘灰毡毛忍冬抗肿瘤的活性成分分析，开发成一类新的防治肿瘤生长的抗癌药物。技术实现要素：3.本发明的目的在于提供一种灰毡毛忍冬三萜皂苷类化合物，以及其制备方法和在抗肿瘤药物中的用途。4.为实现本发明的目的，解决的技术方案如下：5.一种灰毡毛忍冬三萜皂苷类化合物，化学名为3-o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-l-arabinopyranosyl-23-hydroxy-olean-18-ene-28-oicacid，具有如下化学结构式：[0006][0007]上述化合物通过如下方法制备，包括如下步骤：[0008]s1以灰毡毛忍冬干燥的花为原料制成灰毡毛忍冬总皂苷，后使用反相硅胶柱层析，洗脱体系为乙醇-水；[0009]s2将s1所得产物以液质为导向，用凝胶柱层析和制备液相色谱，洗脱体系均为甲醇-水，制得所述化合物。[0010]进一步的，s1中，取洗脱体系乙醇：水比例为60：40的洗脱馏分进行s2步骤。[0011]进一步的，s2中，取凝胶柱洗脱剂体系甲醇：水比例为35:65的洗脱馏分进入液相色谱，取洗脱剂体系甲醇：水比例为40:60的洗脱馏分得到所述化合物。[0012]在一具体实施例中，反相硅胶柱层析选自c18反相柱，凝胶柱层析选自葡聚糖凝胶lh-20。[0013]进一步的，所述灰毡毛忍冬总皂苷的制备方法包括如下步骤：以灰毡毛忍冬loniceramacranthoideshand.-mazz.干燥的花为原料，使用水、醇、或醇与水的混合物通过回流法、水提取法或冷浸法，获得提取液；将提取液通过大孔吸附树脂柱层析，洗脱体系为乙醇-水。[0014]进一步的，使用大孔吸附树脂柱层析，取洗脱体系乙醇：水比例为70:30～75:15得所述灰毡毛忍冬总皂苷。[0015]进一步的，当使用醇或醇与水混合物提取时，在提取液进入大孔吸附树脂柱层析分离之前还包括将提取液浓缩。[0016]进一步的，提取液提取温度为室温25℃～100℃，提取次数为2～3次，每次提取时间为2h～7d。[0017]所述醇为小分子醇类，优选的为甲醇、乙醇。在一实施例中，当使用醇与水混合物时，优选的为乙醇与水的混合物，体积比70％乙醇～95％乙醇。在一实施例中，当使用回流法或水提取法时，每次提取温度为80～100℃，每次提取时间为2～3h。在另一实施例中，当使用冷浸提取时，每次提取温度为室温，每次提取时间为7d。[0018]优选的，大孔吸附树脂选自d101、ab-8、hp-20中任意一种或多种的混合。更优选的，大孔吸附树脂选自d101。[0019]本发明还提供上述化合物在制备抗肿瘤药物上的用途。进一步的，所述肿瘤为宫颈癌、大肠癌、黑色素瘤或乳腺癌。所述抗肿瘤药物包括活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包括上述化合物。[0020]本发明的有益效果是：本发明首次发现的灰毡毛忍冬三萜皂苷类化合物能在体外抑制肿瘤细胞瘤细胞抑制活性测定生长，对hela、htc-116、b16和mda-mb-468肿瘤细胞进行细胞抑制活性测定效果良好，具备开发抗肿瘤药的潜力。附图说明[0021]图1是本发明提供的灰毡毛忍冬三萜皂苷类化合物关键hmbc信号图。具体实施方式[0022]下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。[0023]实施例1目标化合物1制备与鉴定[0024]取灰毡毛忍冬干燥的花3kg，用70％乙醇水溶液在80℃条件下回流提取3次，每次提取2h，合并提取液，然后用布氏漏斗抽滤，得滤液；[0025]然后将滤液旋蒸，得到无醇味的褐色胶状粗提物96.4g；[0026]将粗提物用d101大孔树脂柱分离，洗脱体系乙醇：水比例为0:100,30:70,70:30,95:5，得到4个主要馏分(fr.i-fr.iv)，其中fr.iii为灰毡毛忍冬总皂苷；[0027]取洗脱体系乙醇：水比例为70：30的洗脱馏分fr.iii(34.2g)用c18反相柱分离，洗脱体系乙醇：水比例依次为30:70,40:60,60:40,80:20，得到fr.iii-a～d四个亚馏分；[0028]然后以液质为导向，取fr.iii-a洗脱体系乙醇：水比例为60：40(16.4g)的洗脱馏分用葡聚糖凝胶lh-20(洗脱剂体系为甲醇：水比例为35:65)和制备液相(洗脱剂体系为甲醇：水比例分别为40:60)分离，最终得到本发明所提供的目标化合物1(27mg)。