一种MICP菌制剂及在混凝土修复中的应用

一种micp菌制剂及在混凝土修复中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种micp菌制剂及在混凝土修复中的应用。


背景技术：

2.微生物诱导碳酸钙沉淀(microbial induced carbonate precipitation，micp)技术是一种新型的多学科交叉环保技术。micp技术的原理为：微生物分泌脲酶从而分解尿素，生成nh
4+
和co
32-，从而提高环境的ph值，在金属离子存在条件下促进金属离子与co
32-结合生成碳酸盐沉淀。该技术特点为反应迅速、反应可控、能够适应复杂环境、作用持久，具有施工方便、操作简单、成本低廉、无二次污染等优点。
3.目前，micp技术主要应用于重金属的原位固定，沙化地土壤及地基的固化，混凝土裂缝修复及自修复，建筑工地抑尘等。但该技术在应用中难免会遇到低温环境，尤其是在裂缝修复、抑尘和沙化固定等需要在外界环境中运用时，在低温条件下快速生成生物胶结显得尤为重要。然而，低温条件下大多数微生物生长缓慢，酶活性受到抑制，从而导致运行周期延长、成本增加、应用效果差甚至无法应用等缺陷，限制了micp技术的推广。
4.现有技术对低温条件下应用micp的相关报道较少，如果能提供耐受低温、高ph、低营养物质等恶劣条件的产脲酶菌株，则有望解决这一问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种micp菌制剂及在混凝土修复中的应用。
6.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种菌制剂，所述菌制剂包括硫磺色类谷氨酸杆菌(paeniglutamicibacter sulfureus)cl-1，及供所述硫磺色类谷氨酸杆菌生存、生长的营养物质；所述硫磺色类谷氨酸杆菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no.62360。
7.相应的，所述菌制剂在诱导碳酸钙沉淀技术中的应用。
8.相应的，所述菌制剂在重金属的原位固定、沙化地土壤及地基固化、混凝土裂缝修复中的应用。
9.优选的，所述应用方法包括如下步骤：
10.将所述硫磺色类谷氨酸杆菌活化后，接种到含有钙离子和供所述硫磺色类谷氨酸杆菌生存、生长的营养物质的培养基中发酵培养，获得所述菌制剂；
11.将所述菌制剂滴加到待诱导碳酸钙沉淀位置。
12.优选的，所述硫磺色类谷氨酸杆菌发酵培养至菌液浓度达到107～108cfu/ml，获得所述菌制剂。
13.优选的，所述钙离子来源为醋酸钙或氯化钙中的任意一种或两种组合。
14.优选的，所述钙离子浓度为0.2～0.8mol/l。
15.优选的，所述应用的温度为10～30℃。
16.优选的，所述应用的ph为4～13。
17.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的可在低温、广泛ph范围内实现碳酸钙诱导的菌制剂。所述菌制剂中主要包括一株新的硫磺色类谷氨酸杆菌，该菌株具有能够在低温条件下快速生长、脲酶活性高、耐受ph环境广泛等特点，应用潜力大。实验显示：该菌株诱导产生碳酸钙沉淀效果好，在10℃下对ca
2+
的综合利用率可达到97％以上。
附图说明
18.图1为cl-1菌落形态示意图；
19.图2为cl-1电镜扫描图；
20.图3为不同温度下cl-1的生长曲线示意图；
21.图4为不同温度下cl-1产脲酶的活性示意图；
22.图5为不同ph条件下cl-1的生长曲线示意图；
23.图6为不同ph下cl-1产脲酶的活性示意图；
24.图7为以0.2m醋酸钙为钙源下生成的沉淀的晶型示意图；
25.图8为以0.4m醋酸钙为钙源下生成的沉淀的晶型示意图；
26.图9为以0.6m醋酸钙为钙源下生成的沉淀的晶型示意图；
27.图10为不同ca
2+
来源对cl-1利用ca
2+
的利用率影响示意图；
28.图11为不同ca
2+
来源对cl-1利用ca
2+
生成产物影响示意图；
29.图12为cl-1以醋酸钙为钙源24h生成产物电镜扫描图；
30.图13为cl-1以醋酸钙为钙源48h生成产物电镜扫描图；
31.图14为cl-1以醋酸钙为钙源72h生成产物电镜扫描图；
32.图15为cl-1以醋酸钙为钙源96h生成产物电镜扫描图；
33.图16为cl-1以醋酸钙为钙源120h生成产物电镜扫描图；
34.图17为cl-1以氯化钙为钙源24h生成产物电镜扫描图；
35.图18为cl-1以氯化钙为钙源48h生成产物电镜扫描图；
36.图19为cl-1以氯化钙为钙源72h生成产物电镜扫描图；
37.图20为cl-1以氯化钙为钙源96h生成产物电镜扫描图；
38.图21为cl-1以氯化钙为钙源120h生成产物电镜扫描图；
