用于辅助诊断胎儿宫内生长受限的尿液代谢小分子组合及其应用

1.本发明属于代谢组学领域和医学领域，具体涉及胎儿宫内生长受限辅助诊断相关的尿液代谢小分子组合及其应用。


背景技术：

2.胎儿在母体子宫内的生长直接关乎子代围产期死亡率。适宜的胎儿生长被认为是长期健康的基础，胎儿生长的异常可能影响整个生命周期的疾病风险。1995年barker首次提出成人疾病的胎儿起源假说，他认为宫内环境和出生后早期代谢营养环境的改变会增加成年期罹患慢性疾病的风险。之后，越来越多的研究表明，宫内生长受限的胎儿更容易发生新生儿并发症、儿童期神经发育障碍、缺血缺氧性脑病和成年期代谢综合征，如2型糖尿病、冠心病和高血压等。胎儿生长受限(fetal growth restriction,fgr)又称胎儿生长迟缓、宫内生长受限或宫内发育迟缓，指受母体、胎儿、胎盘等病理因素的影响，胎儿生长大小异常，在宫内未达到其遗传的生长潜能，多表现为胎儿超声估测体重或腹围低于相应胎龄第10百分位。fgr多包含小于胎龄儿(small for gestational age infant，sga)。在发达国家的发病率为4-8％，发展中国家的发病率为6-30％。我国fgr发生率约6.4％，围产儿死亡率是正常者的6-9倍。近些年来研究表明，宫内生长受限会对孕妇、胎儿均产生不利影响，宫内生长受限是新生儿围产期死亡的第二大原因，占死产婴儿的30％，也是早产和产时窒息最常见的原因，还可能带来远期的不良结局，包括儿童期的认知障碍及成人期疾病(如肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、卒中等)的发生风险增加。如不及时加以干预，胎儿后期会出现缺氧、宫内死亡现象。胎儿若一直处于生长受限状态，其代谢状况将会发生改变：为节省相关能量代谢，只允许相关器官增长如大脑，同时影响其他组织肌肉生长。由此可见，宫内生长受限已成为一个亟待解决的重大公共卫生问题，早预防、早诊断、早治疗是一项重大和艰巨的医疗任务。
3.导致fgr的因素通常涉及母体、胎儿及胎盘脐带等3个方面。母体因素主要包括：营养不良、多胎妊娠、妊娠合并症(孕前合并紫绀型心脏病、慢性肾病、慢性高血压、糖尿病、甲状腺疾病、自身免疫性疾病等)、妊娠并发症(子痫前期、妊娠期肝内胆汁淤积等)和多胎妊娠等。胎儿因素主要包括：遗传学异常(染色体疾病、基因组疾病、单基因疾病等)和结构异常(先天性心脏病、腹壁裂等)。胎盘脐带因素主要包括：胎盘异常(轮廓胎盘、胎盘血管瘤、绒毛膜下血肿、小胎盘、副胎盘等)和脐带异常(单脐动脉、脐带过细、脐带扭转、脐带打结等)。其他的一些因素也可能造成fgr的发生：宫内感染(风疹、巨细胞病毒、弓形虫、梅毒等)、环境致畸物、药物的使用和滥用(烟草、酒精、可卡因、麻醉剂等)等。总之，fgr的最终发病应该是多因素相互作用导致。关于fgr的发病机制，多年来研究者围绕着病理生理学等各方面进行了探讨研究，但仍尚未完全阐明该病的确切发病机制。除此之外，临床上关于fgr的诊断仍存在困难。
4.超声和多普勒血流测速是目前临床上筛查fgr的主要方法，通过超声获取的头围、
腹围、股骨长和双顶径可计算得胎儿估计体重，多普勒血流测速提供了胎儿血流阻力。其他与不良妊娠结局相关的测量指标包括大脑中动脉搏动指数和脑胎盘比率。此外，目前建立并已发表的用于评估胎儿大小的生长曲线可以用于监测和早期诊断fgr，包括非定制曲线(hadlock胎儿生长曲线、intergrowth-21st、世界卫生组织胎儿生长曲线等)，以及定制的生长曲线(grow生长曲线、美国国家儿童健康与人类发展研究所胎儿生长曲线和中国南方人群胎儿生长曲线等)。但目前已有的筛查手段检出率较低，且假阳性会导致医源性早产的发生，低风险孕妇b超检出率仅为15％，绝大多数胎儿只有出生后才能确诊。目前认为，母体病史、体格检查、血清学筛查和子宫动脉多普勒检查可用于筛查fgr。但因为各种临床研究设计不同，对筛查效果的评价存在较大的差异。
