芦花鸡的鉴定方法

1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种芦花鸡的鉴定方法。


背景技术：

2.芦花鸡以黑白相间的横斑羽而闻名，该性状是由位于性染色体z的伴性基因调控，该基因为不完全显性基因，具有剂量效应。芦花鸡具有较强的活动能力，善飞行，耐粗饲，抗病性强。此外，芦花鸡认巢性强，食物种类多样，适合在多种生态环境下进行散养。芦花鸡我国典型的优质肉蛋兼用型地方鸡，年产蛋可达150枚左右，蛋黄大、蛋品质较好。成年鸡体重在3斤左右，肉质细密，风味独特，而且皮下脂肪较少，具备一定滋补保健作用。目前，芦花鸡在全国各地均有养殖，但养殖规模普遍较小，生产效率较低，选育工作处于起步阶段。而现有小规模的养殖模式，管理方式较落后，增加了芦花鸡繁种时掺入混杂血缘的可能，导致后代血缘不纯。
3.血缘纯正是选育工作的前提，保证芦花鸡血缘纯正是开展地方鸡选育的先决条件。传统通过外貌形态、生活习性等方式鉴定鸡种的方法难以判断血缘纯合度，误差较大。基于高通量测序技术鉴定特异性分子标签，有利于更精准、高效的对大规模群体进行准确的品种鉴定，操作简单，效率更高。
4.基于不同选育方向，现有技术中已鉴定到大量现代肉鸡、蛋鸡的特异性snp标记，但多数位点呈中性状态，并未在特定品种中固定，难以形成有效的分子标签。有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种芦花鸡的鉴定方法，采用特异性snp位点进行鉴定，所述特异性snp位点均具有较高的芦花鸡鉴定准确率，基于其中一种或几种特异性snp位点进行鉴定，结果稳定、可靠。
6.具体的，本发明的技术方案如下：
7.第一方面，本发明提供了一种芦花鸡的鉴定方法，采用特异性snp位点进行鉴定，所述特异性snp位点选自位点1、位点2、位点3、位点4、位点5、位点6、位点7、位点8、位点9、位点10、位点11和位点12中的一种或者多种；
8.各snp位点基于鸡参考基因组crcg7b确定：
9.所述位点1为rs738049531，位于鸡1号染色体34050505处；
10.所述位点2为rs14878794，位于鸡1号染色体118293887处；
11.所述位点3为rs314555169，位于鸡1号染色体118558853处；
12.所述位点4为rs317860687，位于鸡2号染色体96511615处；
13.所述位点5为rs314441248，位于鸡2号染色体101442885处；
14.所述位点6为rs739519797，位于鸡3号染色体30697396处；
15.所述位点7为rs740160833，位于鸡4号染色体73672660处；
16.所述位点8为novel_lh1，位于鸡4号染色体74147515处；
17.所述位点9为novel_lh2，位于鸡5号染色体11241824处；
18.所述位点10为rs316657736，位于鸡11号染色体17337980处；
19.所述位点11为novel_lh3，位于鸡12号染色体9313841处；
20.所述位点12为rs740249350，位于鸡12号染色体9386853处。
21.本发明提供的12个特异性snp位点可各自独立地用于芦花鸡的鉴定，且鉴定率均在92.5％以上。基于其中一种或几种特异性snp位点对芦花鸡进行品种鉴定，特异性和准确率高，鉴定结果稳定、可靠。
22.本发明提供的12个特异性snp位点在芦花鸡的基因组dna中基本固定，且在芦花鸡品种中表现为单一的基因型，具体的：
23.芦花鸡在位点1的基因型为tt；
24.芦花鸡在位点2的基因型为aa；
25.芦花鸡在位点3的基因型为aa；
26.芦花鸡在位点4的基因型为cc；
27.芦花鸡在位点5的基因型为tt；
28.芦花鸡在位点6的基因型为gg；
29.芦花鸡在位点7的基因型为tt；
30.芦花鸡在位点8的基因型为aa；
31.芦花鸡在位点9的基因型为gg；
32.芦花鸡在位点10的基因型为tt；
33.芦花鸡在位点11的基因型为cc；
34.芦花鸡在位点12的基因型为aa。
35.本发明在对芦花鸡进行鉴定时，优选直接利用上述特定基因型对芦花鸡进行鉴定，可省略针对芦花鸡品种的全基因组测序及snp位点的多态性分析，进而简化鉴定流程。
36.在本发明中，所述特异性snp位点优选包括位点7和/或位点11。这些优选的snp位点具有更高的特异性和准确率，在芦花鸡样品中的鉴定率为92.5％；且在以非芦花鸡的其他鸡种(包括北京油鸡、龙游麻鸡、白耳黄鸡、东乡黑鸡、温岭草鸡等)作为待测样品时，平均鉴定率不超过1.10％。
