一种经改造的pT7TS质粒及其应用的制作方法

一种经改造的pt7ts质粒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种质粒载体的构建,具体涉及一种经改造的pt7ts质粒及其应用。


背景技术：

2.转录(transcription)是在rna聚合酶的催化下，遗传信息由dna复制到rna(尤其是mrna)的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是合成mrna以及非编码rna的途径。体外转录(in vitro transcription,ivt)是在体外的无细胞体系中，以dna为模板，利用rna聚合酶转录合成mrna，并后续为其添加5’帽子和3’poly a尾巴等修饰，以模拟体内mrna合成的过程。rna体外转录反应主要用于合成带标记或未标记的rna分子，所合成的rna分子可进行显微注射、体外翻译及转染实验等。
3.近年来，mrna药物，特别是mrna疫苗的研究取得重大的进展，这也得力于质粒载体的改进提高了体外转录mrna的稳定性。例如，pspjc-βglaczβgan和pt7tsβggfpβgan被分别构建，导致lacz基因和绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，gfp)基因两侧分别为5
’‑
非翻译区(untranslated region，utr)和3
’‑
非翻译区(from xenopus laevisβ-globin)(3.hoerr i，obst r，rammensee hg，jung g.in vivo application of rna leadsto induction of specific cytotoxic t lymphocytes and antibodies.eur jimmunol.2000；30(1)：1-70)。
4.原始的pt7ts载体带有非洲爪蟾的β珠蛋白utr，其体外转录产物需要经过额外的加poly a尾的步骤，且长度不确定和不均一，主要用于研究非洲爪蟾相关的实验。


