本氏烟m6A甲基化酶基因在抗病毒中的应用

本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体是指本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用。


背景技术：

2.rna上存在多种化学修饰形式，如6-甲基腺嘌呤（英文简写为：m6a）、5-甲基胞嘧啶、1-甲基腺嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶和假尿嘧啶等，其中，m6a是rna中最丰富的化学修饰，其发生于腺嘌呤的第6位氮原子上，是真核生物中常见的转录后修饰形式，也是rna表观遗传方面的研究热点；m6a不仅存在于mrna上，还广泛分布于转运rna、核糖体rna、非编码小rna和长链非编码rna等各类rna上；m6a可以调节mrna的剪接、出核、定位、翻译和稳定等多种生物学过程，并且可遗传给后代；m6a是一个动态可逆的平衡过程，受到甲基化酶(编写蛋白)，去甲基化酶(擦除蛋白)和甲基化结合蛋白(读取蛋白)的共同调控；研究证据表明，m6a修饰涉及真核生物细胞过程，包括胚胎发育、干细胞分化、精子发生、细胞应激、昼夜节律、癌症发生等。
3.在哺乳动物中，m6a甲基化酶主要有mettl3、mettl14、wtap、kiaa1429等，这些蛋白可形成复合物行使生物学功能，如mettl3是m6a形成的催化亚基，而mettl14可提供rna结合支架来增强mettl3的催化活性，二者单独作用时催化活性较弱，在形成复合物时表现出较高的催化活性，在拟南芥中鉴定出的mta是人类mettl3的同源蛋白，与性别特异性剪接因子相互作用，对拟南芥的生长发育至关重要，而mtb是拟南芥中鉴定出的人类mettl14同源蛋白，可能在拟南芥中表现出酶活性，在诱导型mtb rnai系中，m6a水平降低至50%，拟南芥fip37蛋白是wtap的植物同源物，可与mta相互作用，对介导关键茎分生组织基因m6a修饰至关重要，拟南芥virilizer-1突变体中的m6a水平降低至约10%，该突变体侧根和根冠的形成以及子叶发育均呈现异常状态，然而，现有技术未见报道直接将本氏烟m6a甲基化酶基因应用于抗病毒中。