5.代谢组学作为一门新兴组学，旨在对生物体内所有代谢途径产生的中间产物或最终产物中低分子量代谢物进行定量分析，可以同时获取基因表达及个体累积暴露于饮食、环境、体力活动或疾病及其相互作用的信息，其水平可以代表个体与环境之间的相互作用。由于代谢物是复杂的生物合成和分解代谢途径的最终产物，代谢物分子执行和响应了身体的大部分过程，因此代谢物研究被认为是生物功能的最具信息量的表现，代谢组学也被认为是一种比其他组学方法更具有早期辅助诊断性的研究外源性因素刺激引起的表型变化的有力技术。目前代谢组学在医疗领域的应用十分广泛，如疾病的诊断和筛查、疗效评估、药物开发及监测患者对治疗的反应等。其中非靶向代谢组学作为代谢组学的一种，主要是无偏向地检测样本中所有能检测到的代谢物分子，通过生信方法进行差异分析和通路分析，寻找生物标志物，初步建立模型的组学方法。非靶向代谢组学的应用为确定代谢物种类提供了可能性，进一步寻找母亲体液中fgr早期生物标志物，并且通过某种代谢物富集早期预测fgr发生风险。生物标记物诸如胎盘生长因子(plgf)，可溶性fms样酪氨酸激酶1(s-flt-1)和甲胎蛋白等已被研究证明可辅助诊断fgr，但早期诊断能力有限(plgf：正似然比1.3；s-flt-1：正似然比1.4；甲胎蛋白：正似然比3.7)。产前鉴定可为患者提供针对性随访，减少不良围产期结局和死产的发生风险。已有研究数据显示，经产前鉴定后，每天注射低剂量的乙酰磺胺酸可使fgr发病率减半。因此，早发现、早诊断、早治疗对于fgr具有重要的临床意义和公共卫生意义。
6.代谢组学根据研究目的的不同，可进一步分为非靶向和靶向代谢组学。非靶向代谢组学是对有机体内源性代谢物的全面、系统的分析，是一种无偏向的代谢组学分析，可以发现新的生物标记物。靶向代谢组学是针对特定一类代谢物的研究分析。二者各有优缺点，经常结合使用，用于差异代谢产物的发现和定量，对后续代谢分子标志物进行深入的研究和分析，这在食品鉴定、疾病研究、动物模型验证、生物标志物发现、疾病诊断、药物研发、药物筛选、药物评估、临床研究、植物代谢研究、微生物代谢研究中发挥重要作用。
7.非靶向代谢组学
8.非靶向代谢组学是在背景知识有限的基础上，对整个生命体代谢组进行的系统鉴定分析，获取代谢物数据，从中发现差异代谢物。非靶向代谢组学主要包含以下流程：
9.1.样本采集与处理
10.常见的代谢组学分析样本包括血浆、尿液、组织、细胞、细胞器等。足够大的样本量可以减少样本个体差异造成的误差。这些复杂样本中含有很多其他成分，可能对结果产生干扰，是影响代谢组学研究是否成功的关键因素。常用的样本处理方法包括蛋白质沉淀，差
速离心和萃取(固相萃取、液液萃取、超临界流体萃取、加速溶剂萃取)等。
11.2.实验分析
12.代谢组学常常需要运用多种分析技术手段来满足不同的实验需求。常见的代谢组学分析技术包括核磁共振(nmr)、液相色谱-质谱联用(lc-ms)、气相色谱-质谱联用(gc-ms)、毛细管电泳-质谱联用(cd-ms)、hilic
‑‑
ms等。高分辨质谱技术主要有tof-ms、fticr-ms、orbitrap-ms、sector-ms等。
13.3.数据分析
14.数据预处理：利用xcms、mzmine和markerview等工具进行原始数据处理。
15.鉴定差异代谢物：常用的分析方法包括主成分分析(pca)、偏最小二乘判别分析(pls-da)、正交偏最小二乘判别分析(opls-da)等。数据分析结果还需要经过t检验和变量权重重要性排序(variable importance in projection,vip)值筛选差异性代谢产物。一般认为，同时满足p《0.05，vip》1.0的变量为差异代谢物。
16.代谢通路分析：常见的代谢组学通路数据库包括hmdb、kegg、reactome、biocyc、metacyc等数据库，可以利用这些数据库进行代谢通路和互作网络分析。
17.多组学分析：多组学分析已经是组学发现的趋势了。可用的数据库和工具包括impala网站、ipeap软件、metaboanalyst网站、samnetweb网站、pwomics、metamapr、metscape、grinn、wgcna、mixomic、diffcorr、qpgraph、huge等。
18.靶向代谢组学
19.靶向代谢组学相对于非靶向代谢组学更有针对性，将关注点放在了几个或者几类与生物学事件相关的代谢物上，比如脂质组学、糖组学。
20.样本采集和处理