技术实现要素：

5.基于此，有必要针对现有的技术问题，提供一种更通用的经改造的pt7ts质粒，其体外转录产物能够在人源和鼠源等更广泛的细胞中表达，无需额外加poly a尾，实现高效、稳定均一的体外转录。
6.本发明的一个方面，是提供一种经改造的pt7ts质粒，包括复制起点、5
’‑
ut、t7启动子、3
’‑
utr、poly a尾、抗性基因和荧光蛋白基因，t7启动子的起始核酸序列为ag，所述t7启动子的组成序列如seq id no.1所示；按照5’到3’方向，所述poly a尾依次由55-65个腺嘌呤、1-3个鸟嘌呤和55-65个腺嘌呤组成。
7.在其中一些实施例中，所述poly a尾依次由59-61个腺嘌呤、1-2个鸟嘌呤和59-61个腺嘌呤组成，更优选地，所述poly a尾依次由60个腺嘌呤、1个鸟嘌呤和60个腺嘌呤组成。
8.在其中一些实施例中，所述pt7ts质粒的5
’‑
utr包含β-珠蛋白基因(hbb)的5
’‑
utr或其同源物、片段或变体。
9.在其中一些实施例中，所述pt7ts质粒的3
’‑
utr包含选自如下基因串联而成的3
’‑
utr或其同源物、片段或变体：β-珠蛋白基因(hbb)和酶切氨基末端增强因子(aes)。
10.在其中一些实施例中，所述抗性基因为氨苄霉素抗性基因(ampr)。
11.在其中一些实施例中，所述荧光蛋白基因包括选自如下基因：增强绿色荧光蛋白基因(egfp)、荧光素酶基因(luciferase)。
12.在其中一些实施例中，所述pt7ts质粒还包括cap结合位点、lac启动子、lac操纵子、sp6启动子、限制性内切酶位点、m13引物。
13.在其中一些实施例中，所述限制性内切酶位点包括选自如下至少一种：hindⅲ、bglⅱ、ageⅰ、kpnⅰ、xhoⅰ、sacⅱ、speⅰ、notⅰ、bamhⅰ、xbaⅰ。
14.在其中一些优选的实施例中，所述5
’‑
utr的序列如seq id no.2所示。
15.在其中一些优选的实施例中，所述3
’‑
utr的序列如seq id no.3所示。
16.在其中一些优选的实施例中，所述pt7ts质粒的序列如seq id no.4所示。
17.本发明的第二个方面，是提供上述任一的pt7ts质粒在体外转录mrna、转染细胞中的应用。
18.本发明的第三个方面，是提供一种转录试剂盒，包括上述任一所述pt7ts质粒。
19.本发明通过对起始核酸序列和poly a尾的改造以及选择合适的t7启动子，得到一种更通用的经改造的pt7ts质粒，其能够无需额外加poly a尾，在人源和鼠源细胞中稳定高效表达，实现高效、稳定均一的体外转录。
附图说明
20.图1为本发明实施例1的质粒谱图。
21.图2为本发明实施例2中体外转录产物实时检测结果。
22.图3为本发明实施例3中poly a尾不同的质粒的转录翻译效率结果。
23.图4为本发明实施例4中加帽前后mrna转染效率结果。
24.图5为本发明实施例5中质粒转录后的mrna和过表达质粒的转染荧光结果。
25.图6为本发明实施例5中质粒转录后的mrna和过表达质粒的流式结果。
26.图7为本发明实施例5中质粒转录后的mrna和过表达质粒的平均荧光强度结果。
具体实施方式
27.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
28.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如green和sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(molecular cloning:a laboratory manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
29.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
30.复制起点(replicon)：由起始复制子(ori)及其调控元件组成。
31.本发明涉及到的序列包括如下：
32.seq id no.1:t7启动子
33.taatacgactcactataagg
34.seq id no.2:5
’‑
utr
35.acatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacacc
36.seq id no.3:3
’‑
utr
37.ctggtactgcatgcacgcaatgctagctgcccctttcccgtcctgggtagcccgagtctcccccgacctcgggtcccaggtatgctcccacctccacctgccccactcaccacctctgctagttccagacacctccgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaa
38.seq id no.4:质粒
