花生非特异脂转移蛋白AhLTP1基因及其在提高耐盐性中的应用的制作方法

花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因及其在提高耐盐性中的应用
技术领域
1.本发明属于植物抗逆性技术领域，涉及到一种花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因及其在提高耐盐性中的应用。


背景技术：

2.花生是我国重要的油料作物、食品工业原料作物。食用油需求量以年均10％的幅度稳定增长。我国盐碱地面积高达9913万公顷，是重要的现实和潜在农业资源，但是保护性开发利用率较低。
3.盐碱地盐分较高、土壤瘠薄、水分匮乏，严重制约了绝大部分作物的种植。花生属豆科根瘤固氮作物，耐瘠抗旱、较耐盐碱，是目前盐碱地区较适宜种植的经济油料作物之一。但较高盐分也会影响花生产量和品质，据统计当盐分含量在0.32％、0.26％和0.22％时，减产幅度分别达到50％、25％和10％。因此培育耐盐花生品种是促进盐碱地花生产业可持续发展的关键。
4.通过抗逆育种和遗传转化技术来改良作物品种的抗逆性，是提高盐碱地区花生耐盐性的两大有效途径。但是，抗逆育种中传统常规杂交育种周期长，效率低，发展缓慢；而诱变育种虽然突变频率大幅提高，但是其有益突变频率极低，突变方向难以掌握，化学诱变剂毒性较大，具有残留效应。通过遗传转化改良作物品质具有定向高效性，但目前花生耐盐基因挖掘较少，转基因抗逆花生成果严重不足；因此，筛选花生耐盐基因、解析其抗逆分子机制、培育耐盐花生新品种，这对于合理利用盐碱地区温光资源尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因及其应用，该基因通过过表达可以使模式植物拟南芥萌发期和苗期出现耐盐表型，并且可进一步通过提高脯氨酸和可溶性糖含量以及降低na
+
含量，以有效缓解盐胁迫对植物造成的伤害，在提高植物耐盐性中具有潜在的应用价值。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因，其核酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明还提供了一种花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
8.本发明还提供了一种含有上述技术方案所述的花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因的载体。
9.本发明还提供了一种花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因在提高植物耐盐性中的应用，以花生种子的cdna为模板，利用上游引物seq id no.3和下游引物seq id no.4进行pcr扩增获得目的片段，构建ahltp1基因的过表达载体，用于拟南芥遗传转化，分析并鉴定转基因拟南芥的耐盐性；
10.所述ahltp1基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
11.作为优选，pcr扩增体系为：
[0012]2×
phanta max buffer 25μl，10mm dntp mix 1μl，上游引物、下游引物各2μl，phanta max super-fidelity dnapolymerase 1μl，cdna模板1μl，水补齐至50μl。
[0013]
作为优选，pcr扩增引物的反应条件为：
[0014]
95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延伸5min。
[0015]
本发明还提供了一种提高植物耐盐性的方法，将seq id no:1所示的核苷酸序列通过转基因手段导入植物细胞中，并使其表达，以提高植物的耐盐性。
[0016]
本发明还提供了一种提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖的含量以缓解盐胁迫对植物造成的伤害的方法，将seq id no:1所示的核苷酸序列通过转基因手段导入植物细胞中，并使其表达，以增强植物的耐盐性。
[0017]
