一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法

1.本发明涉及模式生物行为的技术领域，尤其是指一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法。


背景技术：

2.评价运动能力的指标有很多，其中步态是指一种行走方式，当人体逐渐衰老或存在疾病时，这些步态特征将会有明显的变化。例如，老年人的肌肉质量、力量随年龄的增长迅速下降，表现为下肢肌力弱，会导致平衡和步态出现异常；糖尿病的并发症患者也会表现出步态不稳、足部受压不均；另外，步行障碍是神经疾病患者的共性问题。由此可见，步态的变化差异能够很明显地反映出机体健康状况的变化情况，通过步态的改善来筛选活性物质的方法是可行的。
3.行为学是动物个体、动物社群在适应内、外环境变化或刺激时所作出的反应，行为能够反映神经系统的活动。在生命科学领域广泛应用的模式生物中，常通过对动物暴露在不同物质下的运动行为表现与变化进行评估，能够直接展现动物在不同身体状况下的运动行为，是一种最直观和宏观的评价运动功能的方法。秀丽线虫是一种多细胞模式生物，目前对秀丽线虫运动学的研究多以运动速度、摆动频率等作为主要指标，对其步态的研究多集中在分析身体形状，缺乏全面的步态表征方法，现有的秀丽线虫步态分析方法不能很好的发挥步态对于评价其运动功能的重要性。
4.科研领域常用的秀丽线虫、斑马鱼、小鼠等模式生物，它们各有优劣势；其中，秀丽线虫具有生长周期短、繁殖周期短、繁殖量大、实验操作简单等突出优势，适合用于活性物质筛选。但活性物质的常规开发模式适用于已经被研究透彻的机制过程，尤其是在针对病理的药物筛选中，对于尚未有明确机制的开发对象有局限性。因此，为了能快速有效的开展大规模筛选实验，避开常规模式的弊端，需要发明一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，该方法通过观察秀丽线虫在形态、姿势、运动和路径四个方面的特征，将图像量化为数值，可以较为全面表征其步态特征，并且通过该方法获得的步态参数对于评价秀丽线虫的运动能力具有重要意义，能够作为筛选活性物质的重要指标。
6.为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，包括以下步骤：
7.1)将秀丽线虫从暴露于样品的环境中取出，洗净后对其进行连续拍摄，获得秀丽线虫在短时间内的运动视频；
8.2)将运动视频进行参数调整，生成符合分析要求的视频；
9.3)使用导出的视频进行数据分析，得到秀丽线虫在固体琼脂板上运动时关于形
态、姿势、运动和路径特征的运动参数；
10.4)将获得的所有运动参数进行综合，并拟合为一个指标，代表秀丽线虫运动能力的强弱，将所得指标数值与对照值进行比对，高于对照值判定为阳性物质，低于对照值判定为阴性物质，与对照值无显著性差异表示物质无明显作用；
11.5)通过筛选的阳性物质，即为在大规模初筛过程中具有生物活性的物质，能够进行下一步实验，检测其活性功能。
12.进一步，在步骤1)中，秀丽线虫需用缓冲液将其从含样品的固体琼脂板上洗下，待其自然沉降后弃去含食物及杂质的溶液，并重复上述过程至溶液澄清才能进行下一步操作。
13.进一步，在步骤1)中，当吸取一部分秀丽线虫放置于被拍摄的固体琼脂板上后，需要等待虫液中的液体被吸干，同时需要让秀丽线虫从聚集状态变成分散状态，让其自由爬行适应新的环境，进入稳定的运动状态后才能够进行测定。
14.进一步，在步骤1)中，对秀丽线虫连续拍摄的方法为：将5～50条秀丽线虫放置在含有固定体积ngm培养基的固体琼脂板上，使用连接摄像头的显微镜在固体琼脂板正上方拍摄秀丽线虫的运动视频。
15.进一步，在步骤1)中，所有拍摄的爬行行为视频均为avi格式。
16.进一步，在步骤2)中，每次视频拍摄时的各种摄影参数需保持一致，且在利用分析软件处理视频时，除阈值外各种参数也须保持一致。
17.进一步，在步骤2)中，利用视频压缩软件videomach将原视频的分辨率、位深度进行更改，最后将视频以灰度模式压缩导出。
18.进一步，在步骤3)中，利用movement tracker、tierpsy tracker分析导出后的视频，并得到关于秀丽线虫运动速度、运动振幅、前进方向和爬行路径的数据，即关于形态、姿势、运动和路径特征的运动参数。
19.进一步，在步骤4)中，评定运动能力需要综合多个参数，其中关于前进方向和爬行路径需要更长的记录时长，因此对秀丽线虫的连续拍摄时间不能少于1min。