21.靶向代谢组学根据靶向组学关注的对象，针对性的采集样本。比如进行脂质组学时，选用对脂质有较好溶解能力的溶剂。靶向代谢物的定量是基于在标准品的定量标准曲线上的，所以需要准备符合条件的标准品。
22.实验分析
23.在靶向方法中，天然和同位素标记的标准品促进了代谢产物的鉴定和定量，减少了假阳性现象。定量代谢组学可用于在组织或生物体中建立代谢物基线水平，用于实验室间比较，或用于定义代谢正常与“扰动”状态。使用同位素标记的内标(is)也可以帮助解释影响分析精度的基质诱导的电离效应，从而提高生物反应检测试验的灵敏度。
24.数据分析
25.由于靶向代谢组学关注有限种类的代谢物，所以数据分析比非靶向代谢组学更为简单和直接。使用的方法和数据库和非靶向代谢组学相似，但是对于某类代谢组，有特定的数据库，如针对糖类和脂质组的lipidmaps和lipidbank等数据库。
26.由于两种代谢组学方法各有优缺点，非靶向代谢组学无偏差，全面系统反应生命体代谢组特征，但是重复性较差且线性范围有限；而靶向代谢组学的重复性和敏感性有提高，代谢物确证简单，线性范围宽，但是需要有预先的知识背景，是一种有偏向的代谢组分析方法。因此在实际应用中，两者常常结合使用，共同发挥作用。
27.近年有关采用代谢组学技术对fgr诊断及严重程度评估等的研究逐渐增多，已经成为临床和科研工作者的研究热点，在早期诊断fgr上的应用价值已初见端倪。代谢组学方
法已经确定了可能导致fgr的几种途径和代谢过程，例如dna甲基化的破坏，细胞信号转导，神经递质前体和能量产生等。favretto等发现了可以将适于胎龄儿(aga)与fgr新生儿相区分的22种代谢物，其中有7种是α-氨基酸，并且所有化合物在fgr新生儿中均上调，色氨酸，苯丙氨酸和谷氨酸分别具有最高的准确度，达到100％的敏感性和至少85％的特异性。在sanz-cortes等人的研究中，氨基酸仅在fgr中显着。liu等人研究了新生儿血液中的氨基酸和酰基肉碱，发现fgr新生儿同型半胱氨酸，蛋氨酸，酪氨酸，丙氨酸，鸟氨酸和丝氨酸水平低于正常儿的第3个百分点。maitre等进行的一项针对36例fgr和275例对照组的巢式病例对照研究发现，孕早期母体尿液代谢物醋酸盐、酪氨酸、甲酸盐、三甲胺、赖氨酸和糖蛋白与fgr发生风险有关，强调了尿液代谢谱作为识别fgr发生风险新的非侵入性生物标志物的潜力。目前还没有将代谢组学技术应用于fgr辅助诊断的报道，若能筛选出fgr的的早期生物标志物，对我国fgr的诊断现状必将是一次有力的推动。因此本研究基于非靶向代谢组学筛查出产下fgr孕妇与产下健康胎儿孕妇之间的尿液代谢差异物，将得到的差异性代谢物运用于fgr的临床诊断，且尿液的检测是无创和非侵入性，因此从尿液中筛选出fgr的早期诊断标记物，可准确、方便的为临床医生制定早期诊断和干预方案提供依据。
28.roc曲线(receiver operating characteristic curve，受试者工作特征曲线)是对于可能或将会存在混淆的两种条件或自然状态，需要试验者、专业诊断学工作者以及预测工作者作出精细判别或者准确决策的一种定量方法。roc曲线已经在医学领域广泛应用于临床诊疗、人群筛检等研究。运用roc曲线筛选生物标志物的策略主要包括，opls-da筛选差异代谢物，再用最小绝对收缩与选择算子算法(least absolute shrinkage and selection operator，lasso)和极端梯度上升算法(extreme gradient boosting，xgboost)算法选择重要的代谢物，然后使用逻辑回归模型筛选最佳的代谢物组合，即候选的生物标志物。


技术实现要素：

29.本发明的目的是为了克服现有临床诊断上的不确定性，提出一种与宫内生长受限辅助诊断相关的尿液代谢小分子组合及其应用。
30.本发明的还要解决的技术问题是提供一种基于代谢组学的宫内生长受限早期诊断尿液代谢小分子组合的筛选方法。
31.本发明的还要解决的技术问题是提供上述宫内生长受限早期诊断尿液代谢小分子组合的应用。
32.技术方案：为了解决上述技术问题，发明人利用液相色谱-质谱联用平台，对孕产妇的孕早期尿液进行非靶向代谢组学检测，发现并分析与fgr有关的特征性差异代物，筛选fgr及正常对照组间差异代谢物，即可作为宫内生长受限早期诊断代谢小分子组合。
