核酸分子及其作为启动子的应用的制作方法

1.本发明涉及生物工程领域，尤其涉及核酸分子及其作为启动子的应用。


背景技术：

2.启动子(promoter)是位于结构基因5'端上游的一段dna序列，能活化rna聚合酶，使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子的一般结构包括核心启动子元件和上游调控元件，其中核心启动子元件又包括转录起始点和tata框，是rna聚合酶结合并起始转录的主要位点；上游调控元件则能够通过与对应的反式作用因子相结合改变转录的效率。由于元件和位置不同，不同启动子的转录能力也有所不同；根据启动子对转录水平的调控程度，将通常会将启动子分为弱启动子和强启动子。如cmv启动子就是一个从人巨细胞病毒(cytomegalovirus,cmv)中发现的强启动子，能够广泛高表达于大部分的真核细胞中。
3.基因导入载体系统中病毒载体系统能够实现更高效率的递送，但通常都存在载体容量限制的不足之处。常用的病毒载体有慢病毒载体、腺病毒载体、aav载体等，其中aav载体因其安全性和高感染效率等优势被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
4.aav的基因组容量约为4.7kb，如果需要递送的基因长度基本达到该长度限制，将难以使用aav载体进行递送，其中一种解决方案就是使用长度短的启动子和ploya等元件，尽可能为装载基因腾出空间。
5.因此后续出现了许多通过人工改造方式获得具有一定功能和活性，同时整体长度比较短的核苷酸序列段，包括截短版本的cmv启动子，如cmvd1；和翻译延伸因子片段，如efs启动子等。虽然这些版本的启动子片段长度足够短，但其启动转录活性比常用启动子的低了许多；存在目的基因表达量不足的问题。总的来说，仍存在部分既需要表达量较高，又需要在一定程度上压缩启动子的长度的空白区域。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了核酸分子及其作为启动子的应用。本发明提供的启动子，与现有的常用短版本启动子相比，能够在提高目的基因在真核细胞中的表达，在某些对目的基因表达量要求较高但又有启动子长度限制的场景下有较强的应用价值。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了核酸分子，具有：
9.(1)、如seq id no:1～seq id no:4任意所示的核苷酸序列；或
10.(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列；或
11.(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸序列。
12.在本发明的一些实施方案中，seq id no:1的序列为：ggtctttcatt atgcggttttg
gcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatc。
13.在本发明的一些实施方案中，seq id no:2的序列为：cccccaagga cctgaaatgaccctgcgcccacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccaaaacaaactcccattgactcactcggcgcgccagtcctccg。
14.在本发明的一些实施方案中，seq id no:3的序列为：actccgccca gttccgcccacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgccctcgggaaaaaggcggagccagtacacgacatcactttcccagtttaccctcccctcgcagccccggtttgactcacggccggcgctccggggagcacgaggcgaaggtatcgaaagcagcgagacaggcgcgaaggtgccaccagattcgcacgcggcggccccagcgcccaggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggttt。
15.在本发明的一些实施方案中，seq id no:4的序列为：tctgatggttc tctagaaactgctgagggcgggaccgcatctggcctaaagacgacgtactccaaaagctcgagagagccggggcggtccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtg。
16.在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子的大小不大于400bp。
17.本发明还提供了上述核酸分子作为启动子的应用。
18.本发明还提供了转录元件，包括上述核酸分子和目的基因。
19.在本发明的一些实施方案中，上述转录元件，还包括荧光蛋白。
20.本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子或上述的转录元件。
21.在本发明的一些实施方案中，上述表达载体，包括病毒载体或非病毒载体。
22.本发明还提供了宿主，转化或转染上述表达载体。
23.在本发明的一些实施方案中，上述宿主，包括真核细胞。
24.本发明还提供了上述核酸分子、上述转录元件、上述表达载体或上述宿主在真核表达系统中的应用。
25.本发明提供了核酸分子，具有：
26.(1)、如seq id no:1～seq id no:4任意所示的核苷酸序列；或
27.(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列；或
28.(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸序列。
