柑橘渣中柚皮苷的制备及其在减少动物脂肪沉积中的应用的制作方法

1.本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种柑橘渣中柚皮苷的制备及其在减少动物脂肪沉积中的应用。


背景技术：

2.柑橘渣是柑橘类水果加工后剩余的副产物，含有多种生物活性物质。我国每年会产生大量的柑橘渣，大部分柑橘渣通过填埋等方式处理，利用率非常低。柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物，广泛存在于橘柚等植物果实和果皮中，具有抗血脂、抗氧化、抗癌和改善代谢等多种生物学活性。目前，从橘柚中提取柚皮苷的方法主要采取溶剂萃取法、超声波提取法和微波辅助提取法等，但传统柚皮苷提取工艺产品纯度低，需要多步法提取，溶剂、能量消耗大，且柚皮苷的提取率普遍不高。现有的柚皮苷一般从柚皮中提取，由于柚皮中柚皮苷含量高，因此一般采用单一提取法，如溶剂萃取法、碱提酸沉法、超声波提取法、微波提取法等就能得到较高得率的柚皮苷，但柑橘渣中柚皮苷含量低，提取难度更大，提取技术需要进一步优化。目前尚未有一种能高效提取柑橘渣中柚皮苷的方法。
3.边清泉等发现柚皮中柚皮苷质量分数为7.5％左右，而橙橘果皮柚皮苷质量分数约为0.55～0.84％，可见看出，柑橘渣和柚皮的柚皮苷含量差异较大，柚果中柚皮苷含量是柑橘的十倍左右。并且由于柑橘渣中柚皮苷本身含量低，不易提取，因此，需要建立更有效的提取方法才能将柑橘渣中柚皮苷进行高效的提取。吴锦辉等采取酶解和乙醇超声法提取柚皮中的柚皮苷，柚皮苷提取率最高为18.1％，但未进行纯化分离，因此柚皮苷的得率不高。现有技术中少见从橙橘果皮中提取柚皮苷的技术手段。
4.同时，脂肪是动物体内重要的能量物质，是构成细胞膜系统的主要成分，能够转变为多种生理活性分子参与机体不同生理生化反应，研究脂肪代谢及其调控具有重要意义。有报道证实畜禽饲粮中添加柚皮苷能提高鸡的抗氧化性能，添加柚皮苷还能减少羔羊热应激，提高肝脏丙二醛水平。但目前有关柚皮苷对动物脂肪沉积的作用相关研究尚属空白，无相关技术报道，柚皮苷作为降脂药物的功能也亟待开发。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种提取柑橘渣中的柚皮苷的方法，本发明通过酶解-乙醇-超声波高效提取，再用大孔树脂纯化，实现了柑橘渣中的柚皮苷的高纯度和高得率提取，且方法可用于大规模工业化生产。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种提取柑橘渣中的柚皮苷的方法，包括以下步骤：
8.(1)以废弃的柑橘渣为原料，加入复合酶进行酶解，获得浸提液；
9.(2)在步骤(1)所得浸提液中加入乙醇，采用超声波进行粗提，获得柚皮苷粗提液；
10.(3)利用大孔树脂纯化柱纯化步骤(2)所得柚皮苷粗提液，获得柚皮苷产物。
11.进一步，所述废弃的柑橘渣采集自橙汁厂。
12.进一步，步骤(1)中，所述柑橘渣经烘干、粉碎、过筛获得柑橘渣粉；所述柑橘渣粉加入热水，经震荡混匀、冷却、调节ph后再加入复合酶；所述柑橘渣粉和所述热水的质量比为1：4。
13.作为优选，所述过筛为过40目筛。
14.作为优选，所述热水为80℃。
15.作为优选，所述冷却为冷却温度至30℃左右。
16.作为优选，ph调节为5。
17.进一步，步骤(1)中，所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶组成；所述纤维素酶酶活》5万u/g，所述半纤维素酶酶活》5万u/g，所述蛋白酶酶活》6万u/g；柑橘渣粉、所述纤维素酶、所述半纤维素酶和所述蛋白酶的质量比为1：0.03-0.04：0.03-0.04：0.01-0.02。