[0029]综合运用各种波谱技术(ms,nmr,uv,ir)，鉴定目标化合物1的结构。[0030]上述目标化合物1为白色粉末，易溶于水，甲醇-水，难溶于乙酸乙酯等小极性溶剂，旋光度为[α]20d-28.91(c0.11，甲醇)，tcl板展开喷香草醛-浓硫酸加热显蓝紫色，提示该化合物1可能是皂苷类化合物。hr-esi-ms显示m/z为1097.5529[m+na]+(计算值：1097.5503)，可确定其分子式为c53h86o22，计算其不饱和度为11。[0031]目标化合物1的1h-nmr谱中，显示δh1.09(3h,s,h-24)、δh0.86(3h,s,h-25)、δh1.01(3h,s,h-26)、δh0.88(3h,s,h-27)、δh1.11(3h,s,h3-29)和δh1.03(3h,s,h3-30)为6个甲基氢信号。13c-nmr谱中，显示δc13.9(c-24)、δc17.4(c-25)、δc16.3(c-26)、δc15.2(c-27)、δc30.8(c-29)和δc29.3(c-30)为6个相对应的甲基碳信号。另外，根据δc81.2(c-3)和δc179.3(c-28)的化学位移，可确定糖链连接在苷元的c-3上。hmbc谱中，δh5.24(h,s,h-19)的烯烃质子与δc41.6(c-13)、δc48.5(c-17)、δc32.4(c-20)、δc34.2(c-21)、δc30.8(c-29)的5个碳原子相关，同时δc139.1(c-18)与δh2.68(h,d,h-13)相关，表明双键位于c-18和c-19。进一步分析2d-nmr(cosy、roesy、hsqc和hmbc)发现，目标化合物1的苷元部分为23-hydroxyolean-18-ene-28-oicacid。[0032]目标化合物1的c-3位单糖残基在δh5.24(h,d,h-1′)、δh6.27(h,s,h-1′)、δh5.43(h,d,h-1′)和δh5.18(h,d,h-1′)分别和δc104.8(c-1′)、δc101.4(c-1′)、δc106.7(c-1′)、δc104.9(c-1””)相关，表明其含有4个单糖。将目标化合物1酸水解后的三甲基硅基衍生物与原糖进行气相色谱-质谱分析，结果表明糖部分由l-ara、l-rha和d-glc组成(比例为1:1:2)。葡萄糖单元的β-端基构型由j1,2偶联常数(7.8-8.0hz)确定，阿拉伯糖单元的α-端基构型由j1,2偶联常数(6.27hz)确定，鼠李糖单元的α-端基构型由化学位移δc69.6(c-5″)确定。通过以下hmbc相关性推导出糖元c-3处四糖链的连接顺序：ara的δh5.24(h,d,h-1')与糖苷配基δc81.2(c-3)相关，rha的δh6.27(h,s,h-1”)和ara的δc75.3(c-2')相关，glci的δh5.43(h,d,h-1”')和rha的δc83.5(c-3”)相关，glcii的δh5.18(h,d,h-1””)和glci的δc81.1(c-4”')相关。以上核磁数据表明目标化合物1的糖基部分与macranthosideb的四糖部分相同。通过对hsqc和hmbc谱分析将全部1h和13c核磁信号归属。最终鉴定为3-o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-l-arabinopyranosyl-23-hydroxy-olean-18-ene-28-oicacid(1)。具体的目标化合物1氢谱和碳谱波谱数据见表1。[0033]表1.本发明所提供的目标化合物1的氢谱和碳谱波谱数据[0034]table11hand13cnmrspectraldataof1[0035][0036][0037]dataweremeasuredat600mhzfor1hand150mhzfor13cinpyridine-d5,δinppm,jinhz.[0038]lc-ms测定目标化合物1的纯度，lc色谱条件为：色谱柱agilentporoshell120sb-aqc18(3.0×100mm，2.7um)；柱温30℃；流动相为0.1％甲酸溶液(a)-甲醇(b)，梯度洗脱(0～3min，10％～45％b；3～12min，45％～60％b；12～18min，60％～95％b；18～20min，95％b)，流速为0.3ml·min-1；进样量为5μl。