一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法

1.本发明属于分析化学和生物技术领域，具体涉及一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法。


背景技术：

2.粘蛋白1（muc1，recombinant mucin 1）是癌症中一种重要的蛋白质生物标志物，人们已经在结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌等多种肿瘤组织中检测到muc1。因此，若能够对muc1进行高灵敏的准确定量检测对于尽早、及时发现癌变意义重大。
3.一般来说，健康人血清中的muc1浓度低于30 u/ml，其浓度增加100倍表示患癌的可能性更大，说明muc1具有作为血清学或组织化学诊断标志物评估肿瘤治疗的潜力。在常规临床实践中，基于抗原-抗体相互作用的免疫分析测定一直是满足日益增长的生物标志物检测需求的主要方法。因为抗体可以从复杂背景中以高特异性捕获目标蛋白，所以传感和诊断市场主要是抗体。传统技术中酶联免疫吸附试验(elisa)、免疫组织化学、荧光原位杂交和放射免疫测定等技术被认为是生物标志物检测的金标准，但仍然存在如抗体制备周期长、抗体批次间差异大、检测成本较高等诸多问题，其应用受到了一定的限制。
4.核酸适配体(apt)是通过指数富集的配体系统进化技术(selex)合成的一种短的寡核苷酸序列，可以是dna或rna。适配体与目标物结合具有高特异性和高亲和力。相比于抗体，适配体具有易于合成、高稳定性、低成本和易于修饰等优点。适配体传感器种类繁多，包括电化学发光、比色、荧光和电化学传感器。在这些适配体传感器中，比色法因其成本低、简单实用、无需任何精密仪器即实现肉眼观察颜色变化而得到定性或者半定量结果，并且，只要结合便携式紫外检测仪即可实现现场分析检测。
5.为了进一步提高检测灵敏度和降低检测限，各种纳米材料越来越多地被用作构建传感界面的平台或作为信号放大元件，这主要是由于纳米材料的比表面积大，有利于与更多的信号分子结合。基于纳米材料的比色传感器具有分析简单快速、成本低、操作方便、可视信号等优点，引起人们广泛关注。纳米金(aunps)易于制备且具有优异的光学性能，所以被越来越多地用于生物传感。磁珠(mbs)，又称磁性纳米粒子或者磁性微球，一般是均匀、球形且具有超顺磁性的微粒。经过一定处理后，可将某些生物分子固定在磁珠表面，利用生物分子与靶标的相互作用生成复合物，磁珠便成为这些复合物的载体。在磁铁的吸力作用下，发生力学移动，使复合物与其它物质分离，从而达到分离和提取目标物的目的，并最大程度减小基质效应。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法。该方法操作过程简单，特异性强，成本较低，可用于现场快速检测。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法：连接黏蛋白1适配体的互补cdna
的磁珠与纳米金-黏蛋白1适配体-辣根过氧化物酶(hrp)(aunps@(muc1-apt)-hrp)复合物结合；当存在muc1时，muc1和muc1-apt特异性结合作用力强于muc1-apt和cdna的结合，aunps@(muc1-apt)-hrp从磁珠表面脱离进入上清液中，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)后，aunps@(muc1-apt)-hrp复合物中的hrp催化tmb产生显色反应，溶液从无色变为蓝色，从而实现对黏蛋白1的比色检测。
8.一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法，包括以下具体步骤：（1）aunps@(muc1-apt)的制备（1）合成纳米金（aunps）：所有玻璃器皿在王水（hcl:hno3=3:1）浸泡后用超纯水清洗，使用前烘干。取5 ml柠檬酸三钠（1wt%）放入棕色锥形瓶中，再加入90 ml超纯水，加热至沸腾，再向其中加入5 ml haucl4（0.2wt%），当颜色从淡黄色变成酒红色，冷却至室温，备用;(2)纳米金-黏蛋白1适配体-辣根过氧化物酶(aunps@(muc1-apt)-hrp)复合物制备：取30 μl 10 μm muc1-apt，加还原剂tcep在室温下活化1 h，再加入600 μl aunps溶液，振荡孵育16 h(150 rpm)，50 μl100 mm ph 7.4的pb缓冲液分五次（5 μl，5 μl，10 μl，10 μl，20 μl)加入，振荡孵育24 h后离心30 min(13500 rpm)，去除上清液；随后加入200 μl 10 mm ph7.4的pbs缓冲液洗涤三次，再用200 μlph 7.4的pbst缓冲液重悬；（3）功能化磁珠的制备：取5 μl 0.4 mg/ml的链霉亲和素化的磁珠（avidin-mbs）和100 nm的黏蛋白1适配体的互补cdna混合于5 μl pbst中，在25℃孵育30 min。加入50 μl 1 μm 9a在25℃孵育30 min进行封闭；加入预先在25℃反应好的1 μl 1 μm hrp、5 μl 100 nm muc1-apt、4 μl ph 7.4的pbst混合液，在37℃孵育1 h，用200 μl ph 7.4的pbst清洗后获得功能化磁珠，备用；（4）黏蛋白1的比色检测将功能化好的磁珠分散后加入ph 7.4的pbst配制的不同浓度的muc1溶液，在37℃下孵育45 min；磁分离后在收集的上清液中加入tmb，10 min后观察颜色，并在650 nm处检测吸光度。