18.步骤(1)中，所述酶解时间为1.5h-3h。
19.进一步，步骤(1)中，在50℃水浴锅中进行酶解。
20.进一步，步骤(2)中，料液比为1:11-1:24，提取时间为1.5h-3h，温度为60℃-80℃，超声波频率为300w-500w。
21.进一步，浸提液中加入乙醇后，溶液中乙醇体积分数优选为60％。
22.进一步，步骤(3)中，所述柚皮苷粗提液先通过大孔树脂纯化柱，吸附后采用naoh进行洗脱，得到柚皮苷溶液；所述柚皮苷溶液经冻存过夜、冷冻干燥、粉碎，获得柚皮苷产物。
23.进一步，所述柚皮苷粗提液通过大孔树脂纯化柱的流速为0.5bv/h-1bv/h；所述吸附的时间为2.5h-4h。
24.作为优选，所述naoh的浓度为0.05mol/l-0.1mol/l。
25.进一步，所述柚皮苷溶液经冻存过夜、冷冻干燥、粉碎，获得柚皮苷产物。
26.进一步，所述冻存温度为-80℃。
27.进一步，所述冷冻干燥为用冷冻真空干燥机在-50℃条件下进行冷冻干燥；干燥时间为24h-48h。
28.本发明的目的之二在于提供一种柚皮苷在制备用于减少猪只脂肪沉积的饲料添加剂和/或饲料中的应用。
29.本发明还发现柚皮苷可有效调控猪只背部和腹部脂肪组织脂肪代谢基因，包括过氧化物酶体增殖物激活受体(pparγ)、脂肪酸转运蛋白(fatp1)、脂肪酸合成酶(fas)等脂肪合成调控因子和脂肪甘油三酯脂肪酶(atgl)和激素敏感脂酶(hsl)等脂肪动员调控因子的表达水平。
30.本发明的目的之三在于提供柚皮苷在制备降低猪只腹部脂肪pparγ、fas、fatp1和背部脂肪pparγ、fatp1的mrna表达水平的产品中的应用。
31.柚皮苷能显著降低腹部脂肪pparγ和fas的mrna表达水平。
32.进一步，所述产品包括饲料添加剂、饲料和/或药物。
33.本发明的目的之四在于提供柚皮苷在制备提高猪只腹部/背部脂肪atgl、hsl的mrna表达水平的产品中的应用。
34.进一步，所述产品包括饲料添加剂、饲料和/或药物。
35.本发明研究发现，柚皮苷能显著提高腹部脂肪atgl和hsl以及背部脂肪atgl的
mrna表达水平。
36.本发明的目的之五在于提供一种柚皮苷在制备用于改善猪只生产性能的饲料添加剂和/或饲料中的应用。
37.本发明研究发现，猪饲粮中添加柚皮苷显著提高猪只平均日增重和瘦肉率，显著降低板油重，有效改善了猪只的生产性能。
38.本发明的有益效果在于：
39.(1)本发明利用榨取橘汁后的废弃物—柑橘渣作为原料，一定程度上提高了柑橘渣的附加值并产生了额外的商业效益。
40.(2)本技术通过酶解-乙醇-超声提取法得到柑橘渣中柚皮苷粗提物，再利用大孔树脂进行纯化获得产量和纯度均较高的柚皮苷产物。本发明提供的方法简单，且能获得柑橘渣中约90％的柚皮苷，大大提高了提取效率和柑橘渣的利用率，且易于产业化。
41.(3)本发明研究发现，柚皮苷提取物能显著提高育肥猪日增重和瘦肉率，并降低腹部脂肪沉积，柚皮苷显著降低腹部脂肪pparγ和fas的mrna表达水平，显著提高腹部脂肪atgl和hsl以及背部脂肪atgl的mrna表达水平。本发明证明了柚皮苷是通过调节脂肪代谢基因来减少猪只脂肪沉积，说明其具有作为饲料添加剂的潜力。
附图说明
42.图1为柚皮苷对猪脂肪合成调控因子表达水平的影响结果图；
43.图2为柚皮苷对猪脂肪动员因子表达水平的影响结果图。
44.图1-图2中，*表示：p值《0.05。
具体实施方式
45.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
46.本发明实施例中，柚皮苷含量的测定方法如下：