质谱条件为：采用esi离子源，离子化模式为负离子模式，毛细管电压为3.5kv，干燥气温度350℃，裂解电压为：碎裂电压为0-16min，135v；16-30min，175v；30-38min，210v，二级电压为：0-30min，30v，30-38min，40v，雾化气体为n2，子离子扫描范围为m/z100～1700，雾化气压力50psi，干燥气流速10.0l·min-1，skimmer电压65v。3-o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-l-arabinopyranosyl-23-hydroxy-olean-18-ene-28-oicacid(1)的保留时间为31.24min，按面积归一化法计算产物的纯度为98.74％。[0039]实施例2使用水提法制备目标化合物1[0040]取灰毡毛忍冬干燥的花1kg，用水加热提取三次，每次水用量分别为10l，每次提取时间分别为2h，每次提取温度分别为100℃；[0041]得到的提取液经大孔树脂hp-20吸附，洗脱体系乙醇：水比例依次为0:100,30:70,70:30,95:5，取70％乙醇的洗脱液减压回收溶剂得灰毡毛忍冬总皂苷47g；[0042]所得灰毡毛忍冬总皂苷进行c-18反相硅胶柱层析，流动相乙醇：水比例依次为30:70，40:60，60:40，80:20，0:100；[0043]取第三个馏分乙醇：水比例为60：40洗脱馏分，以液质为导向，将馏分使用葡聚糖凝胶lh-20(洗脱剂体系为甲醇：水比例为35:65)和制备液相(洗脱剂体系为甲醇：水比例为40:60)分离，得到所述3-o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-l-arabinopyranosyl-23-hydroxy-olean-18-ene-28-oicacid(1)12mg，得率为0.0012％，lc-ms测定产物纯度为98.2％。[0044]实施例3：使用甲醇冷浸提取法制备目标化合物1[0045]取灰毡毛忍冬干燥花1kg，用甲醇冷浸提取三次，每次甲醇用量分别为20升，每次提取时间分别为7天，每次提取温度均为室温，提取液浓缩至无醇味的浸膏(干重为210g)；[0046]将所得浸膏加10倍体积的水溶解，滤纸过滤除去水不溶物；[0047]所得滤液用大孔树脂ab-8进行吸附，洗脱体系乙醇：水比例依次为0:100,15:75，75：15，取乙醇：水比例为75：15洗脱液，浓缩得灰毡毛忍冬总皂苷54g；[0048]所得灰毡毛忍冬总皂苷进行c-18反相硅胶柱层析，流动相乙醇：水比例依次为30:70，40:60，60:40，80:20，0:100；[0049]取第三个馏分乙醇：水为60：40洗脱馏分，以液质为导向，将馏分使用葡聚糖凝胶lh-20(洗脱剂体系为甲醇：水比例为35:65)和制备液相(洗脱剂体系为甲醇：水比例为40:60)分离后，得到所述3-o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-l-arabinopyranosyl-23-hydroxy-olean-18-ene-28-oicacid(1)13mg，得率为0.0013％，lc-ms测定产物纯度为98.5％。[0050]实施例4肿瘤细胞抑制活性测定[0051]本实施例选用mtt法对目标化合物1进行体外活性测试以抗癌药物5-氟尿嘧啶5-fluorouracil作为阳性对照。选用的肿瘤细胞为hela、htc-116、b16和mda-mb-468肿瘤细胞。具体做法如下：[0052]将对数生长期的hela、htc-116、b16和mda-mb-468肿瘤细胞分别接种于96孔培养板上，密度为每孔100μl含有细胞5000个，同时用浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μmol/l的目标化合物1进行处理，在温度为37℃、含有5％co2的培养箱中孵育。72h后，向各孔中加入10μlmtt(5mg/ml，pbs)，继续在培养箱中孵育4h后，1000rpm离心5min，小心弃去上清。