39.agtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctctaatacgactcactataaggagacaagcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccagatctaccggtggtaccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaactcgagactagtctggtactgcatgcacgcaatgctagctgcccctttcccgtcctgggtagcccgagtctcccccgacctcgggtcccaggtatgctcccacctccacctgccccactcaccacctctgctagttccagacacctccgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagcggccgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggatcctctagaccgggcgagctcgaattcgtattctatagtgtcacctaaatccaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggc
attttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtc。
40.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
41.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，通过以下实施例，并结合附图，对本发明进行进一步详细说明。
42.实施例1——质粒的构建
43.1.全基因合成带特定酶切位点的utr序列，其中5
’‑
utr序列为β-珠蛋白基因(hbb)的5
’‑
utr，带有如下酶切位点：hindⅲ、bglⅱ、ageⅰ、kpnⅰ，序列如seq id no.2所示；3
’‑
utr序列为β-珠蛋白基因(hbb)和酶切氨基末端增强因子(aes)串联而成的3
’‑
utr，带有如下酶切位点：xhoⅰ、sacⅱ、speⅰ、notⅰ，序列如seq id no.3所示。通过酶切和连接的方式替换原始pt7ts载体的utr序列。
44.2.通过pcr的方式突变步骤1中得到的pt7ts载体的t7启动子序列，将起始核酸gg替换为ag，并测序确认，所述t7启动子序列如seq id no.1所示。
45.3.通过长链引物合成的方式得到带酶切位点和末端特定序列的poly a单链，其中酶切位点为：bamhⅰ、xbaⅰ。然后通过pcr的方式引入到步骤2得到的载体，测序确认polya尾的长度。
46.4.选取poly a尾长度合适且序列正确的克隆，插入egfp基因，测序确认序列和poly a尾长度。测序引物为通用引物m13f(5
’‑
gtaaaacgacggccagt-3’seq id no.5)，测序
方向为反向。按照5’到3’方向，所述质粒的poly a尾包括60个腺嘌呤、1个鸟嘌呤和60个腺嘌呤。
47.最终得到经改造的pt7ts质粒，命名为ivt-egfp质粒，其序列如seq id no.4所示，其质粒谱图如图1所示。
48.实施例2——稳定均一的体外转录产物
49.参考实施例1的质粒构建步骤，得到ivt-luciferase质粒，ivt-luciferase质粒和ivt-egfp质粒的区别仅在于：ivt-luciferase质粒的报告基因为luciferase。参考锐博生物的ribo
tm
t7 mrna转录试剂盒说明书，分别针对ivt-luciferase质粒、实施例1中得到的ivt-egfp质粒，加入各反应组分后充分混匀，分别在反应后的5分钟、1小时、2小时、3小时取样1微升，之后在反应后的4小时加入dna酶i处理并取样1微升。分别往样品中加入19微升超纯水和5微升5乘(5x)浓度的上样缓冲液混匀，65℃热处理3分钟后迅速置于冰上，可消除绝大部分mrna的二级结构。取样10微升进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时上样rna分子量标准来估计产物条带的大小。
50.实施例1得到的质粒经过bamhi线性化后，通过体外转录，可以得到产物均一的mrna。ivt-luciferase质粒体外转录得到luciferase mrna，经改造的pt7ts质粒体外转录得到egfp mrna。如图2所示，egfp mrna产物条带约为1200nt，而luciferase mrna产物条带约为2100nt。
51.实施例3——高效的翻译效率
52.参考实施例1的步骤，合成ivt-luciferase质粒和ivt-luciferase-polya
120
质粒，两者的报告基因均为luciferase；两者除了polya尾不同，其它部分均相同。ivt-luciferase质粒的polya尾为60个腺嘌呤、1个鸟嘌呤和60个腺嘌呤，ivt-luciferase-polya
120
质粒为120个腺嘌呤，对应的体外转录mrna产物分别命名为polya
60
ga
60
和polya
120
。
53.接下来利用上述mrna来测试不同polya尾的翻译效率差异。在96孔细胞培养板中，每孔接种25,000个hep3b细胞，过夜贴壁培养。第二天上午进行mrna的细胞转染实验，参考锐博生物的ribofect
tm
mrna转染试剂盒说明书进行操作，每孔转染50ngmrna，在转染后0小时、6小时、27小时和54小时使用promega公司的萤光素酶1000检测系统(luciferase 1000assay system)分别测定luciferase酶活，每组各有3个平行重复孔。如图3所示，两者对应的luciferase酶活在大约27小时均达到峰值，且polya