本发明还提供了一种减少植物中na
+
含量以缓解盐胁迫对植物造成的伤害的方法，将seq id no:1所示的核苷酸序列通过转基因手段导入植物细胞中，并使其表达，以增强植物的耐盐性。
[0018]
作为优选，所述植物为花生。
[0019]
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
[0020]
1、本发明将花生ahltp1基因全长cdna连接到过表达载体启动的表达载体上，采用农杆菌介导的花絮浸染法转化拟南芥，发现该基因过表达可以使模式植物拟南芥萌发期和苗期出现耐盐表型，具体表现为萌发出苗更快，发芽率更高；幼苗根长更长，更耐盐。
[0021]
2、本发明提供的ahltp1转基因拟南芥的脯氨酸和可溶性糖含量在盐胁迫下迅速升高，拟南芥根中na
+
降低，可有效缓解盐胁迫对植物造成的伤害。进一步转化花生愈伤，可以提高花生愈伤耐盐性，具体表现为盐胁迫下愈伤生物量更大，生长更快。因此，花生ahltp1基因在提高植物耐盐性中具有潜在的应用价值。
附图说明
[0022]
图1为本发明实施例提供的ahltp1与其他物种ltp蛋白序列的同源比对分析，其中(a)ahltp1(arahy.px59sb)与拟南芥atltp1(at2g38540)、油菜bnltp(adp37976.1)、大豆gmltp(kag5069305.1)、向日葵hnltp(xp_022002420.1)和小麦taltp(abf14723.1)氨基酸序列同源性比较，相同的氨基酸序列用深蓝色表示，保守的五肽结构域用红框表示，保守的半胱氨酸用星号标出；(b)ahltp1保守半胱氨形成分子内二硫键预测；
[0023]
图2为本发明实施例提供的克隆得到的目的基因ahltp1的电泳图；
[0024]
图3为本发明实施例提供的ahltp1-pmd19-t simple载体的酶切结果图；
[0025]
图4为本发明实施例提供的目的基因连到pbi121表达载体ahltp1-pbi121的质粒酶切结果图；
[0026]
图5为本发明实施例提供的rt-pcr鉴定转基因拟南芥株系阳性苗中ahltp1表达量，其中1号泳道为野生型wt，其余泳道为转基因株系；
[0027]
图6为本发明实施例提供的不同拟南芥株系萌发期耐盐性结果，其中a：不同拟南芥株系在不同浓度nacl培养皿上横培生长图；b：a图发芽率的统计；
[0028]
图7为本发明实施例提供的不同拟南芥株系幼苗期耐盐性结果，a：不同拟南芥株系在不同浓度nacl培养皿上竖培生长图；b：a图根长的统计；
[0029]
图8为本发明实施例提供的盐胁迫或正常条件下不同拟南芥株系中脯氨酸和可溶性糖含量图；
[0030]
图9为本发明实施例提供的盐胁迫或正常条件下不同拟南芥株系中na
+
含量图，其中a：盐胁迫或正常条件下不同拟南芥株系na
+
探针染色分析；b：na
+
含量统计；
[0031]
图10为本发明实施例提供的盐胁迫或正常条件下不同花生愈伤生长情况和生物量统计，其中a：不同转基因花生愈伤在不同浓度nacl培养皿上横培生长图；b：a图生物量的统计。
具体实施方式
[0032]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033]
实验材料
[0034]
pmd19-t simple克隆载体：购买自takara t-vector pmd19(simple)；code no.3271；
[0035]
大肠杆菌dh5α菌株：购买自索莱宝solarbio；code no.c1100；
[0036]
带有35s的pbi121空载体：购买自懋康mkbio；code no.mf3721-5ug；
[0037]
农杆菌gv3101：购买自维地生物weidibio；code no.ac1001。
[0038]
以下实施例中采用农杆菌介导的花絮浸染法将表达载体导入到模式植物拟南芥中；在实际应用中，导入方法还可以采用其他方法例如农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。
[0039]