29.本发明通过对cmv启动子进行人工改造获得了四个长度较短的重组启动子，其长度基本与efs启动子相似，但表达强度明显高于efs和cmvd1启动子。这四个重组的启动子能够在广泛应用于真核表达系统，保证目的基因有较强表达的同时能够节约出更多的目的基因装载空间，适合广泛应用于各种病毒载体和非病毒载体系统中。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
31.图1示载体框架；
32.图2示效果例1的24h荧光观察图；其中：灰色为倒置荧光显微镜明场下拍摄的细胞图片，用于观察细胞的生长密度、状态等，细胞边缘有白色光环(光晕)，背景为灰黑色；绿色为倒置荧光显微镜绿色通道拍摄图片，用于观察重组启动子载体上的egfp绿色荧光蛋白的表达情况；红色为倒置荧光显微镜红色通道拍摄图片，用于观察共转染对照载体上的mcherry红色荧光蛋白的表达情况；
33.图3示效果例1的48h荧光观察图；其中：灰色为倒置荧光显微镜明场下拍摄的细胞图片；绿色为倒置荧光显微镜绿色通道拍摄图片；红色为倒置荧光显微镜红色通道拍摄图片；
34.图4示效果例1的24h荧光阳性率柱状图；其中，绿色为表达绿色荧光蛋白egfp的细胞在全部检测细胞中的占比；红色为表达红色荧光蛋白mcherry的细胞在全部检测细胞中的占比；
35.图5示效果例1的24h平均荧光强度柱状图；其中，绿色为绿色荧光蛋白egfp的平均荧光强度；红色为红色荧光蛋白mcherry的平均荧光强度；
36.图6示效果例1的48h荧光阳性率柱状图；其中，绿色为表达绿色荧光蛋白egfp的细胞在全部检测细胞中的占比；红色为表达红色荧光蛋白mcherry的细胞在全部检测细胞中的占比；
37.图7示效果例1的48h平均荧光强度柱状图；其中，绿色为绿色荧光蛋白egfp的平均荧光强度；红色为红色荧光蛋白mcherry的平均荧光强度；
38.图8示效果例2的48h荧光观察图；其中：灰色为倒置荧光显微镜明场下拍摄的细胞图片；绿色为倒置荧光显微镜绿色通道拍摄图片；红色为倒置荧光显微镜红色通道拍摄图片；
39.图9示效果例2的48h荧光阳性率柱状图；其中，绿色为表达绿色荧光蛋白egfp的细胞在全部检测细胞中的占比；红色为表达红色荧光蛋白mcherry的细胞在全部检测细胞中的占比；
40.图10示效果例2的48h平均荧光强度柱状图；其中，绿色为绿色荧光蛋白egfp的平均荧光强度；红色为红色荧光蛋白mcherry的平均荧光强度；
41.图11示效果例3的48h荧光观察图；其中：灰色为倒置荧光显微镜明场下拍摄的细胞图片；绿色为倒置荧光显微镜绿色通道拍摄图片；红色为倒置荧光显微镜红色通道拍摄图片；
42.图12示效果例3的48h荧光阳性率柱状图；其中，绿色为表达绿色荧光蛋白egfp的细胞在全部检测细胞中的占比；红色为表达红色荧光蛋白mcherry的细胞在全部检测细胞中的占比；
43.图13示效果例3的48h平均荧光强度柱状图；其中，绿色为绿色荧光蛋白egfp的平均荧光强度；红色为红色荧光蛋白mcherry的平均荧光强度。
具体实施方式
44.本发明公开了核酸分子及其作为启动子的应用。
45.应该理解，表述
“……
中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
46.术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
47.应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
48.本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
49.此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
50.本发明实施例1、效果例1～效果例3中，所用原料及试剂均可由市场购得。
51.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
52.实施例1
53.(1)获得多个重组启动子，通过实验验证这些重组启动子与cmvd1以及efs启动子的表达强度差异。
54.(2)构建上游为各个重组启动子，下游为绿色荧光蛋白(egfp)基因的表达载体，载体框架如图1所示，链接为https://www.vectorbuilder.cn/vector/vb 900138-0425yph.html。通过常规的酶切连接方法将efs启动子分别替换为重组启动子。
55.(3)将各个含有重组启动子的表达载体分别与一个由ef1a驱动表达红色荧光蛋白的载体paav[exp]-ef1a》mcherry:wpre(https://en.vectorbuilder.com/vector/vb211103-1345tgg.html)质粒混匀后通过trans hi转染试剂转到293t、hela以及bhk21真核细胞中。可通过红色荧光的阳性率和表达强度对比观察每个实验组的转染效率是否基本一致。
[0056]
(4)分别在转染24和48h后，使用荧光显微镜进行观察记录，并通过流式分析各个重组启动子对应的荧光表达情况来统计各个重组启动子和对照启动子表达强弱情况。
[0057]
效果例1
[0058]
20ng实施例1获得的重组启动子载体+60ng paav[exp]-ef1a》mcherry:wpre载体转染293t细胞。
[0059]
如图2和图3所示，转染质粒24h和48h后的细胞状态、生长密度正常；各组别中红色荧光的表达情况比较一致，说明对照载体的转染表达情况差异不明显，侧面说明各组别细胞状态差异不明显；四个重组启动子表达的绿色荧光亮度在相同的实验条件下明显强于cmv d1和efs启动子，说明四个重组启动子的表达强度优于cmv d1和efs启动子。
[0060]
表124h流式统计结果
[0061][0062]
通过流式对转染24h后的细胞荧光信号差异情况进行统计分析，具体结果如表1、图4和图5所示。各组别中红色荧光细胞阳性率和平均荧光强度较为一致，四个重组启动子的绿色荧光细胞阳性率略高于cmv d1和efs启动子，对应的平均荧光强度明显高于cmv d1和efs启动子。
[0063]
表248h流式统计结果