9.上述步骤（2）中所述muc1适配体aptamer的核苷酸序列为：5
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biotin-gcagttgatcctttggataccctgg-(ch2)
6-sh-3
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。
10.上述步骤（3）中所述cdna探针的核苷酸序列为：5
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ccagggtatccaattttt-biotin-3
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。
11.上述步骤（3）中所述9a的核苷酸序列为：5'-biotin-aaaaaaaaa-3'。
12.上述方法中：所述100 mm ph 7.4 pb缓冲液配方为：100 mm na2hpo4，100 mm nah2po4，3 m nacl，调节ph至 7.4。
13.所述ph 7.4的pbs缓冲液配方为：137 mm nacl，10 mm na2hpo4，1.4 mm kh2po4，2.7 mm kcl，调节ph至 7.4。
14.所述10 μm muc1适配体aptamer用ph 7.4的pbs缓冲液配制。
15.所述ph 7.4 pbst缓冲液配方为：由上述ph 7.4的pbs缓冲液+0.05%(v/v)tween-20制备。
16.上述方法中，所述muc1溶液的浓度为：75~500 μg/ml。
17.上述一种基于适配体的检测黏蛋白1的比色方法在黏蛋白1检测中的应用。
18.本发明的技术原理为：本发明将链霉亲和素化的磁珠（avidin-mbs）与生物素修饰的cdna连接形成mbs-cdna。muc1-apt一端修饰生物素，可结合链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-hrp）；另一端修饰巯基，可结合纳米金颗粒aunps；制备形成aunps@(muc1-apt)-hrp复合物。根据dna序列的设计，muc1-apt与cdna通过碱基互补配对偶联到功能化磁珠mbs-cdna上。理论上，当不存在muc1时，经过磁分离后的上清液基本没有aunps@(muc1-apt)-hrp，加入tmb显色液后，上清液无色。当存在muc1时，由于muc1和muc1-apt特异性结合，其作用力强于muc1-apt和cdna的结合，便导致复合物aunps@(muc1-apt)-hrp从磁珠表面脱离，进入上清液中。加入tmb显色液后，复合物中的hrp可催化h2o2氧化tmb，使溶液颜色从无色变成蓝色。以上原理示意图见图1。
19.在该方法中，使用muc1的核酸适配体替代抗体，确保了检测方法的特异性和稳定性。核酸适配体是一类通过指数富集进化技术(selex)筛选得到的序列，一般由十几到几十个核苷酸组成，可以是dna或rna。selex筛选是从10
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个不同寡核苷酸的随机序列库里，通过6～20轮的反复筛选，从而获得特异性识别与结合靶分子的核酸序列的过程。核酸适配体可以通过氢键、静电相互作用、范德华力或形状互补性与其靶标特异性结合，其功能类似于抗体，因此，核酸适配体被人们称为“化学抗体”。但与抗体相比，适配体具有低成本、可重复合成、易于修饰、长期稳定性、免疫原性低和结构转换能力等优势，已经被广泛用于各种生物传感器平台的研究。因此，引入能够特异性识别并结合muc1的适配体来代替抗体是检测方法的特异性和稳定性的保障，同时使方法具有了制备周期短、热稳定性更高、成本更低等优势。
20.在该方法中，应用的磁性纳米粒子不仅具有信号方法的效果，更关键的是其可以快速有效地将目标物从复杂的基质中分离出来，最大程度地减小基质效应。纳米金易于制备且具有大的比表面积，可携带更多hrp，从而更有效地放大信号，提高方法的灵敏度。
21.本发明的优点在于：1、本发明利用muc1特异性适配体作为识别元件，确保了检测方法的稳定性和选择性。
22.2、本发明引入磁珠和纳米金两种纳米材料放大信号，进一步提高了比色检测方法的灵敏度。
23.3、本发明实现对muc1的高特异性检测，操作简单，成本低廉。
24.4、该方法属于“signal-on”型检测方法，可减少“signal-off”型方法的“假阳性”结果影响。
附图说明
25.图1 基于磁珠和纳米金的比色适配体传感方法检测muc1的示意图。
26.图2 本发明方法对不同浓度muc1的比色检测结果。