以下实施例中花生rna的提取和纯化可采用康为世纪rnapure植物rna提取试剂盒(cw0559)提取，也可直接用trizol法提取；cdna第一链的合成采用天根fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂(kr118)，也可以采用现有的工艺或者其他试剂盒。但是上述两者均优选采用本发明所记载的具体方法。
[0040]
实施例1花生ahltp1基因的克隆
[0041]
花生ahltp1基因(arachis hypogaea non-specific lipid transfer protein 1)，其cds序列(5
’→3’
)为363bp(序列如seq id no.1所示)，编码120个氨基酸的小蛋白(序列如seq id no.2所示)。经qpcr检测分析，ahltp1基因受盐胁迫显著诱导，随机选择5个耐盐品种和5个敏感花生品种检测ahltp1基因表达量，盐胁迫下其在耐盐品种中表达量显著高于盐敏感品种，表明其表达量与花生的耐盐能力密切相关(图1a,b)。
[0042]
选择不同物种的非特异脂转移蛋白包括拟南芥(atltp1)、大豆(gmltp)、油菜(bnltp)、向日葵(hnltp)和小麦(taltp)，对其氨基酸序列进行blast比对分析显示，ahltp1与其他物种ltps均含有保守的五肽结构域(t/s-x-x-d-r/k和p-y-x-i-s)(框内)，这两个结构域对脂质物质的结合与催化具有重要的作用。ahltp1缺乏色氨酸，含有8个位置保守的半胱氨酸可形成分子内二硫键，其分布为(c31-c78,c41-c55,c56-c101,c76-c115)(图1c,d)。
[0043]
1.1花生ahltp1基因克隆方法
[0044]
(1)提取花生总rna
[0045]
使用康为世纪rnapure植物rna提取试剂盒(cw0559)提取花生的总rna，具体步骤如下：
[0046]
1)花生种子tifrunner萌发5d，转移至hogland液体培养基中继续培养10d，取材后液氮中充分研磨成粉末，取0.1g于rnase-free离心管中，加入500μl rl(需提前加入β-巯基乙醇)，漩涡振荡混匀，室温放置1-3min；
[0047]
2)12,000rpm离心2min，将收集管中的上清液转移到一个新的离心管中；
[0048]
3)加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀；
[0049]
4)将上步得到的溶液转移到已装入收集管的吸附柱中，12,000rpm离心15sec，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0050]
5)向吸附柱中加入350μl buffer rw1，12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0051]
6)向吸附柱中直接加入80μl dnase i混合液，20-30℃孵育15min；
[0052]
7)向吸附柱中加入350μl buffer rw1，12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0053]
8)向吸附柱中加入500μl buffer rw2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12,000rpm离心15sec，弃废液；
[0054]
9)重复步骤8；
[0055]
10)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心1min，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。
[0056]
(2)将提取的花生总rna反转录成cdna
[0057]
使用天根fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂(kr118)进行反转录：
[0058]
取1μg总rna，加入5
×
fastking-rt supermix 4μl，补水到20μl，42℃反应15min，95℃失活3min，获得cdna。
[0059]
(3)花生ahltp1基因的克隆
[0060]
以上述制备的花生cdna作为模板，采用如下引物对用于pcr扩增花生ahltp1基因。
[0061]