20.进一步，在步骤4)中，通过分析能得到关于各种参数每一帧的数值excel文件，可以配合统计软件、计算机语言(spss，sas，python等)完成行为分析及差异性。
21.进一步，在步骤4)中，对照值与指标数值要为同一批实验所得。
22.本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
23.1、本发明首次采用多维度行为参数表征秀丽线虫的步态特征，不同维度分别为身体形态、姿势特征、运动特征和运动路径；能很大程度上消除动物个体差异性和实验的偶然性，获得真实的运动规律，进而继续研究其潜在机制。
24.2、本发明与传统测定线虫运动能力的方法相比，可以精准地识别动物的轮廓、骨架等数据，并采集其运动的轨迹、位置和各种状态，确保了处理数据的可靠性，为后期创造新的运动参数提供了基础素材和依据。
25.3、本发明与传统测定线虫运动能力的方法相比，更适合作为预测机体健康状况的方法，很好的发挥了步态在作为运动能力评价指标时的重要性，从而将运动能力作为筛选活性物质的重要指标。
26.4、本发明方法在针对体型单位在毫米水平的微小生物的运动特征测定方面具有
广泛的使用空间，可以灵活实现动物单体或群体的追踪，适用于大多数实验，且所需的实验仪器容易获取，操作简便、适用性广、省时省力，同时能保证实验数据的准确度，具有广阔的应用前景。
27.5、本发明方法在物质筛选方面具有广泛的使用空间，可对食品、药品、化妆品和保健品中所需的物质进行筛选，且实验方便、快捷、准确度高，具有广阔的应用前景。
附图说明
28.图1是本发明实施例1中记录秀丽线虫运动视频的实验装置示意图。
29.图2是本发明实施例1中通过movement tracker绘制的线虫运动轨迹图像。
30.图3是本发明实施例1中通过movement tracker分析得到的部分运动参数随时间变化的曲线图。其中，no.tracks是number of objects tracked vs.time的缩写，表示被追踪的秀丽线虫数量随时间的变化；no.objects是number of objects with potential to pirouette vs.time的缩写，表示转向的秀丽线虫数量随时间的变化；frequency是pirouette initiation event frequency的缩写，表示秀丽线虫的旋转频率；probability是pirouette initiation probability的缩写，表示秀丽线虫的旋转概率；横坐标time(sec)表示时间(秒)。
31.图4是本发明实施例1中通过tierpsy tracker分析得到的振幅随时间变化的曲线图。其中，max amplitude表示最大振幅、time[seconds]表示单位为秒的时间、all trajectories表示所有秀丽线虫的轨迹。
具体实施方式
[0032]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0033]
基于秀丽线虫的运动能力对几种活性物质进行筛选，本实施例所用的野生型秀丽线虫n2、大肠埃希菌op50均购于美国明尼苏达大学秀丽线虫遗传中心，n2的培养温度始终控制在20℃左右，将n2同步化处理后，培养至day 1进行实验。具体步骤如下：
[0034]
1)对egcg、辣椒素、葡萄糖、海藻糖四种成分进行筛选，将被筛选的物质分别混合在秀丽线虫的培养皿中，一段时间后将秀丽线虫取出，洗净后对其进行连续拍摄，实验装置如图1所示，获得秀丽线虫在短时间内的运动视频；
[0035]
2)将运动视频通过videomach软件进行分辨率、位深度、图像模式的调整，生成符合分析要求的视频并导出；
[0036]
3)导出的视频利用movement tracker追踪得到的秀丽线虫运动轨迹图，如图2所示；进一步进行数据分析，得到部分随时间变化的运动参数曲线，如图3所示；通过tierpsy tracker提取视频中秀丽线虫的骨架、轮廓等基础数据，进一步计算振幅等其它行为学指标，如图4所示(图中所有浅灰色曲线代表本次实验所有秀丽线虫的振幅随时间变化的曲线，黑色曲线代表所有秀丽线虫振幅的平均值随时间变化的曲线，反映了实例中秀丽线虫振幅变化的普遍规律)；
[0037]
4)将获得的所有参数进行综合，并拟合为一个指标，代表秀丽线虫运动能力的强弱，将所得指标数值与对照值进行比对，高于对照值判定为阳性物质，低于对照值判定为阴
性物质，与对照值无显著性差异表示物质无明显作用，实验结果见表1；
[0038]
表1不同成分对秀丽线虫运动行为的影响
[0039]
被筛选的物质运动能力判定类别egcg增强阳性辣椒素增强阳性葡萄糖无明显变化无明显作用海藻糖减弱阴性
