一种微针阵列及其应用

1.本发明涉及生物分析技术领域，具体涉及一种微针阵列及其应用。


背景技术：

2.近年来，单细胞rna测序(single cell rna sequencing,scrna-seq)技术的出现与发展，使得研究者能够对生物个体内不同细胞类型间的差异性基因表达进行发现和评估，在单细胞水平上揭示存在于生物组织内的转录组异质性，从而更深刻地理解生物个体的生长发育过程和疾病发生机制。然而scrna-seq通常需要将组织内细胞群体分离成单细胞悬液，导致对于理解细胞生长及其基因表达动力学至关重要的空间位置信息的丢失。在具有大量细胞群体的生物组织中，单个细胞具有的转录组及其功能不仅决定于其自身分化命运，还受到通过细胞通讯进行的细胞间相互作用及其所处结构微环境的强烈影响，因此单个细胞的空间位置信息具有重要意义。
3.空间转录组(spatially transcriptome，st)技术已被开发并广泛应用。在保持原始空间背景的同时对转录组进行定量分析，允许所得的基因表达特征与细胞形态学、生理学、空间定位和组织学相关联。研究者应用空间分辨转录组技术在空间维度上绘制基因表达图能够定位细胞或组织中的特定转录本，解析相邻细胞间产生的组合基因表达模式、组织微环境塑造细胞转录组异质性的过程，探索在组织的形态发生、维持稳态和再生过程中空间上紧密组织内的细胞行为。此外，对空间分辨转录组的研究可以揭示亚细胞rna分布模式，理解空间标记和空间调节的生物过程。
4.现有的空间转录组学方法无法对活细胞进行体内组织学研究。在固定样本中研究的只是特定时间的细胞状态的代表，观察到的基因表达谱可能只是表达异质性的产物。这些技术将细胞限制在单个时间点的活跃转录状态，而其他具有类似功能的细胞可能处于休眠状态。因此，他们在个体基因水平和时间尺度上正确推断细胞的能力仍然存在争议。一些研究小组试图在体外研究活细胞的转录组。例如，tiva开创了在活细胞中捕获mrna用于转录分析的先河，但该方法目前不适用于大量细胞的分析。matthew等人开发了一种名为“zipseq”的技术，用于使用光控制空间编码进行实时单细胞空间转录组学研究。该方法通过光笼式寡核苷酸和特定的图案照明在完整组织的活细胞上标记dna编码(zipcodes)，这增强了将多细胞系统中的空间异质性与细胞组的转录异质性联系起来的能力。然而，其低空间分辨率限制了zipseq的应用范围。同样，live-seq是第一次实现对活细胞中全基因表达的连续观察，但仍存在一些问题，如其不能提供活细胞的空间位置信息，且在体内不适用和多次采样的限制。
5.因此，如何推断未来或将过去的事件与当前的基因表达相关联，实现活体细胞或组织空间转录组学的探索，并在最小的细胞干扰下实时跟踪mrna动态，已成为未来的研究方向。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明的目的是提供了一种可用于空间组学分析的微针阵列及其应用。
7.技术方案：本发明的微针阵列，所述微针阵列包括含有探针的微针阵列，所述探针由5’端至3’端方向包括第一组探针和第二组探针，所述第一组探针中的每一个探针包括通用序列、第一空间编码序列和连接序列，所述第一组探针的核苷酸序列选自seq id no.1～seq id no.10的一种或多种；所述第二组探针中的每一个探针包括连接序列、第二空间编码序列、umi序列和捕获序列，所述第二组探针的核苷酸序列选自seq id no.11～seq id no.20的一种或多种。
8.进一步地，所述第一组探针和第二组探针通过linker连接，所述linker的核苷酸序列如seq id no.21所示。
9.进一步地，所述微针的间距为100-500μm，其底部半径或边长为150-300μm，微针高度为300-600μm。
10.进一步地，所述聚合物包括二甲基硅氧烷pdms、聚苯乙烯ps、聚丙烯酸paa、聚碳酸酯pc或聚甲基丙烯酸甲酯pmma。
11.进一步地，所述探针还包括多聚赖氨酸、氨基、生物素链霉亲和素中的一种或几种。
12.本发明的微针阵列在空间组学分析中的应用。
13.进一步地，将微针阵列与检测样本进行杂交捕获mrna，对已捕获组学信息的杂交链进行逆转录，使被捕获的mrna与探针形成cdna，随后对cdna进行扩增和文库构建；回收核酸序列，并对回收的核酸序列进行分析，根据核酸序列中的空间位置信息将被分析的检测样本的转录组学信息按位置信息对应于检测样本的空间位点上，从而得到检测样本的空间转录信息。
14.进一步地，所述检测样本可以选自植物、动物、真菌。
15.进一步地，所述逆转录中所用模板转换引物核苷酸序列如seq id no.22所示；所述cdna进行扩增的扩增引物核苷酸序列如seq id no.23所示；所述文库构建所用引物核苷酸序列如seq id no.24～25所示。