克隆ahltp1基因的引物对序列：
[0062]
上游引物5
’‑‑3’
ggatccatggccagcatcaaggacaagg(seq id no.3)；
[0063]
下游引物5
’‑‑3’
gtcgacgaacttgatggtggcgcagttgg(seq id no.4)；
[0064]
其中下划线处为酶切位点，上游引物的酶切位点为bamhi，下游引物的酶切位点为sali。
[0065]
使用诺唯赞max super-fidelity dnapolymerase高保真酶进行扩增，50μl反应体系为：2
×
phanta max buffer 25μl，dntp mix(10mm)1μl，上下游引物各2μl，phanta max super-fidelity dnapolymerase 1μl，cdna模板1μl，水补齐到50μl。
[0066]
反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸90sec，共35个循环；72℃后延伸5min。
[0067]
反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，切取目的条带胶条并进行胶回收，
胶回收方法根据天根公司的普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(dp209)进行。
[0068]
加尾反应体系如下：10
×
反应缓冲液2μl，dntp 1.5μl，taq酶0.2μl，胶回收产物补齐到20μl。72℃反应30min。
[0069]
克隆载体连接：取4μl加尾产物与pmd19-t simple克隆载体，16℃过夜ta连接，热激法转化大肠杆菌dh5α菌株，振荡培养离心弃上清，涂在含有氨苄霉素的lb平板上生长过夜。挑取白色单菌落到含有氨苄霉素的lb培养液，37℃培养4-6h后进行菌液pcr，选取阳性单菌落在含有氨苄霉素的lb培养液中200rpm过夜振荡培养。
[0070]
质粒dna的提取：使用天根质粒小提试剂盒(dp103)提取上述阳性菌的质粒dna，由生工生物工程(上海)股份有限公司限公司完成测序，保留测序正确的质粒命名为ahltp1-pmd19-t simple，待用。
[0071]
实施例2含有花生ahltp1基因的过表达载体
[0072]
含有花生ahltp1基因的过表达载体的构建：
[0073]
用bamhi和sali酶切ahltp1-pmd19-t simple和带有35s的pbi121空载体，37℃酶切一个小时，1％琼脂糖凝胶电泳，切除正确的条带进行胶回收，其中正确的ahltp1-pmd19-t simple的酶切结果如图3所示。利用thermo公司的t4 dna连接酶将酶切后获得的目的片段与酶切后的pbi121载体过夜连接，连接产物转化dh5α菌株，在含有卡那霉素的lb平板上生长过夜。挑取白色单个菌落到lb培养液，37℃培养4-6h后进行菌液pcr，选取阳性菌落在含有卡那霉素的lb液体培养基中过夜。质粒dna的提取：使用天根质粒小提试剂盒(dp103)提取质粒dna，bamhi和sali酶切鉴定，如图4所示。构建得到35s::ahltp1的过表达载体。
[0074]
以上是以pbi121空载体为例进行说明，也可以根据转化目标的类型选择其他合适的表达载体。
[0075]
实施例3过表达ahltp1的转基因拟南芥的获得
[0076]
将实施例2构建的35s::ahltp1过表达载体转化拟南芥的方法，步骤如下：
[0077]
(1)含有35s::ahltp1的农杆菌的获得：
[0078]
1)农杆菌(gv3101)感受态细胞置于冰上融化，加入3μl 35s::ahltp1质粒，然后冰浴30min，液氮冷冻1min，37℃水浴5min；
[0079]
2)加入1ml yep培养基，28℃下200rpm振荡培养至对数生长期；
[0080]
3)8000rpm离心2min，离心弃上清，取沉淀涂布于含卡那霉素和利福平的yep平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天；
[0081]
4)挑取单个菌落到yep培养液，28℃培养4-6h后进行菌液pcr，选取阳性菌落3-4个，在含有那霉素和利福平的yep培养液中，过夜振荡培养。获得含有35s::ahltp1农杆菌菌液。