47.称取柚皮苷对照品20mg，加甲醇溶解定容至10ml，用甲醇逐级稀释，得到质量浓度为10.0、25.0、50.0、100.0和200.0μg/ml的标准工作溶液，采用hplc定量分析方法测定柑橘渣粉以及提取物中柚皮苷的含量。
48.柚皮苷得率＝柚皮苷产物重量/原料重量
×
原料柚皮苷含量
×
100％。
49.实施例1
50.橙汁厂采集废弃的柑橘渣，带回实验室后烘干并粉碎，过40目筛，称取50g柑橘渣粉末，加入200ml 80度热水浸润震荡混匀半小时，调节ph到5，将复合酶(纤维素酶酶活》5万u/g、半纤维素酶酶活》5万u/g、蛋白酶酶活》6万u/g，纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶的用量分别为2g、1.5g和1g)加入柑橘渣粉溶液中，在50℃震荡培养箱中震荡混匀半小时后，在50℃水浴锅中酶解2h。随后，在浸提液中加入375ml无水乙醇，使得溶液乙醇体积分数60％，料液比约为1:11，随后在温度80℃，超声波频率500w的条件下提取1.5h。
51.将大孔树脂hpd600和hpd100用95％的乙醇浸泡预处理后装柱，采用动态吸附法将
得到的柚皮苷浸提液以0.5bv/h的流速通过纯化柱，吸附3h后用0.1mol/l的naoh洗脱，得到的柚皮苷提取液先用旋转蒸发方法除去大部分溶剂得到浓缩液，浓缩液在-80℃冰箱预冻过夜，用冷冻真空干燥机在-50℃条件下进行干燥，24-48小时后取出沉淀物并进行粉碎，获得柚皮苷产物，其含量为0.208g，得率为90.43％。将得到的柚皮苷产物室温保存待用。
52.实施例2
53.橙汁厂采集废弃的柑橘渣，带回实验室后烘干并充分粉碎，过40目筛，称取50g柑橘渣粉末，加入200ml 80度热水浸润震荡混匀半小时，调节ph到5，将复合酶(纤维素酶酶活》5万u/g、半纤维素酶酶活》5万u/g、蛋白酶酶活》6万u/g，纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶的用量分别为1.5g、2g和1g)加入到柑橘渣粉溶液中，在50℃震荡培养箱中震荡混匀半小时后，在50℃水浴锅中酶解1.5h。随后，在浸提液中加入0.6l无水乙醇，使得溶液乙醇体积分数70％，料液比约为1:16，随后在温度70℃，超声波频率500w的条件下提取1.5h。
54.将大孔树脂hpd600和hpd100用95％的乙醇浸泡预处理后装柱，将得到的柚皮苷浸提液以0.75bv/h的流度通过大孔树脂纯化柱，吸附2.5h后用0.1mol/l naoh洗脱，得到的柚皮苷溶液先用旋转蒸发方法除去大部分溶剂得到浓缩液，浓缩液在-80℃冰箱预冻过夜，然后用冷冻真空干燥机在-50℃条件下进行干燥，24-48小时后取出沉淀物并充分粉碎，获得柚皮苷产物，其含量为0.1905g，得率为82.83％。将得到的柚皮苷产物室温保存待用。
55.实施例3
56.橙汁厂采集废弃的柑橘渣，带回实验室后烘干并充分粉碎，过40目筛，称取50g柑橘渣粉末，加入200ml 80度热水浸润震荡混匀半小时，调节ph到5，将复合酶(纤维素酶酶活》5万u/g、半纤维素酶酶活》5万u/g、蛋白酶酶活》6万u/g，纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶的用量分别为2g、2g和0.5g)加入到柑橘渣粉溶液中，在50℃震荡培养箱中震荡混匀半小时后，在50℃水浴锅中酶解3h。随后，在浸提液中加入2l无水乙醇，使得溶液乙醇体积分数80％，料液比约为1:50，随后在温度80℃，超声波频率500w的条件下提取2h。