37.在本发明优选的实施方式中，可采用特异性snp位点组合对芦花鸡进行鉴定。例如，所述特异性snp位点组合为：
38.位点1、位点5和位点10；
39.或者，位点2、位点4和位点10。
40.本发明还可以同时采用12种特异性snp位点对芦花鸡进行鉴定。12种特异性snp位点联用，能在更大范围、更多品种的样品鉴定中，使检测结果的准确率更高、特异性更好。
41.上各具体snp位点的位置信息及基因型多态性分析结果如表1所示：
42.表1芦花鸡特异性snp位点位置信息及基因型
43.snp id染色体位置基因型芦花鸡基因型rs738049531134050505g/tttrs148787941118293887a/gaa
rs3145551691118558853g/aaars317860687296511615t/cccrs3144412482101442885c/tttrs739519797330697396a/gggrs740160833473672660c/tttnovel_lh1474147515c/aaanovel_lh2511241824c/gggrs3166577361117337980c/tttnovel_lh3129313841t/cccrs740249350129386853g/aaa
44.进一步的，用于上述各具体snp位点检测的引物信息如表2所示：
45.表2芦花鸡特异性snp位点扩增引物
46.[0047][0048]
本发明提供的上述各snp位点在芦花鸡品种中基本固定，均为单一基因型，均为首次报道。利用其中一个或多个位点均可鉴定芦花鸡品种，具有较高的芦花鸡鉴定准确率，结果稳定、可靠。有利于芦花鸡的保种与资源利用、开发，为开展相应选育工作、形成优质且高产的芦花鸡配套系提供重要保障。对鉴定芦花鸡血缘、定向选育应用具有重要参考价值。
[0049]
本发明提供的检测方法整体操作简单，效率较高，检测结果准确可靠，适于推广应用。
[0050]
第二方面，本发明提供了一种芦花鸡特异性snp分子标记(或者标记组合)，包括所述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5、位点6、位点7、位点8、位点9、位点10、位点11和位点12中的一种或者多种；
[0051]
优选的，所述snp分子标记(或者标记组合)包括位点7和/或位点11。
[0052]
另一种优选的，所述snp分子标记(或者标记组合)包括位点1、位点5和位点10；或者，位点2、位点4和位点10。
[0053]
第三方面，本发明提供了一种用于所述芦花鸡特异性snp分子标记的特异性检测引物；
[0054]
优选的，位点1的特异性检测引物包括lh_1f和lh_1r；
[0055]
位点2的特异性检测引物包括lh_2f和lh_2r；
[0056]
位点3的特异性检测引物包括lh_3f和lh_3r；
[0057]
位点4的特异性检测引物包括lh_4f和lh_4r；
[0058]
位点5的特异性检测引物包括lh_5f和lh_5r；
[0059]
位点6的特异性检测引物包括lh_6f和lh_6r；
[0060]
位点7的特异性检测引物包括lh_7f和lh_7r；
[0061]
位点8的特异性检测引物包括lh_8f和lh_8r；
[0062]
位点9的特异性检测引物包括lh_9f和lh_9r；
[0063]
位点10的特异性检测引物包括lh_10f和lh_10r；
[0064]
位点11的特异性检测引物包括lh_11f和lh_11r；
[0065]
位点12的特异性检测引物包括lh_12f和lh_12r；
[0066]
lh_1f、lh_1r、lh_2f、lh_2r、lh_3f、lh_3r、lh_4f、lh_4r、lh_5f、lh_5r、lh_6f、lh_6r、lh_7f、lh_7r、lh_8f、lh_8r、lh_9f、lh_9r、lh_10f、lh_10r、lh_11f、lh_11r、lh_12f和lh_12r、的核苷酸序列依次如seq id no.1-24所示。
[0067]
第四方面，本发明提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述特异性检测引物。
[0068]
优选的，所述检测试剂盒还包括基因组dna提取试剂、pcr反应mix和双蒸水。
[0069]
第五方面，本发明提供了所述芦花鸡特异性snp分子标记、所述特异性检测引物、所述检测试剂盒在鸡品种鉴定中的应用。