[0082]
(2)农杆菌介导的花絮浸染法转化拟南芥
[0083]
拟南芥花序浸染液配方(5ml体系)
[0084]
蔗糖0.25g silwet(有毒，避光)1.5ul ddh2o定容至5ml；
[0085]
侵染步骤：
[0086]
1)吸取100ul 35s::ahltp1农杆菌菌液，加50ml左右含有那霉素和利福平的yep培养液，过夜培养；
[0087]
2)上午9-10点左右将待侵染的拟南芥苗子浇足水；
[0088]
3)室温条件下，5000rpm，离心5min，弃上清，用8-10ml浸染液重悬菌体；
[0089]
4)拟南芥开花时间一般在11-13点，中午前后将已经开了的花浸入浸染液中6-7秒，间隔5-7d后可二次侵染以提高侵染效率；
[0090]
5)暗处理，潮湿包裹24小时后取出，正常培养。
[0091]
(3)过表达ahltp1转基因拟南芥阳性苗的筛选
[0092]
1)侵染后的拟南芥成熟后单株收获的种子为t0代；
[0093]
2)t0代种子在含有卡那霉素的培养基上培养10d，挑选绿苗种在基质中，单株收获的种子为t1代；
[0094]
3)t1代种子在含有卡那霉素的培养基上培养10d，挑选绿苗：黄苗约为3：1的株系中的绿苗种在基质中，单株收获的种子为t2代；
[0095]
4)t2代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选全部是绿苗的株系种在基质中，收到的种子即为纯合的转基因株系35s::ahltp1的种子。提取转基因株系的rna，用rt-pcr检测转基因株系ahltp1表达量，结果如图5所示，共获得6个35s::ahltp1过表达转基因株系，选取ahltp1表达量不同的转基因株系oe1、oe2和oe3用于后续研究。
[0096]
实施例4ahltp1基因在提高拟南芥耐盐性中的应用
[0097]
(1)ahltp1基因在提高拟南芥萌发期耐盐性中的应用
[0098]
以实施例3获得的转基因拟南芥阳性株系oe1、oe2和oe3作为试验材料，并以野生型拟南芥作为对照(wt)。拟南芥种子用70％乙醇消毒5min，离心弃上清，然后用2.6％的次氯酸钠消毒10min，离心弃上清，最后用无菌ddh2o冲洗5-6次，离心弃上清，将消毒的无菌种子整齐的点铺在含有不同浓度nacl的1/2ms固体培养基上。4℃避光处理3天，放置于25℃长日照培养箱生长10d，每隔12h数一次萌发。种子露白视为萌发，统计拟南芥种子发芽率，3次生物学重复。
[0099]
试验结果如图6所示，图6中a指的是不同拟南芥株系的种子在含不同浓度nacl的1/2ms固体培养基上的萌发情况；图6中b-e分别指的是不同拟南芥株系的种子在含不同浓度nacl的1/2ms固体培养基上随时间变化的萌发情况。图6中a、b均可说明转基因拟南芥阳性植株在萌发期具有耐盐的表型，并且ahltp1表达量越高，转基因株系的耐盐能力越强。在1/2ms培养基中转基因拟南芥种子与对照萌发率并没有表现出差异，而在较高浓度nacl的培养基上生长时，差异显著：其中150mm nacl条件下，wt萌发率为90.10％左右，oe1、oe2和oe3萌发率分别能达到100.00％、98.03％和93.43％；200mm nacl条件下，wt萌发率为75.77％左右，oe1、oe2和oe3萌发率分别能达到89.17％、86.70％和78.20％。oe1、oe2两个转基因阳性株系的种子萌发率要明显高于对照，分别提高萌发率17.68％和14.42％，oe3的耐盐能力低于oe1和oe2，与wt差异较小，这是由于其中ahltp1表达量低于oe1、oe2。综上表明，ahltp1可以提高盐胁迫下拟南芥种子的发芽率，并且提高程度与ahltp1的表达量密切相关。
[0100]
(2)ahltp1基因在提高拟南芥幼苗期耐盐性中的应用
[0101]
以实施例3获得的转基因拟南芥阳性株系oe1、oe2和oe3作为试验材料，并以野生型拟南芥作为对照(wt)。拟南芥种子用70％乙醇和2.6％次氯酸钠消毒后，整齐的点铺在含有150mm nacl的1/2ms固体培养基上。4℃避光处理3d，放置于25℃的长日照培养箱竖立培养10d，统计不同培养皿上拟南芥株系的根长。所有试验进行3次生物学重复。