33.本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
34.一种宫内生长受限辅助诊断代谢小分子组合，该代谢小分子组合为代谢小分子即替格甘氨酸，胆碱，d-核糖，尿酸，2-乙酰基-3-亚乙基-3,4,5,6-四氢吡啶，对甲二酮，丙基环丙胺，肉桂酰甘氨酸，蛋氨酸亚砜，左旋肉碱，羟脯氨酰异亮氨酸，间氨基苯甲酸，n-去甲基伊曲普坦，尿苷，对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸，奥罗替丁，硫酸脱氢表雄酮，5-乙基-4-甲基噻唑，1-3-氨基丙基-4-氨基丁醛，氯伏沙明，2-糠酸甲酯的组合。
35.用于检测上述辅助诊断代谢小分子组合的检测方法为基于uplc-q exactive ms非靶标代谢组学检测方法。该方法为常规方法，可以委托第三方检测公司完成检测女性尿液中上述的代谢小分子。
36.所述的方法中：
37.(1)液相条件：
38.液相色谱柱waters acquity uplc beh amide(2.1mm
×
100mm,1.7μm)液相色谱柱，柱温为25℃；
39.液相色谱a相为水相，含25mmol/l乙酸铵和25mmol/l氨水，b相为乙腈，流速500μl/min；
40.仪器梯度为：0～0.5min,95％ b；0.5～7min,95％～65％ b；7～8min,65％～40％ b；8～9min,40％ b；9～9.1min,40％～95％ b；9.1～12min,95％ b；
41.进样：3μl；
42.(2)质谱条件：
43.thermo q exactive hfx质谱仪在控制软件(xcalibur，thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集，详细参数如下：sheath gas flow rate:50arb,aux gas flow rate:10arb,capillary temperature:320℃,full ms resolution:60000,ms/ms resolution:7500,collision energy:10/30/60in nce mode,spray voltage:3.5kv(positive)或-3.2kv(negative)。
44.所述的代谢小分子组合在制备辅助诊断宫内生长受限的试剂盒中的应用，比如用作标准品。
45.用于检测所述代谢小分子组合的检测试剂在制备辅助诊断宫内生长受限的试剂盒中的应用。
46.一种用于辅助诊断宫内生长受限的诊断试剂盒，该试剂盒含有用于检测所述的代谢小分子组合的试剂组合。这些试剂可以根据检测方法不同而灵活选择，都可以从市场上买到。本发明试剂盒含有采用uplc-q exactive ms非靶标代谢组学检测方法检测女性尿液中所述代谢小分子组合的试剂。所述的试剂盒含有甲醇、乙腈、乙酸铵、氨水。
47.具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(sop)采集符合标准的尿液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)尿液非靶向代谢组学检测：利用液相色谱-质谱联用平台，对孕产妇的孕早期尿液进行非靶向代谢组学检测。
48.本发明内容还包括一种与fgr诊断相关的代谢小分子组合的筛选方法，包括以下步骤：本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的尿液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，对孕产妇的孕早期尿液进行非靶向代谢组学检测根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度得到fgr患儿与健康儿童之间的差异代谢物。
49.具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
50.其中，所述筛选方法具体包括以下步骤：
51.1)非靶向lc/ms代谢组样本准备：