[0070]
本发明提供的应用方案对于鉴定芦花鸡血缘、定向选育应用等具有重要参考价值。
[0071]
有益效果：
[0072]
本发明提供的方法采用特异性snp位点对芦花鸡品种进行鉴定，可获得可靠、准确的检测结果。本发明提供了15种可选的特异性snp位点，这些snp位点在芦花鸡品种中基本固定，且均为单一基因型。利用其中一个或多个位点均可鉴定芦花鸡品种，有利于芦花鸡的保种与资源利用、开发，为形成优质、高产芦花鸡配套系提供重要保障。另外，本发明提供的方法整体操作简单，效率较高，鉴定结果准确可靠，适于推广应用。
具体实施方式
[0073]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
[0074]
实施例1
[0075]
本实施例通过对芦花鸡、萧山鸡、仙居鸡、小香鸡、雁荡麻鸡、江山白毛乌骨鸡、松阳锦鸡、丝羽乌骨鸡进行pcr测序、扩增特定snp位点并进行基因型频率分析，鉴定得到芦花鸡特异性snp分子标记，所述snp分子标记如表3所示：
[0076]
表3芦花鸡特异性snp位点注释信息
[0077][0078][0079]
实施例2
[0080]
本实施例提供了一种芦花鸡的鉴定方法，采用特异性snp位点进行鉴定，当待测鸡在下述一种或者多种特异性snp位点处检测到芦花鸡对应的基因型时，可认定该鸡种为芦花鸡。
[0081]
所述特异性snp位点信息具体如下：
[0082]
rs738049531位于鸡1号染色体34050505处，位于基因wif1第2内含子区域，芦花鸡基因型为tt；
[0083]
rs14878794位于鸡1号染色体118293887处，位于基因zfx下游区域，芦花鸡基因型为aa；
[0084]
rs314555169位于鸡1号染色体118558853处，位于基因ensgalg00010003247和ensgalg00010003376之间，芦花鸡基因型为aa；
[0085]
rs317860687位于鸡2号染色体96511615处，位于基因cep192第35内含子区域，芦花鸡基因型为cc；
[0086]
rs314441248位于鸡2号染色体101442885处，位于基因ensgalg00010005648和ensgalg00010005648之间，芦花鸡基因型为tt；
[0087]
rs739519797位于鸡3号染色体30697396处，位于基因znf318第1内含子区域，芦花鸡基因型为gg；
[0088]
rs740160833位于鸡4号染色体73672660处，位于基因ensgalg00010011901和ensgalg00010011905之间，芦花鸡基因型为tt；
[0089]
novel_lh1位于鸡4号染色体74147515处，位于基因kcnip4第1内含子区域，芦花鸡基因型为aa；
[0090]
novel_lh2位于鸡5号染色体11241824处，位于基因plekha7第3内含子区域，芦花鸡基因型为gg；
[0091]
rs316657736位于鸡11号染色体17337980处，位于基因gse1的第3内含子区域，芦花鸡基因型为tt；
[0092]
novel_lh3位于鸡12号染色体9313841处，位于基因copg1与rab7a之间，芦花鸡基因型为cc；
[0093]
rs740249350位于鸡12号染色体9386853处，位于基因gata2第3外显子区域，芦花鸡基因型为aa。
[0094]
实施例3
[0095]
本实施例提供了一种用于鉴定芦花鸡的引物组合，包括用于检测特异性snp分子标记的如下引物对：
[0096]
用于检测所述标记rs738049531的引物为lh_1f和lh_1r所示两条dna；
[0097]
用于检测所述标记rs14878794的引物为lh_2f和lh_2r所示两条dna；
[0098]
用于检测所述标记rs314555169的引物为lh_3f和lh_3r所示两条dna；
[0099]
用于检测所述标记rs317860687的引物为lh_4f和lh_4r所示两条dna；
[0100]
用于检测所述标记rs314441248的引物为lh_5f和lh_5r所示两条dna；
[0101]
用于检测所述标记rs739519797的引物为lh_6f和lh_6r所示两条dna；
[0102]
用于检测所述标记rs740160833的引物为lh_7f和lh_7r所示两条dna；
[0103]
用于检测所述标记novel_lh1的引物为lh_8f和lh_8r所示两条dna；
