重组人源化III型胶原蛋白、制备方法及其应用与流程

重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及其应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是细胞外基质(ecm)中含量最丰富的蛋白家族，约占蛋白总量的25～30％，发挥传递生长因子和细胞因子、维持组织结构完整性、影响细胞黏附和增殖等多种生物学功能。胶原蛋白具有其他合成材料无法比拟的生物相容性、生物可降解性及可规模化生产等优点，它不仅可作为保健食品、美容产品、包装材料，还可以作为食品添加剂应用，是继透明质酸后又一应用领域横跨医疗、医美、化妆品、食品的成分。
3.目前胶原蛋白的生产方法主要有传统提取法、化学合成法和生物合成技术法。提取自动物的皮肤和跟腱等组织的传统胶原蛋白，其原料来源广泛，但存在病毒隐患、纯度低、免疫反应等缺点。化学合成法无法实现批量制备，且制备成本较高。生物合成技术是利用基因工程技术实现重组胶原蛋白的表达，其具有成本低、效率高等优点，且能够通过菌种发酵技术实现大规模工业生产，具有很好的应用前景。其中毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统既具有原核表达系统易于培养、繁殖快速、表达量高的优点，又具有真核表达系统外源蛋白翻译后再加工修饰等特点，目前已有超过500种外源蛋白在毕赤酵母中获得成功表达。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化。
4.整合素是细胞粘附分子的一大家族，是广泛分布于细胞表面的粘附受体，它参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用，介导细胞的增殖、分化、粘附、迁移等过程。胶原蛋白可以与整合素、盘状蛋白结构域等多种细胞表面受体结合，调控细胞的各项生命活动。