39.图22为cl-1修复混凝土裂缝结果示意图；
40.图23为cl-1修复混凝土裂缝结果(方解石)电镜扫描图；
41.图24为cl-1修复混凝土裂缝结果(球霰石)电镜扫描图；
42.图25为cl-1修复混凝土裂缝结果x-射线衍射图。
具体实施方式
43.本发明提供了一株硫磺色类谷氨酸杆菌(paeniglutamicibacter sulfureus)cl-1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号gdmcc no.62360。所述硫磺色类谷氨酸杆菌的16s rrna基因序列如seq id no：1所示。
44.所述硫磺色类谷氨酸杆菌耐低温能力较强，可在10～30℃范围内快速生长，最低可在5℃下正常生长；耐ph范围较广，可在ph为5～11范围内快速生长，可在4～13范围内正
常生长。所述硫磺色类谷氨酸杆菌具有较强的脲酶生产能力，能够在低温环境中快速分解尿素。
45.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
46.本发明使用的培养基如下：
47.1、尿素富集培养基：蛋白胨1g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾2g/l，尿素20g/l，葡萄糖0.1g/l，ph＝7，121℃灭菌20min。
48.2、脲酶筛选培养基：蛋白胨1g/l，氯化钠5g/l，磷酸二氢钾2g/l，尿素20g/l，葡萄糖0.1g/l，酚红0.012g/l，调ph＝7，121℃灭菌20min。
49.3、尿素基础培养基：蛋白胨5g/l，牛肉粉1.5g/l，酵母粉1.5g/l，氯化钠5g/l，尿素20g/l,ph＝7.0，121℃灭菌20min。
50.4、发酵培养基：蛋白胨5g/l，牛肉粉1.5g/l，酵母粉1.5g/l，氯化钠5g/l，尿素5g/l,ph＝7.0，121℃灭菌20min。
51.5、胶结液培养基：蛋白胨5g/l，牛肉粉1.5g/l，酵母1.5g/l，氯化钠5g/l，醋酸钙31.634g/l，尿素20g/l，ph＝7.0。121℃灭菌20min，
52.各培养基中尿素均先用0.22μm无菌膜过滤后再添加使用，培养基对应平板/固体培养基额外添加20g/l的琼脂。
53.实施例一：微生物的筛选与鉴定
54.1、菌株筛选。采集来自宁夏银川市平罗县盐碱地冻土的土壤样品，采样时环境为-17℃～1℃。将采集的土壤在尿素富集培养基中、10℃条件下富集驯化培养5d。富集的菌液用无菌水进行10-1
～10-8
梯度稀释，每个梯度浓度取0.1ml接种于脲酶筛选培养基平板上进行涂布，并在10℃恒温培养箱中培养，挑取单菌落多次在平板上划线分离纯化，获得菌株cl-1的单菌落。
55.2、菌株形态观察及生理生化鉴定。在光学显微镜下观察，菌株细胞为杆状，菌落为淡黄色突起，边缘整齐光滑，表面湿润。平板培养菌落形态如图1所示，扫描电镜下形态如图2所示。生理生化实验结果如表1所示，“+”表示阳性，
“‑”
表示阴性。
56.表1菌株生理生化结果对照表
57.检测指标产酸产气检测指标结果葡萄糖+－vp－乳糖－－甲基红试验－半乳糖+－淀粉水解试验－蔗糖+－明胶水解试验+阿拉伯糖－－吲哚试验－甘露醇+－h2o2酶试验+木糖－－尿素+果糖+－柠檬酸盐试验－
58.结果显示：该菌株能够利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇和果糖，能够水解尿素。
革兰氏染色结果表明该菌株为革兰氏阳性菌。菌株可在10～30℃范围内快速生长，最适温度为15～20℃，在低温条件下实现快速分解尿素，最低可在5℃下正常生长并分解尿素；可在ph为5～11范围内快速生长，可在4～13范围内正常生长，最适生长ph＝7.0。
59.3、菌株分子生物学鉴定。采用的dp302细菌试剂盒(天根生化科技有限公司)提取纯化菌株的总dna。以通用引物27f/1492r进行16srrna基因序列扩增，扩增的pcr产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序得到的16s rrna基因序列如seq id no:1所示，将其在ncbi上进行blast比对，与硫磺色类谷氨酸杆菌(paeniglutamicibacter sulfureus)的同源性达99.58％。综合该菌株的形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，鉴定该菌株为硫磺色类谷氨酸杆菌。
60.实施例二：菌株cl-1在不同环境下脲酶活性展示
61.1、菌株在不同温度下的生长情况及脲酶活性
62.将菌株cl-1按1％的接种量(v/v)接入尿素基础培养基(液体)中，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃添加下以150rpm的转速振荡培养，48h后取样测定菌液的od