技术实现要素：

4.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明公开了本氏烟m6a甲基化酶基因在植物抗病毒中的应用，将本氏烟m6a甲基化酶基因导入目的植物中，从而提高本氏烟m6a甲基化酶基因编码蛋白在目的植物中的表达，本发明的本氏烟m6a甲基化酶基因可有效抑制病毒蛋白的累积，从而有效抑制病毒感染。
5.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，所述应用为以下任一一种在抗病毒的应用：（1）m6a甲基化酶基因；（2）m6a甲基化酶基因所编码的蛋白质，即m6a甲基化酶；（3）含有m6a甲基化酶基因基因的重组载体。
6.优选地，所述m6a甲基化酶基因包括nbmettl1和nbmettl2，所述m6a甲基化酶包括
nbmettl1蛋白质和nbmettl2蛋白质。
7.进一步地，所述m6a甲基化酶基因来源于本氏烟。
8.进一步地，所述nbmettl1蛋白质是氨基酸序列如seq idno:1所示的蛋白质，所述nbmettl2蛋白质是氨基酸序列如seq idno:2所示的蛋白质，或者是将seq id no:1和seq idno:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的保守取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
9.进一步地，所述nbmettl1是核苷酸序列如seq idno:3所示的dna分子，所述nbmettl2是核苷酸序列如seq idno:4所示的dna分子，或者是与seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码m6a甲基化酶蛋白质的dna分子。
10.进一步地，所述病毒为植物病毒。
11.优选地，所述植物病毒为黄瓜花叶病毒cmv、花椰菜花叶病毒camv、烟草花叶病毒tmv和水稻条纹病毒rsv中的一种。
12.此外，本发明还提供了一种培育抗病毒转基因植物的方法，所述方法为将m6a甲基化酶基因导入目的植物中。
13.通过常规的转化或转染技术，可以将m6a甲基化酶基因或其活性片段或包含m6a甲基化酶基因的重组表达载体导入植物细胞，得到转基因植物细胞，并进一步得到过量表达m6a甲基化酶基因或其活性片段的转基因植物。
14.本领域技术人员应该理解，获得过表达或者诱导表达m6a甲基化酶基因的植株可以通过转基因技术实现，例如，通过农杆菌介导的转染、质粒转化、直接dna转化、微注射等技术实现。
15.本发明利用转基因技术，将m6a甲基化酶基因导入植物细胞，由此获得广谱抗病毒的转基因植物。
16.优选地，所述目的植物为双子叶或单子叶植物，在本发明中优选地，所述目的植物为本氏烟。
17.优选地，所述植物病毒为李痘病毒ppv、黄瓜花叶病毒cmv、花椰菜花叶病毒camv、烟草花叶病毒tmv和水稻条纹病毒rsv中的一种。
18.携带有本发明m6a甲基化酶基因的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株，被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜、棉花等双子叶植物。
19.通过对转化m6a甲基化酶基因后所得到的转基因本氏烟，我们证明诱导表达m6a甲基化酶基因可以显著抑制病毒的感染。
20.本发明取得的有益效果如下：本发明公开了本氏烟m6a甲基化酶基因在植物抗病毒中的应用，本发明还公开了一种培育抗病毒转基因植物的方法，该方法将本氏烟m6a甲基化酶基因导入目的植物中，从而提高本氏烟m6a甲基化酶基因编码蛋白在目的植物中的表达，本发明的本氏烟m6a甲基化酶基因可有效抑制病毒蛋白的累积，从而有效抑制病毒感染，实现了将m6a甲基化酶基因直接应用于病毒的抑制技术效果；rna上存在多种化学修饰形式，n6-腺苷甲基化(m6a)是真核生物mrna中最丰富的
内部化学修饰，也是目前研究最透彻的一种rna修饰类型。m6a修饰能够影响rna在细胞中的降解以及转录后加工等多种生物学过程，是一个可逆的动态过程，受到甲基化酶、去甲基化酶和甲基化结合蛋白的共同调节，其中，甲基化酶具有重要的调节生物生长发育的功能，本发明基于前期的转录组测序数据，对本氏烟中的mettl基因进行克隆，在本氏烟中瞬时表达nbmettl后摩擦病毒，发现病毒表达量比对照植物显著下降；本试验以健康本氏烟的cdna为模板对本氏烟中的甲基化酶进行基因克隆，为后期本氏烟mettl基因的功能鉴定及其作用机制研究奠定一定的理论基础。
附图说明
21.图1为本氏烟m6a甲基化酶基因nbmettl1和nbmettl2扩增的凝胶电泳图；图2为bp反应后菌液pcr验证结果图；图3为lr反应后菌液pcr验证结果图；图4为过表达本氏烟m6a甲基化酶基因nbmettl1和nbmettl2后病毒的积累量。
22.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本技术的内容。
25.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料及试验菌株，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
26.材料与方法1.1 试验材料植物材料：本氏烟(nicotiana benthamiana)为为内蒙古农业大学植物病毒研究室保存，也可以通过商业途径购买。菌株：escherichia coli dh5α，农杆菌：c58c1(agrobacterium)。载体：pmd19-t；pdonr207和peaq-ht-dest1为内蒙古农业大学植物病毒研究室保存，也可以通过商业途径购买。
27.1.2 分子生物学试剂taq酶、dntp混合物、高保真酶、t-a克隆载体和感受态细胞e.coli dh5α购自takara公司；限制性内切酶(sma i)购自neb公司；1kb plus dna ladder marker、质粒小提试剂盒购自tiangen公司；dna胶回收试剂盒购自aidlab公司；总rna提取试剂盒、cdna合成试剂盒购自promega公司；gateway bp酶混合物、gateway lr酶混合物购自invitrogen公司。
28.实施例1
本氏烟m6a甲基化酶基因nbmettl的克隆依据tiangen trnzol universal总rna提取试剂盒说明书提取健康本氏烟的rna，参照goscripttm reverse transcription system (a5001)试剂盒的操作步骤反转录合成cdna，-20℃保存备用。使用引物序列(5
’‑3’
)为：nbmettl1_f:atgaagttcacagaatcgccg；nbmettl1_r:ctacagtcgcagcagaacag；nbmettl2_f:atggagcaagacaggttaaattc；nbmettl2_r:ttatgttatcttgacatcacg。
29.以cdna为模板，利用引物进行扩增nbmettl1和nbmettl2，pcr反应体系(50μl)如表1所示。