16.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供了一种微针阵列，结合微针阵列和修饰有空间定位信息的探针，可在不对细胞造成损伤的情况下，实现高通量空间转录组学分析，并能够对同一组织或细胞进行连续时间层面上的组学分析。本发明的微针阵列用于空间组学分析，可有效地降低制备捕获mrna探针所需的成本。
附图说明
17.图1是本发明微针阵列结构的示意图；
18.图2是本发明微针阵列表面修饰探针的流程示意图；
19.图3是本发明微针阵列原位捕获活体组织中mrna到体外扩增建库测序的示意图；
20.图4是cdna扩增产物质控；
21.图5是文库样本测序质量分布图；
22.图6是文库数据质量分析。
具体实施方式
23.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
24.实施例1含有交叉编码mrna捕获探针的微针阵列的制备
25.根据设计加工二氧化硅微针阵列，微针阵列十列十行共100根微针，微针底部直径75μm，高度150μm，微针间距300μm。探针序列根据illumina官方测序平台指南参考设计。
26.将二氧化硅微针阵列(图1)表面利用100℃加热的食人鱼溶液(浓硫酸：过氧化氢＝3:1)清洗干净，蒸馏水清洗两次，氮气干燥。用新鲜的含有2％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)的甲苯溶液室温下处理2h。然后用无水乙醇、去离子水依次冲洗。100℃下氮气干燥1h，2.5％戊二醛溶液孵育1h。
[0027]1×
pbs缓冲液彻底冲洗后，将含有平行排布的微流体通道与微针阵列对齐，在平行通道分别通入十种第一组探针溶液10μl(10μm)，第一组探针序列如表1所示，室温孵育3h后，揭开微流体通道，用0.1％和0.2％十二烷基硫酸钠(sds)分别冲洗一次。为了消除任何可能的非特异性结合来源，用含有新鲜nabh4的磷酸盐缓冲盐(pbs)溶液处理30min，双蒸水清洗三遍。将等体积(10μm)第二组探针b
x
分别与linker(10μm)在室温下孵育20min，第二组探针序列如表2所示。随后将含有垂直排布的微流体通道与微针阵列对齐，在垂直排布的微流体通道中分别通入十种第二组探针溶液与t4连接酶缓冲液混合体系(b
x
探针与linker混合溶液10μl，t4连接酶3μl，5
×
t4dna ligase buffer 10μl，rnase free water 27μl)，使每个第一组探针溶液分别与十种第二组探针溶液混合。室温孵育6h，使第一组探针和第二组探针在linker(5
’‑
cgaatgctctggcctctcaagcacgtggat-3’，seq id no.21)作用下结合并连接。用0.1％和0.2％十二烷基硫酸钠(sds)分别冲洗掉未结合的探针和反应体系，用无核酸酶水冲洗两次以去除sds，以产生携带空间坐标序列的捕获探针微针阵列，其有5’至3’端的构成为：通用序列、第一空间编码序列、连接序列、连接序列、第二空间编码序列、umi序列、捕获序列。流程如图2所示。
[0028]
表1：第一组探针序列信息
[0029][0030]
表2：第二组探针序列信息
[0031][0032][0033]
实施例2利用携带空间坐标序列的捕获探针微针阵列进行空间转录组学研究
[0034]
(1)mrna捕获
[0035]
本实验使用的小鼠是从上海南方模型生物技术有限公司购买的12周龄的c57bl/6j小鼠。小鼠被饲养于22℃，12小时光照/12小时黑暗环境中，并自由获取食物和水。将小鼠背部皮肤毛发剔除，露出小鼠表皮，将实施例1制备得到的微针阵列插入小鼠皮肤表面150μm，在室温下保持20分钟，小心拔出微针阵列，将微针阵列转移至超净工作台内进行下一步实验(过程如图3所示)。
[0036]
(2)逆转录及预扩增
[0037]
将微针阵列用1
×
pbs冲洗两遍，进行逆转录步骤(50μl反应体系：5
×
rt buffer10μl，100mm mgcl
2 4.5μl，rna酶抑制剂1.25μl，100mm dtt 1.25μl，dntp 5μl，5m甜菜碱10μl，逆转录酶2.5μl，模板转换引物tso 5μl，无核酸酶水10.5μl。模板转换引物tso序列如seq id no.22所示：5
’‑
tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagargrg+g-3’)，在42℃下孵育90min后移除液体。在微针阵列区域滴加koh溶液(100mm)，室温孵育3min后移除，并在微针阵列区域进行第二链合成反应(25μl反应体系：bst 3.0等温聚合酶1μl，10