技术实现要素：

5.本发明提供一种重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及其应用。该重组人源化iii型胶原蛋白富含多个整合素结合基序(ger、gek及rgd)，具有优异的亲水性。
6.本发明所述的重组人源化iii型胶原蛋白，含有480个氨基酸，理论分子量约44kd，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
7.本发明还提供上述重组人源化iii型胶原蛋白的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
8.进一步地，本发明提供表达上述重组人源化iii型胶原蛋白的毕赤酵母基因工程菌，通过以下步骤构建：
9.pcr扩增重组人源化iii型胶原蛋白的编码基因，纯化后，利用gibson assembly技术无缝克隆到ppic9k质粒的α因子分泌信号肽下游，经pcr和dna测序验证正确后提取质粒，用sali酶切线性化后电转化到毕赤酵母gs115感受态细胞中，经1～6g/l g418抗性梯度影印平板筛选获得表达重组人源化iii型胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌。
10.优选地，pcr扩增重组人源化iii型胶原蛋白的编码基因采用的引物为：seq id no.7所示的引物1：ctgaagcttacgtagaattc和seq id no.8所示的引物2：gcgaattaattcgcggccgc。
11.更进一步地，本发明提供上述重组人源化iii型胶原蛋白在制备生物医用材料或化妆品中的应用。
12.本发明从已知序列的人体ⅲ型α1链胶原蛋白氨基酸序列筛选出水溶性强且富含多个整合素结合基序的氨基酸序列，并以该氨基酸序列为重复单元经8次重复后形成的片段作为优选片段，根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
的编码基因，将其插入毕赤酵母表达质粒中，转化、筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经发酵及纯化，得到高纯度的重组人源化iii型胶原蛋白。本发明的重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
的促细胞黏附、增殖和迁移性能均明显优于其他重复次数构建的重组人源化iii型胶原蛋白(m＝6或10)，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
13.图1为人ⅲ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性评价图。
14.图2为重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
的氨基酸疏水性评价图。
15.图3为重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
表达质粒构建图。
16.图4为重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
的sds-page结果图。
17.图5为各重组人源化iii型胶原蛋白的细胞增殖图。
18.图6为各重组人源化iii型胶原蛋白的细胞黏附图。
19.图7为各重组人源化iii型胶原蛋白的细胞迁移图。
具体实施方式
20.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
21.实施例1
22.1.重组人源化iii型胶原蛋白的设计
23.对人ⅲ型α1链胶原蛋白氨基酸序列(seq id no.1)进行疏水性分析，氨基酸评价结果如图1，疏水性评价分值越低其亲水性越好。为得到水溶性较好的胶原蛋白，根据疏水性分析结果，选择氨基酸评分较低的蛋白片段，同时选择富含整合素结合基序(ger、gek及rgd)的区域，将选择的两个氨基酸序列片段整合(seq id no.2)。以整合后的片段作为最小重复单元，对其多次重复，重复次数为m，设计m＝6(seq id no.3)、8(seq id no.4)或10(seq id no.5)，获得三个重组人源化iii型胶原蛋白。对三个重组人源化iii型胶原蛋白的
氨基酸进行疏水性分析，所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该三个重组人源化iii型胶原蛋白的亲水性均较好。以m＝8的重组人源化iii型胶原蛋白为例，其氨基酸疏水性评价如图2所示。
24.2.表达重组人源化iii型胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌的构建
25.(1)以m＝8的重组人源化iii型胶原蛋白为例，将其氨基酸序列以毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
26.(2)利用引物1：ctgaagcttacgtagaattc(seq id no.7)和引物2：gcgaattaattcgcggccgc(seq id no.8)，pcr扩增重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
的编码基因，纯化后，利用gibson assembly技术无缝克隆到ppic9k质粒的α因子分泌信号肽下游，重组后的质粒结构如图3所示。经pcr和dna测序验证正确后提取质粒，用sali酶切线性化后电转化到毕赤酵母gs115感受态中，经1～6g/l g418抗性梯度影印平板筛选获得高拷贝重组子。
27.按上述方法分别构建表达重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
和重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
的高拷贝毕赤酵母基因工程菌。
28.3.重组人源化iii型胶原蛋白在毕赤酵母基因工程菌中的表达
29.将表达重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株接种于30ml bmgy培养基中，培养16-20小时，然后以初始od
600
为1的接种量接种于30ml bmmy培养基中进行培养，每隔24小时补充300μl过滤除菌的甲醇，甲醇诱导120小时后，取2ml培养基，离心收集上清，利用sds-page对重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
进行定性分析，检测结果见图4。由图4可知，该高拷贝毕赤酵母基因工程菌株能够成功表达重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
。
30.按上述方法分别将表达重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
和重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株接种、培养和表达，获得重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
和重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
。
31.bmgy培养基：每升培养基含有20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，10
×
ynb 100ml，10
×
磷酸钾缓冲液ph 6.0100ml，10
×
甘油100ml，余量为水。
32.bmmy培养基：每升培养基含有20g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，10
×
ynb 100ml，10
×
磷酸钾缓冲液ph 6.0 100ml，余量为水。
33.实施例2
34.重组人源化iii型胶原蛋白的生物活性检测
35.通过细胞实验对重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
、重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
、重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
的生物活性进行检测。
36.1.细胞增殖
37.(1)向96孔板中每孔中加入8000个培养状态良好的人表皮细胞(hacat细胞)，37℃孵育24h；
38.(2)弃上清，设置10％血清培养基配制的不同浓度的重组人源化iii型胶原蛋白溶液为实验组、10％血清培养基为空白对照组，每组设置6个重复，每孔中加入100μl不同浓度的重组人源化iii型胶原蛋白溶液或培养基，37℃孵育48h；
39.(3)弃上清，每孔中加入50μl mtt-完全培养基溶液，37℃孵育2h；
40.(4)弃上清，每孔加入100μl的dmso于脱色摇床上振摇10min；
41.(5)检测波长为490nm，以630nm为参考波长，od值为490nm的od值减去630nm的od值，根据公式细胞相对增殖率＝od
样品
/od
空白
×
100％，计算细胞相对增殖率，将空白对照设置为100％。
42.结果如图5所示，可以看出，各浓度下本发明的重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
均优于重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
和重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
；且在浓度低于0.1％时，重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
具有优秀的促进细胞增殖能力。
43.2.细胞黏附
44.利用离心法检测分别重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
、重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
、重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
样品的细胞黏附性，通过将细胞悬液在分别涂有重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
、重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
、重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
的培养皿中培养一定时间，用荧光标记细胞，在最佳相对离心力，洗脱未黏附的细胞，测定离心前后细胞分离百分比，评价待测胶原蛋白的相对促细胞黏附性，根据公式黏附百分比＝离心后细胞数/离心前细胞数
×
100％，细胞相对黏附率＝样品的黏附百分比平均值/空白对照组的黏附百分比平均值，计算细胞相对黏附率。具体步骤如下：
45.(1)设置2ml无血清培养基配制的不同浓度的重组人源化iii型胶原蛋白溶液为实验组和添加等量pbs溶液的空白对照组，每组设置6个重复，向96孔板每孔中加入100μl不同浓度的重组人源化iii型胶原蛋白溶液或pbs溶液，37℃孵育1～4h；
46.(2)弃上清，每孔中加入100μl 1％bsa，37℃孵育48h；
47.(3)pbs清洗三次，用封口膜密封后置于4℃备用；
48.(4)每孔中加入5000个培养状态良好的人表皮细胞(hacat细胞)，含10％hoechst33342荧光染色剂，37℃孵育1h；
49.(5)使用倒置显微镜捕获3个孔中每个孔的荧光平铺图像；
50.(6)每个孔用d-pbs填充以形成“反向弯月面”，吹扫气泡并用封口膜覆盖，以350g离心力再离心(倒置放置)5min；
51.(7)离心后，弃去封口膜，从孔中取出上清液，用d-pbs清洗1次后，加入100μl d-pbs，对于3个孔的每个孔进行拍摄；
52.(8)使用image j细胞计数程序来计数荧光标记的细胞核数目，测定离心前后的细胞数，将空白对照设置为100％。
53.细胞的黏附率可以反应重组人源化iii型胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。由图6可知，实验浓度下，重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
对人表皮细胞的促进细胞黏性均优于重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
和重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
，且随着蛋白溶液的浓度增加而增加，表现出优秀的促进细胞黏附活性。
54.3.细胞迁移
55.利用细胞划痕法测定细胞迁移运动。具体步骤如下：
56.(1)用marker笔比着直尺在6孔板底部画3条横线，人表皮细胞(hacat细胞)浓度调整为5
×
105个/孔，接种到6孔板，每孔体积2ml，培养24h；
57.(2)用20μl枪头比着直尺垂直对准孔板，向下轻推纵向划线形成划痕；
58.(3)用pbs漂洗细胞3次，去除划掉的细胞；
59.(4)在实验组加入2ml无血清培养基配制的不同浓度的重组人源化iii型胶原蛋白溶液，空白对照组只加入2ml无血清培养基，在37℃，5％ co2培养箱培养，于0h、24h后，以横向划线和纵向划痕的交点为核心，在40倍显微镜下拍照，每孔获得9个部位的照片，每组合计27个数据；
60.(5)用image j软件测量划痕面积并计算细胞每组的细胞迁移速率，将空白对照设置为100％。
61.结果如图7所示，据此可知，重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
对人表皮细胞的促进细胞迁移率在各蛋白浓度下均优于重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
和重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
，且随着蛋白溶液的浓度增加而增加，表现出优秀的促进细胞迁移的功效。
62.综上，本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因iii型的螺旋区中选择水溶性强、富含多个整合素结合基序的蛋白序列，将优选基因片段多次重复后插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组人源化iii型胶原蛋白。本发明的重组人源化iii型胶原蛋白结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同。细胞实验结果表明，重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
在促细胞黏附、增殖和迁移方面均优于重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝6)
和重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝10)
，且表现出促进作用，本发明的重组人源化iii型胶原蛋白
(m＝8)
在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。