每孔加入100μldmso，振摇10min，用酶标仪在波长570nm的条件下测定每孔的吸光值并计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率计算公式如下：[0053]细胞生长抑制率(％)＝(1－实验组od值/细胞对照组od值)×100[0054]阳性对照为5-氟尿嘧啶，浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/l。采用dps软件计算ic50值。测定结果见表2。[0055]表2.目标化合物1对hela、htc-116、b16和mda-mb-468肿瘤细胞抑制活性(ic50,μm)[0056]当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物，其特征在于：所述灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物具有如下化学结构式：2.一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：s1以灰毡毛忍冬干燥的花为原料，制成灰毡毛忍冬总皂苷后使用反相硅胶柱层析，洗脱体系为乙醇-水；s2将s1所得产物以液质为导向，用凝胶柱层析和制备液相色谱，洗脱体系均为甲醇-水，制得所述化合物。3.根据权利要求2所述的一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物的制备方法，其特征在于：s1中，取洗脱体系乙醇：水比例为60：40的洗脱馏分进行s2步骤。4.根据权利要求2所述的一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物的制备方法，其特征在于：s2中，取凝胶柱洗脱剂体系甲醇：水比例为35:65的洗脱馏分进入液相色谱，取洗脱剂体系甲醇：水比例为40:60的洗脱馏分得到所述化合物。5.根据权利要求2所述的一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物的制备方法，其特征在于：所述灰毡毛忍冬总皂苷的制备方法包括如下步骤：以灰毡毛忍冬干燥的花为原料，使用水、醇、或醇与水的混合物通过回流法、水提取法或冷浸法，获得提取液；将提取液通过大孔吸附树脂柱层析，洗脱体系为乙醇-水。6.根据权利要求5所述的一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物的制备方法，其特征在于：使用大孔吸附树脂柱层析，取洗脱体系乙醇：水比例为70:30～75:15的洗脱馏分得所述灰毡毛忍冬总皂苷。7.根据权利要求5所述的一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物的制备方法，其特征在于：当使用醇或醇与水混合物提取时，在提取液进入大孔吸附树脂柱层析分离之前还包括将提取液浓缩。8.根据权利要求5所述的一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物的制备方法，其特征在于：提取液提取温度为室温25℃～100℃，提取次数为2～3次，每次提取时间为2h～7d。9.一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。10.根据权利要求9所述的一种灰毡毛忍冬三萜皂苷化合物在制备抗肿瘤药物中的应
用，其特征在于：所述肿瘤为宫颈癌、大肠癌、黑色素瘤或乳腺癌。

技术总结
本发明涉及天然药物化学领域，具体涉及以灰毡毛忍冬干燥的花为原料，通过天然产物化学方法提取分离，得到的一种新三萜皂苷类化合物，该化合物对Hela、HTC-116、B16和MDA-MB-468肿瘤细胞具有较强抑制作用，可为抗肿瘤药物筛选提供新的先导化合物。选提供新的先导化合物。选提供新的先导化合物。


技术研发人员：李剑 刘群 陈雨 单宇 夏云 别雪松 徐向阳 刘辉 张蕙
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所 金陵药业股份有限公司
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/9