×
buffer2.5μl，10mm dntp 3.5μl，100mm mgso4 1.5μl，引物1μl，加无核酸酶水至25μl，引物序列如seq id no.23所示：5
’‑
tcgtcggcagcgtcagatgtgtata-3’)，在65℃下孵育2h后移除反应液。在微针阵列区域滴加20μl koh溶液(100mm)，室温孵育3min后，将koh溶液转移至无核酸酶污染的离心管中，加入cdna扩增反应体系：25μl kapa pcr mix，1μl引物，4μl无核酸酶水，引物序列同seq id no.23)，充分混合后，进行聚合酶链式反应，条件设置：
[0038]
步骤1:98℃，2min；
[0039]
步骤2:98℃，10s；
[0040]
步骤3:67℃，15s；
[0041]
步骤4:72℃，6min；
[0042]
步骤5：转至步骤2，循环40次；
[0043]
步骤6:72℃，5min；
[0044]
步骤7：4℃，停止。产物用0.8x的ampure xp磁珠纯化，取20μl产物加无酶水30μl至总体积50μl，提前将dna磁珠在室温下平衡30min，然后加40μl磁珠，用移液枪吹打10次混匀，在室温下放置8min。将磁珠混合液放置磁力架上，放置5min至澄清。去除上清液，用200μl 80％的乙醇清洗2次，不吹打混匀，每次清洗30s。第二次弃乙醇后，吸干，静置2min使磁珠干燥。加入22μl的无酶水溶解，用移液枪吹打10次混匀，静置2min。放置磁力架上澄清，吸取20μl至新的pcr管。
[0045]
(3)文库构建
[0046]
得到的cdna转移至冰上，并利用tn5转座酶打断，取打断后的产物进行pcr扩增添加测序接头，illumina测序上引物序列如seq id no.24所示：5
’‑
aatgatacggcgaccaccgagatctacactatcctcttcgtcggcagcgtc-3’；illumina测序下引物序列如seq id no.25所示：5
’‑
caagcagaagacggcatacgagatctctctacgtctcgtgggctcgg-3’)，反应条件设置：
[0047]
步骤1：72℃，3min；
[0048]
步骤2：98℃，15s；
[0049]
步骤3：60℃，30s；
[0050]
步骤4：72℃，3min；
[0051]
步骤5：转至步骤2，循环18次；
[0052]
步骤6：72℃，5min；
[0053]
步骤7：4℃，停止。
[0054]
使用nanodrop测定cdna浓度，使用自动化电泳系统(安捷伦科技)测定cdna片段大小分布。cdna扩增产物浓度和纯化结果如图4所示，检测结果表明cdna长度分布在400bp左右，并且没有出现影响测序数据质量和降低数据产出的引物二聚体污染、大小片段污染以及峰图过宽等现象，符合illumina测序平台合格文库要求。
[0055]
(4)文库测序及数据分析
[0056]
为了反映测序过程中测序的准确性，以质量分数作为判断测序过程中碱基错误率的标准，将测序phred数值(phred score，qphred)通过公式转化得到：
[0057][0058]
其中e为碱基测序错误率，phred数值是在碱基识别过程中，通过预测碱基发生错误概率模型计算得到，质量值越大，错误率越小(表1)。illumina官方一般以q30≥80％作为评价标准,以clean reads的碱基位置作为横坐标，每个位置的平均测序质量值(q)作为纵坐标，得到样本测序质量分布图,平均q30为88.23％，因此测序结果具有很强可信度(图5)。
[0059]
表1测序质量分值与碱基检出精确度的关系
[0060][0061]
选用novaseq6000对核酸文库进行测序，对经测序的核酸文库进行序列分析，结合核酸分子标识符的空间坐标序列信息来对捕获的mrna信息进行空间定位，通过对靶基因进行匹配来确定目的基因在空间中特定位置的表达信息，通过对目的基因对应的分子标记进行计数来进行目的基因表达的计数定量，此方式可以减小目的基因扩增偏差产生的数据误差。
[0062]
首先使用fastqc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对测序数据进行质量评估，得到q30，碱基含量分布图。根据不同barcode对测序得到的“fq”文件进行拆分，利用picard tools(https://github.com/broadinstitute/picard)将拆分好的“fq”文件转化为按照queryname排列的“bam”文件。运行drop-seq tools(http://mccarrolllab.org/dropseq/)进行低质量reads滤除、sequence primer trimming等操作。最后使用star进行序列比对，选用ncbi genome reference consortium的grcm38(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc/mouse)作为参考基因组。