27.图3 本发明方法检测不同浓度muc1时建立的标准工作曲线。
28.图4 本发明方法检测muc1的特异性验证。
具体实施方式
29.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
30.实施例1一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法，包括以下具体步骤：（1）合成纳米金颗粒（aunps）：所有玻璃器皿在王水（hcl:hno3=3:1）浸泡后用超纯水清洗，使用前烘干。取5 ml柠檬酸三钠（1wt%）放入棕色锥形瓶中，再加入90 ml超纯水，加热至沸腾，再向其中加入5 ml haucl4（0.2wt%），当颜色从淡黄色变成酒红色，冷却至室温，备用。
31.(2) 纳米金-黏蛋白1适配体-辣根过氧化物酶(aunps@(muc1-apt)-hrp)复合物制备：取30 μl 10 μm muc1适配体aptamer（muc1-apt），加还原剂tcep在室温下活化1 h，再加入600 μl 步骤（1）制备的aunps溶液，振荡孵育16 h (150 rpm)。50 μl 100 mm ph 7.4的pb缓冲液分五次（5 μl，5 μl，10 μl，10 μl，20 μl)加入，振荡孵育24 h后离心30 min(13500 rpm)，去除上清液。随后加入200 μl 10 mm ph 7.4 pbs缓冲液洗涤三次，再用200 μl ph 7.4的pbst缓冲液重悬。
32.（3）功能化磁珠的制备取5 μl 经50 μl w&b缓冲液清洗过3次的0.4 mg/ml的链霉亲和素化的磁珠（avidin-mbs，经50 μl w&b缓冲液清洗过3次）和100 nm的cdna探针混合于5 μlph 7.4的pbst缓冲液中，在25℃孵育30 min。加入50 μl 1 μm 9a在25℃孵育30 min进行封闭。加入预先在25℃反应好的1 μl 1 μm hrp、5 μl 100 nm muc1-apt、4 μl ph 7.4的 pbst混合液，在37℃孵育1 h，用200 μl ph 7.4的pbst清洗获得功能化磁珠，备用。
33.（4）黏蛋白1的比色检测将功能化好的磁珠加入pbst配制的不同浓度的muc1溶液，在37℃下孵育45 min。磁分离后在收集的上清液中加入tmb显色液，10 min后观察颜色，并在650 nm处检测吸光度。
34.上述步骤（2）中所述muc1适配体aptamer的核苷酸序列为：5
′‑
biotin-gcagttgatcctttggataccctgg-(ch2)
6-sh-3
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。
35.上述步骤（3）中所述cdna探针的核苷酸序列为：5
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ccagggtatccaattttt-biotin-3
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。
36.上述步骤（3）中所述9a的核苷酸序列为：5'-biotin-aaaaaaaaa-3'。
37.上述方法中：所述w&b缓冲液：用10 mm tris-hcl, 1 mm edta、2 m nacl (ph 7.5)制备；所述100 mm ph 7.4 pb缓冲液配方为：100 mm na2hpo4，100 mm nah2po4，3 m nacl，调节ph至 7.4。
38.所述ph7.4的pbs缓冲液配方为：137 mm nacl，10 mm na2hpo4，1.4 mm kh2po4，2.7 mm kcl，调节ph至 7.4。
39.所述10 μm muc1适配体aptamer用ph7.4的pbs缓冲液配制。
40.所述ph 7.4 pbst缓冲液配方为：由上述ph7.4的pbs缓冲液+0.05%(v/v)tween-20
制备。
41.实施例2实施例1步骤（4）中加入muc1溶液的浓度分别设置为：0 μg/ml，75 μg/ml，150 μg/ml，250 μg/ml，350 μg/ml，500 μg/ml，其余步骤同实施例1。实现对不同浓度黏蛋白1的比色检测。检测结果见图2。可以看出，随着黏蛋白1浓度的增大，溶液的蓝色也随之变深，吸光度值也逐渐变大。
42.通过分析在650 nm处的吸光度和muc1浓度的关系，建立标准曲线（图3），实现对黏蛋白1的定量检测。通过3σ/s计算本方法的检出限（lod）（其中σ表示空白待测液多次测得信号的标准偏差，s是拟合线性方程的斜率），得到本方法检测的理论检测限为41.95 μg/ml。
43.实施例3特异性验证实施例1步骤（3）中的muc1溶液替换为浓度皆为250 μg/ml的单独的人血清白蛋白（hsa）、癌胚抗原（cea）或者muc1和这两种蛋白的混合物，其余步骤同实施例1，黏蛋白1浓度为250 μg/ml，验证本发明方法的特异性。检测结果见图4。可以看出，当检测cea和hsa时，a
650