60
ga
60
相比polya
120
要高大约23％，该结果说明实施例1具有的polya
60
ga
60
尾相比传统的polya尾具有更高的翻译效率。
54.实施例4——加帽前后mrna的转染效率对比
55.参考实施例2的步骤，实施例1中所述的ivt-egfp质粒经过线性化、一般体外转录(ribo
tm
rnamax-t7体外转录试剂盒)，得到未加帽egfp mrna；而利用体外转录与加帽反应同时进行的试剂盒(ribo
tm
t7 mrna转录试剂盒)，一步得到加帽(cap1)egfp mrna。分别在24孔板中接种约30％密度左右的hep3b细胞，分别于37℃二氧化碳培养箱中贴壁6小时，分别于每孔转染500ng未加帽egfp mrna、加帽(cap1)egfp mrna(ribofect
tm
mrna转染试剂盒)，转染24小时后使用荧光显微镜分别观察在gfp荧光和bf正常光下的情况。如图4所示，在bf正常光下,未加帽egfp mrna和加帽(cap1)egfp mrna转染细胞的情况无明显差异；在gfp荧光下，经加帽(cap1)egfp mrna转染细胞明显比未加帽egfp mrna转染细胞的荧光更强。
56.实施例5——mrna和过表达质粒转染效率、表达效率
57.实施例1得到的所述ivt-egfp质粒，经体外转录得到egfp mrna。为了对比mrna表达与哺乳动物细胞过表达质粒的差异，我们利用invitrogen
tm
pcdna
tm
3.1
(+)
哺乳动物表达载体构建了egfp过表达质粒。分别在24孔板中接种50％～80％密度的hek293t、hep3b、mhcc97h细胞并贴壁6小时，然后每孔转染100ng egfp mrna(r ibofect
tm
mrna转染试剂盒)或者100ng egfp过表达质粒(赛默飞的lipofectamine 3000转染试剂)，转染24小时后使用荧光显微镜观察荧光。为了更加直观地对比两者的转染效率和表达效率，使用bd公司的流式分析仪检测上述细胞的egfp荧光阳性细胞数和荧光强度。如图5、7所示，在这3种细胞中，经egfp过表达质粒转染细胞均明显比egfp mrna转染细胞的荧光更强，经egfp mrna转染细胞的荧光强度更稳定；如图6所示，在这3种细胞中，egfp mrna的阳性率明显比egfp过表达质粒更高；综合可知，相比过表达质粒转染细胞，egfp mrna具有更快、更稳定的表达效率，以及更高的转染效率。转染egfp mrna后的细胞阳性率比质粒转染要高，但荧光强度较弱。
58.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种经改造的pt7ts质粒，包括复制起点、5
’‑
ut、t7启动子、3
’‑
utr、poly a尾、抗性基因和荧光蛋白基因，其特征在于，t7启动子的起始核酸序列为ag，所述t7启动子的组成序列如seq id no.1所示；按照5’到3’方向，所述poly a尾依次由55-65个腺嘌呤、1-3个鸟嘌呤和55-65个腺嘌呤组成。2.根据权利要求1所述的pt7ts质粒，其特征在于，所述poly a尾依次由59-61个腺嘌呤、1-2个鸟嘌呤和59-61个腺嘌呤组成，优选地，所述poly a尾依次由60个腺嘌呤、1个鸟嘌呤和60个腺嘌呤组成。3.根据权利要求1所述的pt7ts质粒，其特征在于，5
’‑
utr包含β-珠蛋白基因的5
’‑
utr或其同源物、片段或变体；和/或所述3
’‑
utr包含选自如下基因串联而成的3
’‑
utr或其同源物、片段或变体：β-珠蛋白基因和酶切氨基末端增强因子。4.根据权利要求3所述pt7ts质粒，其特征在于，所述5
’‑
utr的序列如seq id no.2所示。5.根据权利要求3所述pt7ts质粒，其特征在于，所述3
’‑
utr的序列如seq id no.3所示。6.根据权利要求1-5任一项所述的pt7ts质粒，其特征在于，所述抗性基因为氨苄霉素抗性基因。7.根据权利要求1-5任一项所述pt7ts质粒，其特征在于，所述荧光蛋白基因为增强绿色荧光蛋白基因或荧光素酶基因。8.根据权利要求1-5任一项所述pt7ts质粒，其特征在于，所述pt7ts质粒中还包括cap结合位点、lac启动子、lac操纵子、sp6启动子、限制性内切酶位点、m13引物。9.根据权利要求8所述pt7ts质粒，其特征在于，所述限制性内切酶位点选自如下至少一种：hindⅲ、bglⅱ、ageⅰ、kpnⅰ、xhoⅰ、sacⅱ、speⅰ、notⅰ、bamhⅰ、xbaⅰ。10.根据权利要求1所述pt7ts质粒，其特征在于，所述质粒的序列如seq id no.4所示。11.权利要求1-10任一所述的pt7ts质粒在体外转录mrna中的应用。12.权利要求1-10任一所述的pt7ts质粒在体外转染细胞中的应用。13.一种mrna转录试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-10任一所述pt7ts质粒。

技术总结
本发明涉及一种经改造的pT7TS质粒，包括复制起点、5


技术研发人员：姚译翔 张必良
受保护的技术使用者：广州市锐博生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/9