[0040]
5)通过筛选的阳性物质，即为在大规模初筛过程中具有生物活性的物质。根据实验结果，可以选择被判定为阳性且效果好的物质进行下一步检测实验。
[0041]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将秀丽线虫从暴露于样品的环境中取出，洗净后对其进行连续拍摄，获得秀丽线虫在短时间内的运动视频；2)将运动视频进行参数调整，生成符合分析要求的视频；3)使用导出的视频进行数据分析，得到秀丽线虫在固体琼脂板上运动时关于形态、姿势、运动和路径特征的运动参数；4)将获得的所有运动参数进行综合，并拟合为一个指标，代表秀丽线虫运动能力的强弱，将所得指标数值与对照值进行比对，高于对照值判定为阳性物质，低于对照值判定为阴性物质，与对照值无显著性差异表示物质无明显作用；5)通过筛选的阳性物质，即为在大规模初筛过程中具有生物活性的物质，能够进行下一步实验，检测其活性功能。2.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤1)中，秀丽线虫需用缓冲液将其从含样品的固体琼脂板上洗下，待其自然沉降后弃去含食物及杂质的溶液，并重复上述过程至溶液澄清才能进行下一步操作。3.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤1)中，当吸取一部分秀丽线虫放置于被拍摄的固体琼脂板上后，需要等待虫液中的液体被吸干，同时需要让秀丽线虫从聚集状态变成分散状态，让其自由爬行适应新的环境，进入稳定的运动状态后才能够进行测定。4.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤1)中，对秀丽线虫连续拍摄的方法为：将5～50条秀丽线虫放置在含有固定体积ngm培养基的固体琼脂板上，使用连接摄像头的显微镜在固体琼脂板正上方拍摄秀丽线虫的运动视频。5.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤1)中，所有拍摄的爬行行为视频均为avi格式。6.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤2)中，每次视频拍摄时的各种摄影参数需保持一致，且在利用分析软件处理视频时，除阈值外各种参数也须保持一致。7.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤2)中，利用视频压缩软件videomach将原视频的分辨率、位深度进行更改，最后将视频以灰度模式压缩导出。8.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤3)中，利用movement tracker、tierpsy tracker分析导出后的视频，并得到关于秀丽线虫运动速度、运动振幅、前进方向和爬行路径的数据，即关于形态、姿势、运动和路径特征的运动参数。9.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤4)中，评定运动能力需要综合多个参数，其中关于前进方向和爬行路径需要更长的记录时长，因此对秀丽线虫的连续拍摄时间不能少于1min。10.根据权利要求1所述的一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，其特征在于，在步骤4)中，通过分析能得到关于各种参数每一帧的数值excel文件，配合统计软件、计
算机语言完成行为分析及差异性；对照值与指标数值要为同一批实验所得。

技术总结
本发明公开了一种基于秀丽线虫运动能力的活性物质筛选方法，包括：1)获得秀丽线虫在短时间内的运动视频；2)将运动视频进行参数调整，生成符合分析要求的视频；3)分析导出的视频，得到秀丽线虫在固体琼脂板上运动时关于形态、姿势、运动和路径特征的运动参数；4)将获得的所有参数进行综合，并拟合为一个指标，将所得指标数值与对照值进行比对，高于对照值判定为阳性，低于对照值判定为阴性，与对照值无显著性差异表示物质无明显作用；5)通过筛选的阳性物质，即为在大规模初筛过程中具有生物活性的物质。本发明在物质筛选方面具有广泛的使用空间，可对食品、药品、化妆品和保健品中所需的物质进行筛选，且实验方便、快捷、准确度。准确度。准确度。


技术研发人员：黄泽波 陈俊伶 黄子亮
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/8/9