[0102]
表1
[0103][0104]
试验结果如图7和表1所示，图7中a指的是不同拟南芥株系的幼苗在含不同浓度nacl的1/2ms固体培养基上的表型图；b指的是不同拟南芥株系的幼苗在含不同浓度nacl的1/2ms固体培养基上的根长长度。由图7中a、b和表1可以看出：在1/2ms培养基中转基因拟南芥种子与对照长势基本一致，而在150mm nacl条件下，oe1和oe2的根长高于对照38.83％和28.38％，转基因株系oe3仅提高9.49％，耐盐能力低于oe1和oe2。以上结果说明转ahltp1基因可以提高拟南芥幼苗期耐盐性。
[0105]
(3)盐胁迫对转基因拟南芥株系中脯氨酸和可溶性糖的影响
[0106]
以实施例3获得的转基因拟南芥阳性株系oe1、oe2和oe3作为试验材料，并以野生型拟南芥作为对照(wt)。将拟南芥种子用70％乙醇和次氯酸钠消毒后，均匀撒在含有不同浓度nacl的1/2ms固体培养基上。4℃避光处理3d，放置于25℃的长日照培养箱竖立培养10d，取材用于脯氨酸和可溶性糖含量测定。
[0107]
脯氨酸含量测定方法为：
[0108]
1)配置不同浓度的脯氨酸标准液，沸水浴30min，取出冷却至室温，加入甲苯混匀后萃取红色物质，测其在520nm的od值，绘制标准曲线；
[0109]
2)取不同处理培养皿上拟南芥幼苗各0.1g于研钵中，加入3％的磺基水杨酸充分研磨成匀浆，转入带塞试管中；
[0110]
3)将试管放入沸水浴中反应15min，过滤；
[0111]
4)分别取出过滤液2ml转入带塞试管中，依次加入2ml蒸馏水，4ml酸性茚三酮以及2ml冰醋酸，混合摇匀，然后沸水浴2h；
[0112]
5)2h后取出滤液，冷却至室温，分别加入4ml甲苯，摇匀萃取；
[0113]
6)静置10min后，吸取上清液，在520nm处测定吸光度值。
[0114]
可溶性糖含量测定方法为：
[0115]
使用苏州科铭生物技术有限公司的可溶性糖测定试剂盒(kt-1-y)测定拟南芥可溶性糖含量。
[0116]
表2
[0117]
[0118][0119]
试验结果如图8和表2所示，图8中a、b和表2均可说明盐胁迫下转基因阳性拟南芥植株中脯氨酸和可溶性糖迅速积累，显著高于对照，转基因株系oe1、oe2较oe3差异更显著，这说明转基因拟南芥是通过提高脯氨酸和可溶性糖的含量来缓解盐胁迫、渗透胁迫对植物造成的伤害，增强植物耐盐性。
[0120]
(4)盐胁迫对转基因拟南芥株系中na
+
含量的影响
[0121]
以实施例3获得的转基因拟南芥阳性株系oe1、oe2和oe3作为试验材料，并以野生型拟南芥作为对照(wt)。将拟南芥种子用70％乙醇和次氯酸钠消毒后，均匀撒在含有不同浓度nacl的1/2ms固体培养基上。4℃避光处理3d，放置于25℃的长日照培养箱竖立培养10d。将处理好的苗子先用ddh2o冲洗干净，以除去植株表面可能黏附的离子，然后将苗子放入含有coronagreen dye(包含na+green dye 50μg，dmso 1μl，ms液体培养基1ml，表面活性剂1μl)的1.5ml离心管中，使拟南芥根完全没入染色液中。以小于-200mbar的压力短暂抽真空，并缓慢释放，重复3-5次。避光37℃染色处理1-3h。制备片子，用双光子共聚焦显微镜观察植株染色情况(488nm激发光)。
[0122]
试验结果如图9所示，图9中a、b均可说明在1/2ms培养基中转基因拟南芥种子与对照na+含量差异不大，但盐胁迫促进根系na
+
积累，阳性拟南芥根系中na
+
积累量显著低于对照，转基因株系oe1、oe2较oe3差异更显著，这说明转基因拟南芥是通过减少na
+
积累来缓解盐胁迫对植物造成的伤害，增强植物耐盐性。
[0123]
实施例5ahltp1基因在提高花生愈伤耐盐性中的应用
[0124]
(1)花生愈伤转化方法
[0125]
1)将花生种子经灭菌后培养于ms培养液上，浸泡过夜(16-18h)；
[0126]
2)将浸泡过的花生胚放到灭菌滤纸上，用手术刀从花生胚基部切取花生胚小叶(从胚小叶2/3的部位切下，保证每个胚小叶是分散的)，然后接种到诱导培养基上(ms+4.5ml/l 6-ba+1.4ml/l naa)，25℃培养室培养4d；
[0127]