52.2)非靶向lc/ms代谢组条件设置以及非靶向lc/ms代谢组数据处理与分析；
53.根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度筛选得代谢小分子组合。
54.1.研究对象的选择
55.本课题组自2015年开始建立南京医科大学出生队列，截至2019年10月31号，在南京、苏州两地完成9898个家庭的招募。本项目研究对象的纳入标准：
①
单胎活产；
②
完成孕期随访并采集孕早期尿液样本；
③
完成孕中、晚期b超监测。
56.1.1研究对象的资料收集和追踪随访
57.1.1.1基线信息：通过问卷收集研究对象的人口社会经济学资料(婚姻、教育、住址、职业史、家庭经济状况、年龄等)、身高体重、疾病史及家族史、生殖生育史、孕前健康相关行为与生活方式(吸烟、饮酒、锻炼等)和孕前服用膳食补充剂(叶酸及复合维生素等)；
58.1.1.2孕期和分娩随访：孕早、中和晚期进行定期随访，通过问卷调查收集健康相关行为与生活方式(吸烟、饮酒和体育锻炼等)、睡眠情况、心理健康状况(焦虑、抑郁和压力)、膳食补充剂及膳食情况等；通过医院电子信息系统摘录孕早、中、晚期临床信息(常规产前检查、实验室检测报告等)；通过医院的电子病历系统获取孕妇孕期相关疾病(妊娠高血压、妊娠糖尿病等)、新生儿性别、分娩方式、孕周、出生体重及出生结局等；
59.1.2生物样本的采集：在孕妇孕早期纳入(孕10-14周)收集尿样，采集中段尿液至50ml的聚丙烯材质(不含双酚类)尿杯中，并分装到5ml聚丙烯材质的冻存管中，置于-20℃冰箱冷冻保存。
60.2.母亲孕早期尿液非靶向代谢组学检测。
61.2.1样本前处理：
①
配制200倍浓度的内标储备液50ml，分装至1ml离心管，-80℃备用；
②
取内标储备液，用甲醇：乙腈(1:1，v/v)稀释200倍，用作提取液，-40℃预冷备用；
③
尿液样品冰上解冻，取25μl样品测渗透压；并根据渗透压数据取样品稀释至100μl；
④
样品中加入400μl提取液，混匀后，-40℃静置1h；
⑤
取出后4℃离心15min，取上清液，-80℃保存(保存时间不超过5天)；
⑥
将样品转移至4℃离心冰箱60min后，上机进行lc/ms分析；
62.2.2质量控制：检测过程实时监控仪器稳定性及信号是否正常；使用qc样本。
63.3.统计分析
64.将lc/ms导出的原始数据经proteowizard软件转成mzxml格式后，使用r程序包(内核为xcms)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与biotreedb二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的cutoff值设为0.3。数据标准化处理后，采用metaboanalystr(2.0.3)软件进行统计分析fgr和对照组间非靶向尿液代谢谱的分析,计量资料用均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，采用t检验和mann-whitney u检验识别分析fpg患儿和健康儿童之间的差异代谢物，以p＜0.05筛选出具有统计学意义的差异代谢物：采用主成分分析(principal component analysis，pca)可视化组间尿液代谢谱差异；差异代谢物富集通路分析。
65.本发明有益效果：
66.与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明基于非靶向代谢组学技术筛选出fgr与正常胎儿之间的尿液差异代谢物。非靶向代谢组学定性的特征相获取的疾病诊断差异代谢物的准确性、灵敏度和特异性较高。此外，尿液样本的获取是无创的。本发明的代谢小分子组合从微观代谢物角度诊断fgr，并且操作简单，结果精确客观可靠，能够很好地将fgr组和正常组区分开，为临床准确的诊断提供了便利，且这仅需提供尿样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生早期准确诊断和提供
早期干预方案提供参考依据。
附图说明
67.图1、用于fgr发生诊断效率的roc曲线图。
具体实施方式