600
值和脲酶活性。分别在5℃、10℃和25℃条件下使用全自动生长曲线仪绘制菌株的生长曲线。
63.不同温度下cl-1的生长曲线如图3所示，不同温度下菌株产脲酶的活性如图4所示。结果显示：菌株在10～30℃条件下都能生长，并能够检测到脲酶活性，在15℃条件下生物量和酶活都最高。菌株在5℃条件下仍能生长，第二天就进入对数生长期，而在10℃和25℃条件下生长延滞期更短，具有更高的生长速率。证明该菌株能够在5～30℃条件下生长，在低温条件下也具有较高的酶活。
64.2、菌株在不同ph条件下的生长及脲酶活性
65.配制尿素基础培养基(液体)，使用盐酸和氢氧化钠溶液调节培养基的ph分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，将菌株cl-1按1％的接种量(v/v)接入培养基中，在10℃、150rpm的条件下振荡培养，每12h测定菌液od
600
的值，绘制菌株在不同ph条件下的生长曲线，结果如图5所示。
66.配制1.11mol/l的尿素溶液，调节其ph分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，取18ml尿素溶液与2ml菌液液组成20ml体系，在振荡培养箱中以150rpm的转速稳定20min，检测各ph下的脲酶活性，结果如图6所示。
67.结果显示：菌株在ph为6～10的范围内生长快速，菌株的最适生长ph为7。在ph＝5和ph＝10的条件下生长的延滞期相对较长，需要3天时间才能进入对数生长期，在ph＝4和ph＝12的条件下需要更长的延滞期。od
600
＝1.3时，菌株在ph为4～13的范围内都能检测到脲酶活性，在ph＝10的条件下活性最高。表明该菌株能够在较宽的ph范围内生长，且具有较高的脲酶活性，在相对极端ph条件下仍能够较快生长。
68.实施例三：菌株cl-1诱导醋酸钙产生碳酸钙沉淀效果展示
69.将菌株cl-1接种到尿素基础培养基平板上，在10℃活化培养4d。将活化后的菌株按1％的接种量(v/v)接入发酵培养基中，10℃、150rpm振荡培养3d，使菌液浓度达到107～108cfu/ml。
70.分别配置含不同浓度醋酸钙(0.2m、0.4m、0.6m、0.8m、1.0m)的尿素基础培养基(液体)，将发酵后的菌液按照2％(v/v)的比例分别接种至250ml各尿素基础培养基中，在10℃、150rpm条件下振荡培养，在培养48h、96h时分别取样检测培养基中ca
2+
的浓度，并计算ca
2+
利用率，结果如表2所示。采用扫描电镜(sem)分析不同ca
2+
浓度下生成的沉淀的晶型，结果如图7～9所示。
71.表2不同钙浓度不同培养时间下ca
2+
利用率
72.钙浓度(mol/l)0.20.40.60.81.048h ca
2+
浓度(mg/l)4204.515256.722690.030710.039080.0利用率(％)47.42.42.41.4096h ca
2+
浓度(mg/l)171.18026.321575.030710.038140.0利用率(％)97.648.77.21.40.7
73.结果显示：随着ca
2+
浓度增加，菌株cl-1的活性逐渐受到抑制，菌株的适应时间也随之加长。当ca
2+
浓度达到0.8mol/l时，菌株完全被抑制。根据图7，当ca
2+
浓度为0.2mol/l，生成的碳酸钙沉淀晶体以方解石为主，根据图9，当浓度为0.6mol/l时，生成的碳酸钙晶体更倾向于无定型状态。综上，最佳ca
2+
浓度为0.2mol/l。
74.实施例四：菌株cl-1利用不同来源ca
2+
产生碳酸钙沉淀效果展示将菌株cl-1接种到尿素基础培养基平板上，10℃活化培养4d。将活化的菌种接入发酵培养基中，10℃、150rpm振荡培养3d，使菌液浓度达到107～108cfu/ml。
75.分别配置含0.1m的醋酸钙和氯化钙的尿素基础培养基(液体)，将发酵后的菌液按照2％(v/v)的比例接种至250ml上述各培养基中，同时每组设置不接菌的空白对照组，在10℃、150rpm条件下振荡培养，每12h取样检测各培养基中ca
2+
的浓度，并计算ca
2+
利用率，结果如表3所示。采用扫描电镜(sem)和x-射线衍射(xrd)分析不同时间生成的沉淀的结构和晶型，结果如图10、11所示。
76.表3不同来源钙离子对菌株cl-1利用率的影响
77.ca
2+
来源初始ca
2+
浓度(mg/l)培养96h ca
2+
浓度(mg/l)ca
2+
利用率(％)c4h6cao43979.1792.5897.67cacl24219.2592.9097.80
78.结果显示：时间足够长的情况下，菌株cl-1最终能够充分利用环境中的不同来源的ca