和空白值几乎相同，而含muc1、cea和hsa的混合溶液略低于纯muc1的检测值。结果表明，发明所建立的方法对muc1检测具有良好的特异性。
44.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法，其特征在于：连接有黏蛋白1适配体的互补cdna的磁珠与纳米金-黏蛋白1适配体-辣根过氧化物酶aunps@(muc1-apt)-hrp复合物结合；当存在muc1时，muc1和muc1-apt特异性结合作用力强于muc1-apt和cdna的结合，aunps@(muc1-apt)-hrp复合物从磁珠表面脱离进入上清液中，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺后，aunps@(muc1-apt)-hrp复合物中的hrp催化tmb产生显色反应，溶液从无色变为蓝色，从而实现对黏蛋白1的比色检测。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：包括以下具体步骤：（1）合成纳米金aunps：取5 ml1wt%柠檬酸三钠放入棕色锥形瓶中，再加入90 ml超纯水，加热至沸腾，再向其中加入5 ml 0.2wt%haucl4，当颜色从淡黄色变成酒红色，冷却至室温，备用；（2）纳米金-黏蛋白1适配体-辣根过氧化物酶aunps@(muc1-apt)-hrp复合物制备：取30 μl 10 μm muc1-apt，加还原剂tcep在室温下活化1 h，再加入600 μl aunps溶液，150 rpm振荡孵育16 h；50 μl 100 mm ph 7.4 的pb缓冲液分五次加入，振荡孵育24 h后13500 rpm离心30 min，去除上清液；随后加入200μl 10 mm ph7.4 的pbs缓冲液洗涤三次，用200 μl ph 7.4 的pbst缓冲液重悬；（3）功能化磁珠的制备：取5 μl 0.4 mg/ml链霉亲和素化的磁珠和100 nm黏蛋白1适配体的互补cdna混合于5 μl ph 7.4 的pbst中，在25℃孵育30 min，加入50 μl 1 μm 9a在25℃孵育30 min进行封闭，加入预先在25℃反应好的1 μl 1 μm hrp、5 μl 100 nm muc1-apt、4 μl ph 7.4 的pbst混合液，在37℃孵育1 h，用ph 7.4 的pbst清洗，获得功能化磁珠，备用；（4）黏蛋白1的比色检测将功能化好的磁珠加入ph 7.4 的pbst配制的muc1溶液，在37℃下孵育45 min，磁分离后在收集的上清液中加入tmb，10 min后观察颜色，并在650 nm处检测吸光度。3.根据权利要求2所述的一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法，其特征在于：步骤（2）中所述muc1适配体aptamer的核苷酸序列为：5
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biotin-gcagttgatcctttggataccctgg-(ch2)
6-sh-3
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。4.根据权利要求2所述的一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法，其特征在于：步骤（3）中所述cdna探针的核苷酸序列为：5
′‑
ccagggtatccaattttt-biotin-3
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，所述9a的核苷酸序列为：5'-biotin-aaaaaaaaa-3'。5.根据权利要求2所述的一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法，其特征在于：步骤（4）中所述muc1溶液的浓度为：75~500 μg/ml。6.如权利要求1所述的一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法在黏蛋白1检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于适配体的快速检测黏蛋白1的比色方法，属于分析化学和生物技术领域。该方法包括AuNPs@(MUC1-Apt)的制备、功能化磁珠的制备及比色检测黏蛋白1三个步骤。该方法通过生物素-链霉亲和素作用以及碱基互补配对原则，将HRP修饰的AuNPs-Apt偶联物连接至磁珠表面，当存在MUC1时，黏蛋白1与适配体之间特异性识别并结合，与cDNA之间形成竞争，导致纳米金偶联物AuNPs@(MUC1-Apt)-HRP从磁珠表面脱离，进入上清液。磁分离后，向清液中加入TMB，HRP催化TMB发生氧化，溶液颜色从无色变成蓝色，从而实现对黏蛋白1的比色检测。从而实现对黏蛋白1的比色检测。


技术研发人员：张红艳 叶思莹 陈淑萍
受保护的技术使用者：福建中医药大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/9