68.以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，实验过程中未详细描述的操作步骤为本领域技术人员公知的相关操作步骤，采用的试剂为与检测方法相适应的设备厂商提供的配套试剂及常规试剂，均可从市售获得，不再进行特别说明。
69.实施例1
70.发明人自2015年开始建立南京医科大学出生队列，截至2019年12月31号，在南京、苏州两地完成家庭的招募，在孕妇孕早期纳入(孕10-14周)收集尿样，采集中段尿液至50ml的聚丙烯材质(不含双酚类)尿杯中，通过对样品资料的整理，发明人从中选择1459例符合下列标准的尿液样本进行代谢组学分析，并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
71.1.研究样本的选择
72.(1)单胎活产；
73.(2)采集孕早期尿液样本；
74.(3)完成孕中、晚期b超监测。
75.2.试验材料：色谱级甲醇(methanol)、乙腈(acetonitrile)、乙酸铵(ammonium acetate)、氨水(ammonium hydroxide)；vanquish超高效液相色谱仪(购自thermo fisher scientific)；q exactive hfx高分辨质谱仪(购自thermo fisher scientific)；heraeus fresco17离心机(购自thermo fisher scientific)；bsa124s-cw天平(购自sartorius)；明澈d24 uv纯水仪(购自merck millipore)；ps-60al超声仪(购自深圳市雷德邦电子有限公司)。
76.3.样本收集和样本资料的整理：
77.本发明共计使用孕妇孕早期尿液样本1459例，样本之间采样孕周无显著差异(p＝0.055)。
78.4.样本准备
79.采集中段尿液至50ml的聚丙烯材质(不含双酚类)尿杯中，并分装到5ml聚丙烯材质的冻存管中，置于-80℃冰箱冷冻保存直至lc-ms分析。
80.5.代谢物提取
81.1)将样品置于干净的冰上解冻，混匀；
82.2)移取25μl尿液样品于ep管中，测试渗透压；
83.3)根据公式稀释尿液样品：v＝14124.55/(y-8.7545)，y：渗透压，v：所取样品体积/μl，100-v/μl为所加超纯水体积，最终在ep管中配成100μl的液体；
84.4)移取内标提取试剂(甲醇：乙腈，体积比：1:1)400μl于ep管中，涡旋30s，超声10min；
85.5)置于-40℃冰箱静置1h；
86.6)高速离心，12000rpm，4℃，15min；
87.7)取上清液于进样瓶中，冻存于-80℃冰箱直至检测。(冻存时间小于7天)。
88.6.代谢组条件设置
89.色谱条件：本项目使用vanquish(thermo fisher scientific)超高效液相色谱仪，通过waters acquity uplc beh amide(2.1mm
×
100mm,1.7μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱流动相：a相为水相，含25mmol/l乙酸铵和25mmol/l氨水，b相为乙腈。采用梯度洗脱：0～0.5min,95％b；0.5～7min,95％～65％ b；7～8min,65％～40％ b；8～9min,40％ b；9～9.1min,40％～95％ b；9.1～12min,95％ b。(b指流动相b，各梯度中流动相a的量与对应的流动相b的量共100％)。流动相流速：0.5ml/min，柱温：25℃，样品盘温度：4℃，进样体积3μl。
90.质谱条件：thermo q exactive hfx质谱仪能够在控制软件(xcalibur，thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下：sheath gas flow rate:50arb,aux gas flow rate:10arb,capillary temperature:320℃,full ms resolution:60000,ms/ms resolution:7500,collision energy:10/30/60in nce mode,spray voltage:3.5kv(positive)或-3.2kv(negative)。