2+
诱导生成碳酸钙沉淀。但c4h6cao4提供ca
2+
时，菌株cl-1启动生成沉淀的时间短，只需要cacl2为钙源时的一半左右。
79.根据图10、11，以醋酸钙为钙源时，24h生成的晶体为球状、饼状和少量柱状，多为球霰石晶体，随着培养时间增长，晶体持续生长，培养时间达到96h时，有少量方解石晶体形成，随后方解石晶体数量逐渐增多。证明菌株诱导生成的碳酸钙沉淀逐渐向稳定的方解石形态转变。
80.以氯化钙为钙源时，24h生成的晶体形态大多数为球状、半球状、饼状以及未定型的晶体形态，晶体同样随着培养时间的增长而增大。培养到120h后，仍然以球霰石和未定型的晶体形态为主，未观察到方解石形态，但xrd数据显示有少量方解石形成。证明使用氯化钙为钙源形成的碳酸钙晶体不如醋酸钙为钙源时稳定。
81.实施例五：菌株cl-1在低温下诱导碳酸钙沉淀修复混凝土裂缝
82.由于菌株cl-1可以分泌脲酶从而分解尿素生成nh
4+
和co
32-,增加环境中的ph，促进环境中的ca
2+
与co
32-生成caco3沉淀，因此可用于混凝土裂缝养护和修复。
83.按实施例四的方法活化、发酵所述菌株cl-1，随后将发酵菌液滴灌入混凝土裂缝
中，固定20min，然后滴入胶结液培养基。每24h循环一次，在10℃环境下循环21d。结果如图12～25所示。图12～16为以醋酸钙为钙源时不同时间下碳酸沉淀情况，图17～21为以氯化钙为钙源时不同时间下碳酸沉淀情况。
84.根据图22，在10℃下，菌株cl-1以醋酸钙为钙源诱导形成的碳酸钙沉淀能够完全修复宽度为0.5mm和1mm的裂缝，对于1.5mm宽的裂缝修复效果较差，需要填充一些修复材料才能达到快速修复的目的。
85.根据图23、24，经菌株cl-1以醋酸钙为钙源修复混凝土裂缝生成的碳酸沉淀主要含有方解石(图23)和球霰石(图24)两种晶体形态，其中方解石为主要的晶体形态(图25)。证明经过多个循环修复，菌株cl-1诱导形成的碳酸钙逐渐趋于稳定。
86.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种菌制剂，其特征在于：所述菌制剂包括硫磺色类谷氨酸杆菌(paeniglutamicibacter sulfureus)cl-1，及供所述硫磺色类谷氨酸杆菌生存、生长的营养物质；所述硫磺色类谷氨酸杆菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no.62360。2.权利要求1所述菌制剂在诱导碳酸钙沉淀技术中的应用。3.权利要求1所述菌制剂在重金属的原位固定、沙化地土壤及地基固化、混凝土裂缝修复中的应用。4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于：所述应用方法包括如下步骤：将所述硫磺色类谷氨酸杆菌活化后，接种到含有钙离子和供所述硫磺色类谷氨酸杆菌生存、生长的营养物质的培养基中发酵培养，获得所述菌制剂；将所述菌制剂滴加到待诱导碳酸钙沉淀位置。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述硫磺色类谷氨酸杆菌发酵培养至菌液浓度达到107～108cfu/ml，获得所述菌制剂。6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述钙离子来源为醋酸钙或氯化钙中的任意一种或两种组合。7.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述钙离子浓度为0.2～0.8mol/l。8.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述应用的温度为10～30℃。9.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述应用的ph为4～13。

技术总结
本发明属于微生物领域，具体涉及一株硫磺色类谷氨酸杆菌及其应用。具体技术方案为：一种菌制剂，所述菌制剂包括硫磺色类谷氨酸杆菌(Paeniglutamicibacter sulfureus)CL-1，及供所述硫磺色类谷氨酸杆菌生存、生长的营养物质；所述硫磺色类谷氨酸杆菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.62360。本发明提供了一种新的可在低温、广泛pH范围内实现碳酸钙诱导的菌制剂。所述菌制剂诱导产生碳酸钙沉淀效果好，在10℃下对Ca


技术研发人员：田雪平 孔文艺 闫志英 李锋 程雅朋 范晓玲 吕青阳 罗健 姬高升 宦臣臣
受保护的技术使用者：中国科学院成都生物研究所
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/9