57.将大孔树脂hpd600和hpd100用95％的乙醇浸泡预处理后装柱，将得到的柚皮苷浸提液以1bv/h的流度通过大孔树脂纯化柱，吸附4h后用0.1mol/l naoh洗脱，得到的柚皮苷溶液用冷冻真空干燥机在-50℃条件下进行冷冻干燥，24小时后取出沉淀物并进行粉碎，获得柚皮苷产物，其含量为0.189g，得率为82.17％。将得到的柚皮苷产物室温保存待用。
58.实施例4
59.本实施例与实施例1的区别仅在于柑橘渣提取时间为2h，超声波频率为400w，大孔树脂吸附时间为2.5h。所得柚皮苷含量为0.1835g，得率为79.78％。
60.实施例5
61.本实施例与实施例1的区别仅在于柑橘渣提取时间为3h，超声波频率300w，大孔树脂吸附时间为4h。所得柚皮苷含量为0.1915g，得率为83.26％。
62.实施例6
63.本实施例与实施例2的区别仅在于柑橘渣提取时间为2h，超声波频率400w，大孔树脂吸附时间为2.5h。所得柚皮苷含量为0.1825g，得率为79.35％。
64.实施例7
65.本实施例与实施例2的区别仅在于柑橘渣提取时间为3h，超声波频率300w，大孔树脂吸附时间为4h。所得柚皮苷含量为0.1855g，得率为80.65％。
66.实施例8
67.本实施例与实施例3的区别仅在于柑橘渣提取时间为2h，超声波频率400w，大孔树脂吸附时间为2.5h。所得柚皮苷含量为0.1725g，得率为75.00％。
68.实施例9
69.本实施例与实施例3的区别仅在于柑橘渣提取时间为3h，超声波频率300w，大孔树脂吸附时间为4h。所得柚皮苷含量为0.157g，得率为68.26％。
70.对比例1
71.去掉复合酶处理步骤，其他同实例1。所得柚皮苷含量为0.130g，得率为56.52％。
72.实施例1-9、对比例1中原料重量、原料柚皮苷含量、柚皮苷产物产量和得率数据如表1所示。
73.表1.实施例1-9、对比例1的数据总结表
74.原料重量原料柚皮苷含量柚皮苷产物产量柚皮苷得率实施例150g4.6mg/g0.208g90.43％实施例250g4.6mg/g0.1905g82.83％实施例350g4.6mg/g0.189g82.17％实施例450g4.6mg/g0.1835g79.78％实施例550g4.6mg/g0.1915g83.26％实施例650g4.6mg/g0.1825g79.35％实施例750g4.6mg/g0.1855g80.65％实施例850g4.6mg/g0.1725g75.00％实施例950g4.6mg/g0.157g68.26％对比例150g4.6mg/g0.130g56.52％
75.实施例10.柚皮苷提取物在猪上的应用
76.1.柚皮苷产物对生长育肥猪脂肪沉积的影响
77.采用本发明实施例1的方法，制备足量的柚皮苷产物。然后选用平均体重为75kg生长育肥猪48头，随机分为2组(每组6个重复，每个重复4头猪，公母各半)。对照组饲喂基础饲粮，柚皮苷组饲喂含0.5g/kg柚皮苷提取物的基础饲粮。本发明所述饲料中含柚皮苷的量是0.25-1g/kg，优选0.5g/kg，试验期为30天。试验期间，猪只自由采食和饮水。由表2可知，猪饲粮中添加柚皮苷显著提高猪只平均日增重和瘦肉率(p《0.05)，显著降低板油重(p《0.05)，平均日采食量提高了5.1％(p《0.1)，料重比降低了4.2％(p》0.05)。
78.表2.柚皮苷粗提物对生长育肥猪生长性能和胴体性状的影响
79.[0080][0081]
注：数据用平均值
±
标准差表示；肩标小写字母不同表示差异显著(p《0.05)。
[0082]
2.柚皮苷对猪只脂肪代谢的影响
[0083]