[0064][0065]
[0066]
通过流式对转染48h后的细胞荧光信号差异情况进行统计分析，具体结果如表2、图6和图7所示。各组别中红色荧光细胞阳性率和平均荧光强度较为一致，四个重组启动子的绿色荧光细胞阳性率均高于cmv d1和efs启动子，对应的平均荧光强度明显高于cmv d1和efs启动子，与转染24h的趋势一致。
[0067]
效果例2
[0068]
100ng实施例1获得的重组启动子载体+50ng paav[exp]-ef1a》mcherr y:wpre载体转染hela细胞。
[0069]
如图8所示，转染质粒48h后的细胞状态、生长密度正常；各组别中红色荧光的表达情况比较一致，说明对照载体的转染表达情况差异不明显，侧面说明各组别细胞状态差异不明显；四个重组启动子表达的绿色荧光亮度在相同的实验条件下明显强于cmv d1和efs启动子，说明四个重组启动子的表达强度优于cmv d1和efs启动子。
[0070]
表348h流式统计结果
[0071][0072][0073]
通过流式对转染48h后的细胞荧光信号差异情况进行统计分析，具体结果如表3、图9和图10所示。各组别中红色荧光细胞阳性率和平均荧光强度较为一致，四个重组启动子的绿色荧光细胞阳性率均高于cmv d1和efs启动子，对应的平均荧光强度明显高于cmv d1和efs启动子。
[0074]
效果例3
[0075]
100ng实施例1获得的重组启动子载体+50ng ef1a》mcherry载体转染bhk21细胞。
[0076]
如图11所示，转染质粒48h后的细胞状态、生长密度正常；各组别中红色荧光的表达情况比较一致，说明对照载体的转染表达情况差异不明显，侧面说明各组别细胞状态差异不明显；四个重组启动子表达的绿色荧光亮度在相同的实验条件下明显强于cmv d1和efs启动子，说明四个重组启动子的表达强度优于cmv d1和efs启动子。
[0077]
表448h流式统计结果
[0078][0079][0080]
通过流式对转染48h后的细胞荧光信号差异情况进行统计分析，具体结果如表4、图12和图13所示。各组别中红色荧光细胞阳性率和平均荧光强度较为一致，四个重组启动子的绿色荧光细胞阳性率均高于cmv d1和efs启动子，对应的平均荧光强度明显高于cmv d1和efs启动子。
[0081]
综上，实施例1获得的不同重组启动子对比cmvd1以及efs，在不同细胞中均表现出更高的表达强度，可以驱动目的基因更好地表达。
[0082]
使用相同质量的相同质粒共转染作为内参观察细胞转染和表达状态是否相对一致，不同组中的红色荧光阳性率和均值差异在较小范围内波动，排除实验误差。不同组别的细胞图片均在相同的条件下拍摄，直接通过图片的绿色荧光亮度即可观察到实施例1获得的四个重组启动子、cmvd1和efs的表达强度，再通过流式细胞仪对细胞不同荧光亮度进行量化分析，即可获得更为准确的数据进行比较。在293t、hela细胞和bhk21中，实施例1获得的四个重组启动子对应的绿色荧光蛋白表达量和阳性率都高于cmvd1和efs，在293t和hela细胞中尤为显著。四个重组启动子具有能够在更多的细胞中驱动绿色荧光蛋白表达的能力，以及这种驱动作用比cmvd1、efs更强。
[0083]
此外，实施例1获得的四个重组启动子的长度与efs相似，但在三种常用细胞系中表达强度均强于efs，合适广泛应用于真核表达系统，保证目的基因有较强表达的同时能够节约出更多的目的基因装载空间，适合广泛应用于各种病毒载体和非病毒载体系统中。
[0084]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.核酸分子，其特征在于，其具有：(1)、如seq id no:1～seq id no:4任意所示的核苷酸序列；或(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列；或(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的大小不大于400bp。3.如权利要求1或2所述的核酸分子作为启动子的应用。4.转录元件，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的核酸分子和目的基因。5.如权利要求4所述的转录元件，其特征在于，还包括荧光蛋白。6.表达载体，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的核酸分子或如权利要求4或5所述的转录元件。7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，包括病毒载体或非病毒载体。8.宿主，其特征在于，转化或转染如权利要求6或7所述的表达载体。9.如权利要求8所述的宿主，其特征在于，包括真核细胞。10.如权利要求1或2所述的核酸分子、如权利要求4或5所述的转录元件、如权利要求6或7所述的表达载体或如权利要求8或9所述的宿主在真核表达系统中的应用。

技术总结
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及核酸分子及其作为启动子的应用。本发明提供了核酸分子，具有：如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4任意所示的核苷酸序列；或与所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列；或与所述核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸序列。本发明提供的启动子，与现有的常用短版本启动子相比，能够在提高目的基因在真核细胞中的表达，在某些对目的基因表达量要求较高但又有启动子长度限制的场景下有较强的应用价值。下有较强的应用价值。


技术研发人员：蓝田 肖晓丹 施金秀
受保护的技术使用者：云舟生物科技（广州）股份有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/8/9