技术特征：
1.重组人源化iii型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.4所示。2.如权利要求1所述的重组人源化iii型胶原蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.6所示。3.表达如权利要求1所述的重组人源化iii型胶原蛋白的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，通过以下步骤构建：pcr扩增重组人源化iii型胶原蛋白的编码基因，纯化后，利用gibson assembly技术无缝克隆到ppic9k质粒的α因子分泌信号肽下游，经pcr和dna测序验证正确后提取质粒，用sali酶切线性化后电转化到毕赤酵母gs115感受态细胞中，经1～6g/l g418抗性梯度影印平板筛选获得表达重组人源化iii型胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌。4.根据权利要求3所述的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，pcr扩增重组人源化iii型胶原蛋白的编码基因采用的引物为：seq id no.7所示的引物1：ctgaagcttacgtagaattc和seq id no.8所示的引物2：gcgaattaattcgcggccgc。5.如权利要求1所述的重组人源化iii型胶原蛋白在制备生物医用材料或化妆品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种重组人源化III型胶原蛋白、制备方法及其应用。所述的重组人源化III型胶原蛋白含有480个氨基酸，理论分子量约44kd，构建的毕赤酵母基因工程菌能够有效稳定和大量地表达重组人源化Ⅲ型胶原蛋白。本发明的重组人源化胶原蛋白富含多个整合素结合基序，具有良好的亲水性，与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，并且具有较好促细胞黏附、增殖和迁移的活性，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。具有潜在的应用前景。具有潜在的应用前景。


技术研发人员：杨涛 李艳徽
受保护的技术使用者：广州易和生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/8/9