采用定量pcr检测猪背部和腹部脂肪组织脂肪代谢基因，包括脂肪合成调控因子(过氧化物酶体增殖物激活受体pparγ、脂肪酸转运蛋白fatp1、脂肪酸合成酶fas)和脂肪动员调控因子(脂肪甘油三酯脂肪酶atgl和激素敏感脂肪酶hsl)的表达水平。结果如图1和图2所示，结果表明，柚皮苷显著降低腹部脂肪pparγ和fas的mrna表达水平(p《0.05)，显著提高腹部脂肪atgl和hsl以及背部脂肪atgl的mrna表达水平(p《0.05)，说明柚皮苷能调节猪脂肪组织的脂肪代谢，结果表明柚皮苷是通过影响脂肪组织脂肪合成基因和脂肪动员因子来调节脂肪代谢，减少猪只脂肪沉积。

技术特征：
1.一种提取柑橘渣中的柚皮苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以废弃的柑橘渣为原料，加入复合酶进行酶解，获得浸提液；(2)在步骤(1)所得浸提液中加入乙醇，采用超声波进行粗提，获得柚皮苷粗提液；(3)利用大孔树脂纯化柱纯化步骤(2)所得柚皮苷粗提液，获得柚皮苷产物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶组成；所述纤维素酶酶活>5万u/g，所述半纤维素酶酶活>5万u/g，所述蛋白酶酶活>6万u/g；柑橘渣粉、所述纤维素酶、所述半纤维素酶和所述蛋白酶的质量比为1：0.03-0.04：0.03-0.04：0.01-0.02。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酶解时间为1.5h-3h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，料液比为1:11-1:24，提取时间为1.5h-3h，温度为60℃-80℃，超声波频率为300w-500w。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述柚皮苷粗提液先通过大孔树脂纯化柱，吸附后采用naoh进行洗脱，得到柚皮苷溶液；所述柚皮苷溶液经冻存过夜、冷冻干燥、粉碎，获得柚皮苷产物。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述柚皮苷粗提液通过大孔树脂纯化柱的流速为0.5bv/h-1bv/h；所述吸附的时间为2.5h-4h。7.柚皮苷在制备用于减少猪只脂肪沉积的饲料添加剂和/或饲料中的应用。8.柚皮苷在制备降低猪只腹部脂肪pparγ、fas、fatp1和背部脂肪pparγ、fatp1的mrna表达水平的产品中的应用。9.柚皮苷在制备提高猪只腹部/背部脂肪atgl、hsl的mrna表达水平的产品中的应用。10.柚皮苷在制备用于改善猪只生产性能的饲料添加剂和/或饲料中的应用。

技术总结
本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种柑橘渣中柚皮苷的制备及其在减少动物脂肪沉积中的应用。本发明发现柚皮苷可有效调控猪只背部和腹部脂肪组织脂肪代谢基因,包括显著降低腹部脂肪PPARγ和FAS的mRNA表达水平，显著提高腹部脂肪ATGL和HSL和背部脂肪ATGL的mRNA表达水平，从而减少猪只脂肪沉积。柚皮苷的制备方法为：以废弃的柑橘渣为原料，加入由纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶组成的复合酶进行酶解，获得浸提液，随后加入乙醇，采用超声波进行粗提；再利用大孔树脂纯化柱纯化柚皮苷粗提液，获得柚皮苷产物。该提取方法简单，产物产量高、纯度高，大大提高了提取效率和柑橘渣的利用率，且易于产业化。且易于产业化。且易于产业化。


技术研发人员：王琪 齐仁立 王敬 邱小宇
受保护的技术使用者：生猪技术创新中心（重庆）
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/8/9