30.表1 克隆本氏烟m6a甲基化酶基因pcr反应体系pcr循环参数：98℃变性3min；然后进行29个pcr循环：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min，4℃保存。pcr结束后，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后放入凝胶成像系统中观察是否有目标条带。从琼脂糖凝胶上切下含有目的基因片段的凝胶，根据aidlab公司琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒说明书中的操作步骤回收扩增产物。
31.以本氏烟的cdna为模板，用目的基因的引物进行pcr扩增，将pcr产物全部电泳并纯化回收，nbmettl1的核苷酸序列如seq id no:3所示，nbmettl2的核苷酸序列如seq id no:4所示，结果如图1所示，在nbmettl1和nbmettl2分别在858bp和933bp的位置有明亮的目标条带。
32.实施例2本氏烟m6a甲基化酶基因nbmettl克隆载体的构建将实施例1中pcr纯化回收产物连接到pmd19-t载体上，连接体系如表2所示。
33.表2本氏烟m6a甲基化酶基因nbmettl克隆载体连接体系
ht-dest1-nbmettl1和peaq-ht-dest1-nbmettl2载体。菌液pcr结果如图3所示，条带大小正确。
39.实施例4本氏烟m6a甲基化酶基因nbmettl在本氏烟中的表达将实施例3获得的peaq-ht-dest1-nbmettl1和peaq-ht-dest1-nbmettl2载体分别转化至农杆菌c58c1感受态细胞，将平板上长出的单菌落接种于1ml含rif和kan的lb液体培养基中，28℃过夜培养；将过夜培养的菌液转接于新的lb液体培养基中扩繁，28℃过夜培养。后将菌液转移到50ml离心管，4000rpm离心15min，弃上清；菌体沉淀用诱导缓冲液（ib buffer：0.5m mes，1m mgcl2，0.1m乙酰丁香酮）悬浮；室温静置3h，测od
600
；接种时，将1ml的一次性注射器去掉针头，吸取菌液，在叶片背面无叶脉处扎孔，左手在叶片另一面拖住叶片上扎孔处，将菌液轻轻注射进叶片，待菌液扩散至整个叶片后即停止注射；注射后的本氏烟覆膜在暗处培养，1d后将膜去掉并转移到光下培养。
40.试验例本氏烟m6a甲基化酶基因nbmettl在本氏烟中的表达对病毒侵染的影响将摩擦病毒后发病的植物叶片组织采样后在液氮中研磨，于-80℃保存。摩擦接种前，将研磨物取出，按照1:2的比例加入ph值为7.2的磷酸缓冲液，混合均匀。在本氏烟的系统叶上均匀的撒上石英砂，取20μl病毒粗提液于系统叶上，用食指轻轻摩擦叶片。
41.如图4所示，注射nbmettl后第2天摩擦接种李痘病毒（拉丁名：plum pox virus，简称为ppv），结果发现在瞬时表达nbmettl1和nbmettl2后病毒积累量明显降低。
42.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
43.以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的应用并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，其特征在于：所述应用为以下任一一种在抗病毒的应用：（1）m6a甲基化酶基因；（2）m6a甲基化酶基因所编码的蛋白质，即m6a甲基化酶；（3）含有m6a甲基化酶基因的重组载体。2.根据权利要求1所述的本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，其特征在于：所述m6a甲基化酶基因包括nbmettl1和nbmettl2，所述m6a甲基化酶包括nbmettl1蛋白质和nbmettl2蛋白质。3.根据权利要求2所述的本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，其特征在于：所述m6a甲基化酶基因来源于本氏烟。4.根据权利要求3所述的本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，其特征在于：所述nbmettl1蛋白质是氨基酸序列如seq idno:1所示的蛋白质，所述nbmettl2蛋白质是氨基酸序列如seq idno:2所示的蛋白质，或者是将seq id no:1和seq idno:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的保守取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。5.根据权利要求4所述的本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，其特征在于：所述nbmettl1是核苷酸序列如seq idno:3所示的dna分子，所述nbmettl2是核苷酸序列如seq idno:4所示的dna分子，或者是与seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码m6a甲基化酶蛋白质的dna分子。6.根据权利要求5所述的本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为植物病毒。7.根据权利要求6所述的本氏烟m6a甲基化酶基因在抗病毒中的应用，其特征在于：所述植物病毒为黄瓜花叶病毒cmv、花椰菜花叶病毒camv、烟草花叶病毒tmv和水稻条纹病毒rsv中的一种。8.一种培育抗病毒转基因植物的方法，其特征在于：所述方法为将m6a甲基化酶基因导入目的植物中。9.根据权利要求8所述的一种培育抗病毒转基因植物的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶或单子叶植物。10.根据权利要求9所述的一种培育抗病毒转基因植物的方法，其特征在于：所述植物病毒为黄瓜花叶病毒cmv、花椰菜花叶病毒camv、烟草花叶病毒tmv和水稻条纹病毒rsv中的一种。

技术总结
本发明公开了本氏烟m6A甲基化酶基因在抗病毒中的应用，属于植物基因工程技术领域，所述m6A甲基化酶基因包括NbMETTL1和NbMETTL2，所述m6A甲基化酶包括NbMETTL1蛋白质和NbMETTL2蛋白质，所述NbMETTL1蛋白质是氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示的蛋白质，所述NbMETTL2蛋白质是氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示的蛋白质，将本氏烟m6A甲基化酶基因导入目的植物中，从而提高本氏烟m6A甲基化酶基因编码蛋白在目的植物中的表达，本发明的本氏烟m6A甲基化酶基因可有效抑制病毒蛋白的累积，从而有效抑制病毒感染。病毒感染。病毒感染。


技术研发人员：赵明敏 岳建英 王海娟 赵健 赵倩倩 杨向东 周洪友 王东 东保柱 郭宇晴 张荠丹
受保护的技术使用者：内蒙古农业大学
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/8/9