[0104]
用于检测所述标记novel_lh2的引物为lh_9f和lh_9r所示两条dna；
[0105]
用于检测所述标记rs316657736的引物为lh_10f和lh_10r所示两条dna；
[0106]
用于检测所述标记novel_lh3的引物为lh_11f和lh_11r所示两条dna；
[0107]
用于检测所述标记rs740249350的引物为lh_12f和lh_12r所示两条dna。
[0108]
lh_1f、lh_1r、lh_2f、lh_2r、lh_3f、lh_3r、lh_4f、lh_4r、lh_5f、lh_5r、lh_6f、lh_6r、lh_7f、lh_7r、lh_8f、lh_8r、lh_9f、lh_9r、lh_10f、lh_10r、lh_11f、lh_11r、lh_12f和lh_12r的核苷酸序列参见前述表2。
[0109]
本实施例还提供了一种用于鉴定芦花鸡的检测试剂盒，所述试剂盒的组成成分如表4所示：
[0110]
表4鉴定芦花鸡的检测试剂盒组成
[0111][0112][0113]
实验例1
[0114]
本实验例分别应用实施例1所述12个特异性snp位点，对待测鸡群进行鉴定。具体如下：
[0115]
取20份芦花鸡血样和204份非芦花鸡血样进行鉴定，非芦花鸡血样来源包括北京油鸡(n＝20)、龙游麻鸡(n＝10)、白耳黄鸡(n＝10)、东乡黑鸡(n＝20)、温岭草鸡(n＝20)、江山白毛乌骨鸡(n＝19)、松阳锦鸡(n＝17)、仙居鸡(n＝14)、萧山鸡(n＝20)、小香鸡(n＝19)、雁荡麻鸡(n＝10)、惠阳胡须鸡(n＝8)、文昌鸡(n＝7)、湘黄鸡(n＝10)，利用实施例3中的引物及试剂盒进行snp分型。
[0116]
其中，pcr反应体系以25μl计为：
[0117][0118]
pcr反应条件为：95℃10min,95℃30s，60℃30s，72℃50s，共30个循环；72℃5min。
[0119]
根据测序结果，统计12个snp位点的基因型。不同位点对芦花鸡的鉴定率如表5所示：
[0120][0121]
由表5可知，实施例1所述特异性snp位点各自对芦花鸡的鉴定率均在92.5％以上。因此，由本发明所提供的12个位点组合进行芦花鸡品种鉴定，特异性和准确率高。
[0122]
实验例2
[0123]
本实验例分别应用实施例1所述12个特异性snp位点，形成2个特定snp组合，分别为组合1：rs738049531、rs314441248、rs316657736共3个位点；组合2：rs14878794、rs317860687、rs316657736共3个snp位点；对待测群体进行鉴定，如下：
[0124]
取20份丝羽乌骨鸡血样和204份非芦花鸡血样进行鉴定，非芦花鸡血样来源包括北京油鸡(n＝20)、龙游麻鸡(n＝10)、白耳黄鸡(n＝10)、东乡黑鸡(n＝20)、温岭草鸡(n＝20)、江山白毛乌骨鸡(n＝19)、松阳锦鸡(n＝17)、仙居鸡(n＝14)、萧山鸡(n＝20)、小香鸡(n＝19)、雁荡麻鸡(n＝10)、惠阳胡须鸡(n＝8)、文昌鸡(n＝7)、湘黄鸡(n＝10)，利用实施例3中的引物及试剂盒进行snp分型。
[0125]
其中，pcr反应体系以25μl计为：
[0126][0127]
pcr反应条件为：95℃10min,95℃30s，60℃30s，72℃50s，共30个循环；72℃5min。
[0128]
根据测序结果，统计、分析3个特定组合频率。不同位点对芦花鸡的鉴定率如表6所示：
[0129][0130]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于
本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.芦花鸡的鉴定方法，其特征在于，采用特异性snp位点进行鉴定，所述特异性snp位点选自位点1、位点2、位点3、位点4、位点5、位点6、位点7、位点8、位点9、位点10、位点11和位点12中的一种或者多种；所述位点1为rs738049531，位于鸡1号染色体34050505处；所述位点2为rs14878794，位于鸡1号染色体118293887处；所述位点3为rs314555169，位于鸡1号染色体118558853处；所述位点4为rs317860687，位于鸡2号染色体96511615处；所述位点5为rs314441248，位于鸡2号染色体101442885处；所述位点6为rs739519797，位于鸡3号染色体30697396处；所述位点7为rs740160833，位于鸡4号染色体73672660处；所述位点8为novel_lh1，位于鸡4号染色体74147515处；所述位点9为novel_lh2，位于鸡5号染色体11241824处；所述位点10为rs316657736，位于鸡11号染色体17337980处；所述位点11为novel_lh3，位于鸡12号染色体9313841处；所述位点12为rs740249350，位于鸡12号染色体9386853处。