3)吸取100ul 35s::ahltp1农杆菌菌液，加50ml左右含有那霉素和利福平的yep培养液，过夜培养，4℃6000rpm离心10min，弃上清，用ms培养液悬浮菌液至od＝0.8；
[0128]
4)共培养：将预培养4d的外植体放在悬浮的农杆菌菌液中振荡侵染15min，无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，转接到诱导培养基上，暗培养4d；
[0129]
5)将外植体转接于含500mg/l利福平的诱导培养基中，25℃培养28d，筛选转基因愈伤；
[0130]
6)将相同重量的转基因愈伤和非转基因愈伤转移至含有不同浓度nacl的ms固体培养基上生长10d，观察愈伤生长状况。
[0131]
表3
[0132][0133]
试验结果如图10和表3所示，图10中a、b均可说明在ms培养基中转基因花生与对照愈伤生物量差异不大，但盐胁迫抑制花生愈伤的生长，阳性转基因花生愈伤生长速度快于对照，生物量也显著高于对照，oe1、oe2和oe3的生物量分别高于对照48.23％、27.01％和19.94％(150mm nacl)，75.93％、50.17％和8.81％(200mm nacl)。这说明花生非特异脂转移蛋白ahltp1能增强花生愈伤耐盐性，提高盐胁迫下花生愈伤的生长速度。

技术特征：
1.花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因，其特征在于，其核酸序列如seq id no:1所示。2.花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:2所示。3.含有权利要求1所述的花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因的载体。4.花生非特异脂转移蛋白ahltp1基因在提高植物耐盐性中的应用，其特征在于，以花生种子的cdna为模板，利用上游引物seq id no.3和下游引物seq id no.4进行pcr扩增获得目的片段，构建ahltp1基因的过表达载体，用于拟南芥遗传转化，分析并鉴定转基因拟南芥的耐盐性；所述ahltp1基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，pcr扩增体系为：2
×
phanta max buffer 25μl，10mm dntp mix 1μl，上游引物、下游引物各2μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl，cdna模板1μl，水补齐至50μl。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，pcr扩增引物的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延伸5min。7.一种提高植物耐盐性的方法，其特征在于，将seq id no:1所示的核苷酸序列通过转基因手段导入植物细胞中，并使其表达，以提高植物的耐盐性。8.一种提高植物中脯氨酸和/或可溶性糖的含量以缓解盐胁迫对植物造成的伤害的方法，其特征在于，将seq id no:1所示的核苷酸序列通过转基因手段导入植物细胞中，并使其表达，以增强植物的耐盐性。9.一种减少植物中na
+
含量以缓解盐胁迫对植物造成的伤害的方法，其特征在于，将seq id no:1所示的核苷酸序列通过转基因手段导入植物细胞中，并使其表达，以增强植物的耐盐性。10.根据权利要求7、8或9所述的方法，其特征在于，所述植物为花生。

技术总结
本发明提供了一种花生非特异脂转移蛋白AhLTP1基因及其在提高耐盐性中的应用，属于植物抗逆性技术领域。本发明提供的花生非特异脂转移蛋白AhLTP1基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因通过过表达可以使模式植物拟南芥萌发期和苗期出现耐盐表型，并且可进一步通过提高脯氨酸和可溶性糖含量以及降低Na


技术研发人员：徐扬 张智猛 丁红 戴良香 张冠初 郭庆
受保护的技术使用者：山东省花生研究所
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/9