91.7.代谢组数据处理与分析
92.原始数据经proteowizard软件转成mzxml格式后，使用r程序包(内核为xcms)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与biotreedb(v2.1)二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的cutoff值设为0.3。
93.数据标准化处理后，采用metaboanalystr(2.0.3)软件进行统计分析，分析方法包括主成分分析(principal component analysis，pca)，t检验，富集通路分析。相关数据处理及统计分析的中间过程关于繁杂，不再详述。
94.分析得出代谢小分子组合(替格甘氨酸，胆碱，d-核糖，尿酸，2-乙酰基-3-亚乙基-3,4,5,6-四氢吡啶，对甲二酮，丙基环丙胺，肉桂酰甘氨酸，蛋氨酸亚砜，左旋肉碱，羟脯氨酰异亮氨酸，间氨基苯甲酸，n-去甲基伊曲普坦，尿苷，对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸，奥罗替丁，硫酸脱氢表雄酮，5-乙基-4-甲基噻唑，1-3-氨基丙基-4-氨基丁醛，氯伏沙明，2-糠酸甲酯的组合)与fgr相关，采用独立人群应用上述代谢小分子组合能够很好地将fgr组和正常组区分开，结果见图1，具有良好的早期辅助诊断价值。

技术特征：
1.一种宫内生长受限辅助诊断代谢小分子组合，其特征在于该代谢小分子组合为代谢小分子即替格甘氨酸，胆碱，d-核糖，尿酸，2-乙酰基-3-亚乙基-3,4,5,6-四氢吡啶，对甲二酮，丙基环丙胺，肉桂酰甘氨酸，蛋氨酸亚砜，左旋肉碱，羟脯氨酰异亮氨酸，间氨基苯甲酸，n-去甲基伊曲普坦，尿苷，对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸，奥罗替丁，硫酸脱氢表雄酮，5-乙基-4-甲基噻唑，1-3-氨基丙基-4-氨基丁醛，氯伏沙明，2-糠酸甲酯的组合。2.用于检测权利要求1所述辅助诊断代谢小分子组合的检测方法，其特征在于该代谢小分子组合的检测方法为基于uplc-q exactive ms非靶标代谢组学检测方法。3.权利要求1所述的代谢小分子组合在制备辅助诊断宫内生长受限的试剂盒中的应用。4.用于检测权利要求1所述代谢小分子组合的检测试剂在制备辅助诊断宫内生长受限的试剂盒中的应用。5.一种用于辅助诊断宫内生长受限的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有检测女性尿液中权利要求1所述代谢小分子组合的试剂。6.根据权利要求5所述的辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有采用uplc-qexactive ms非靶标代谢组学检测方法检测女性尿液中权利要求1所述代谢小分子组合的试剂。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有甲醇、乙腈、乙酸铵、氨水。

技术总结
本发明属于代谢组学领域和医学领域，公开了用于辅助诊断胎儿宫内生长受限的尿液代谢小分子组合及其应用。代谢小分子组合为代谢小分子即替格甘氨酸，胆碱，D-核糖，尿酸，2-乙酰基-3-亚乙基-3,4,5,6-四氢吡啶，对甲二酮，丙基环丙胺，肉桂酰甘氨酸，蛋氨酸亚砜，左旋肉碱，羟脯氨酰异亮氨酸，间氨基苯甲酸，N-去甲基伊曲普坦，尿苷，对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸，奥罗替丁，硫酸脱氢表雄酮，5-乙基-4-甲基噻唑，1-3-氨基丙基-4-氨基丁醛，氯伏沙明，2-糠酸甲酯的组合，可用于制备胎儿宫内生长受限的辅助诊断试剂盒。断试剂盒。断试剂盒。


技术研发人员：沈洪兵 胡志斌 靳光付 杜江波 蒋涛 陶诗瑶
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/9