2.根据权利要求1所述芦花鸡的鉴定方法，其特征在于，芦花鸡在位点1的基因型为tt；芦花鸡在位点2的基因型为aa；芦花鸡在位点3的基因型为aa；芦花鸡在位点4的基因型为cc；芦花鸡在位点5的基因型为tt；芦花鸡在位点6的基因型为gg；芦花鸡在位点7的基因型为tt；芦花鸡在位点8的基因型为aa；芦花鸡在位点9的基因型为gg；芦花鸡在位点10的基因型为tt；芦花鸡在位点11的基因型为cc；芦花鸡在位点12的基因型为aa。3.根据权利要求1或2所述芦花鸡的鉴定方法，其特征在于，所述特异性snp位点包括位点7和位点11中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述芦花鸡的鉴定方法，其特征在于，所述特异性snp位点包括位点1、位点5和位点10；或者，所述特异性snp位点包括位点位点2、位点4和位点10。5.根据权利要求4所述芦花鸡的鉴定方法，其特征在于，所述特异性snp位点包括位点1、位点2、位点3、位点4、位点5、位点6、位点7、位点8、位点9、位点10、位点11和位点12。6.芦花鸡特异性snp分子标记，其特征在于，包括所述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5、位点6、位点7、位点8、位点9、位点10、位点11和位点12中的一种或者多种。7.用于权利要求6所述芦花鸡特异性snp分子标记的特异性检测引物。8.根据权利要求7所述特异性检测引物，其特征在于：
位点1的特异性检测引物包括lh_1f和lh_1r；位点2的特异性检测引物包括lh_2f和lh_2r；位点3的特异性检测引物包括lh_3f和lh_3r；位点4的特异性检测引物包括lh_4f和lh_4r；位点5的特异性检测引物包括lh_5f和lh_5r；位点6的特异性检测引物包括lh_6f和lh_6r；位点7的特异性检测引物包括lh_7f和lh_7r；位点8的特异性检测引物包括lh_8f和lh_8r；位点9的特异性检测引物包括lh_9f和lh_9r；位点10的特异性检测引物包括lh_10f和lh_10r；位点11的特异性检测引物包括lh_11f和lh_11r；位点12的特异性检测引物包括lh_12f和lh_12r；lh_1f、lh_1r、lh_2f、lh_2r、lh_3f、lh_3r、lh_4f、lh_4r、lh_5f、lh_5r、lh_6f、lh_6r、lh_7f、lh_7r、lh_8f、lh_8r、lh_9f、lh_9r、lh_10f、lh_10r、lh_11f、lh_11r、lh_12f和lh_12r的核苷酸序列依次如seq id no.1-24所示。9.检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求7或8所述特异性检测引物。10.权利要求6所述芦花鸡特异性snp分子标记、权利要求7或8所述特异性检测引物、权利要求9所述检测试剂盒在鸡品种鉴定中的应用。

技术总结
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种芦花鸡的鉴定方法。本发明提供的方法采用特异性SNP位点对芦花鸡品种进行鉴定，可获得可靠、准确的检测结果。本发明提供了12种可选的特异性SNP位点，这些SNP位点在芦花鸡品种中基本固定，且均为单一基因型；而在其他品种中为野生基因型。利用其中一个或多个位点均可鉴定芦花鸡品种，具有较高的芦花鸡鉴定准确率，结果稳定、可靠。有利于芦花鸡的保种与资源利用、开发，为开展相应选育工作、形成优质且高产的芦花鸡配套系提供重要保障。另外，本发明提供的方法整体操作简单，效率较高，适于推广应用。适于推广应用。


技术研发人员：谭晓冬 董捷 王德前 黄敏婕 张嘉文
受保护的技术使用者：浙江省农业科学院
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/8/9