[0063]
测序结果表明可以在核酸文库分析结果中找到对应的核酸分子标识符信息，空间坐标序列及分子标签的序列信息正确，数据质量可以达到分析要求，碱基含量分布如图6所示，横轴为碱基长度分布，纵轴表示百分比，图中4条线分别代表a，c，t，g在每个位置上的平均含量。根据illumina测序平台合格文库要求，好的样本中前几个碱基可能会出现较大波动，这是由于随机引物扩增偏差原因造成的，随后四条线应该平行且接近。图6表明碱基分布平均，dna序列的质量和完整性符合要求，为后续的生物信息学分析奠定良好的基础。

技术特征：
1.一种微针阵列，其特征在于，所述微针阵列包括含有探针的微针阵列，所述探针由5’端至3’端方向包括第一组探针和第二组探针，所述第一组探针中的每一个探针包括通用序列、第一空间编码序列和连接序列，所述第一组探针的核苷酸序列选自seq id no.1～seq id no.10的一种或多种；所述第二组探针中的每一个探针包括连接序列、第二空间编码序列、umi序列和捕获序列，所述第二组探针的核苷酸序列选自seq id no.11～seq id no.20的一种或多种。2.根据权利要求1所述的微针阵列，其特征在于，所述第一组探针和第二组探针通过linker连接，所述linker的核苷酸序列如seq id no.21所示。3.根据权利要求1所述的微针阵列，其特征在于，所述微针的间距为100-500μm，其底部半径或边长为150-300μm，微针高度为300-600μm。4.根据权利要求1所述的微针阵列，其特征在于，所述微针阵列的的材料包括玻璃、硅、二氧化硅、金属或聚合物。5.根据权利要求4所述的微针阵列，其特征在于，所述聚合物包括二甲基硅氧烷pdms、聚苯乙烯ps、聚丙烯酸paa、聚碳酸酯pc或聚甲基丙烯酸甲酯pmma。6.根据权利要求1所述的微针阵列，其特征在于，所述探针还包括多聚赖氨酸、氨基或生物素链霉亲和素中的一种或几种。7.一种权利要求1-6任一项所述的微针阵列在空间组学分析中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下：将微针阵列与检测样本进行杂交捕获mrna，对已捕获组学信息的杂交链进行逆转录，使被捕获的mrna与探针形成cdna，随后对cdna进行扩增和文库构建；回收核酸序列，并对回收的核酸序列进行分析，根据核酸序列中的空间位置信息将被分析的检测样本的转录组学信息按位置信息对应于检测样本的空间位点上，从而得到检测样本的空间转录信息。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测样本可以选自植物、动物、真菌。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述逆转录中所用模板转换引物核苷酸序列如seq id no.22所示；所述cdna进行扩增的扩增引物核苷酸序列如seq id no.23所示；所述文库构建所用引物核苷酸序列如seq id no.24～25所示。

技术总结
本发明公开了一种微针阵列及其应用，所述微针阵列包括含有探针的微针阵列，所述探针由5’端至3’端方向包括第一组探针和第二组探针，所述第一组探针中的每一个探针包括通用序列、第一空间编码序列和连接序列，所述第一组探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10的一种或多种；所述第二组探针中的每一个探针包括连接序列、第二空间编码序列、UMI序列和捕获序列，所述第二组探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20的一种或多种。本发明的微针阵列，结合微针阵列和修饰有空间定位信息的探针，可在不对细胞造成损伤的情况下，实现高通量空间转录组学分析，并能够对同一组织或细胞进行连续时间层面上的组学分析。本发明的微针阵列用于空间组学分析，可有效地降低制备捕获mRNA探针所需的成本。备捕获mRNA探针所需的成本。备捕获mRNA探针所需的成本。


技术研发人员：赵祥伟 王文甲 党开同
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/9