一种菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法

1.本发明属于紫苏醇检测技术领域，具体涉及到一种菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法。


背景技术：

2.目前关于紫苏醇的检测方法包括，气相色谱检测,样品的需要用乙酸乙酯进行萃取,方法为:取一定体积发酵液,加入等体积的乙酸乙酯,混匀离心,吸取上层乙酸乙酯于新的离心管,加入无水na2so4将乙酸乙酯中的水分充分抽离,离心对上层的乙酸乙酯采用气相色谱分析检测。
3.另外有研究表明将紫苏醇制备为亚微乳,利用hplc检测在10-250mg/l浓度范围内线性良好(r＝0.9996)
4.但以上两种检测方法皆为对发酵液及样品的后处理,存在一定的损失率,如何让直接对样品及发酵液进行检测，暂时未有文献报道.。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法。
8.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，
9.配置紫苏醇标准品溶液，通过紫外分光光度法确定其检测波长；
10.通过高效液相色谱法测定梯度浓度的紫苏醇标准品溶液；
11.绘制标准曲线，计算得到线性回归方程；
12.通过高效液相色谱法测定待测菌株发酵液中紫苏醇的产量，代入线性回归方程计算，得到最终结果。
13.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
14.色谱柱：c18(4.6mmx150 mm,5μm)；
15.流动相：无水甲醇-水(60:40,v/v)；
16.流动相流速为1.0ml/min；
17.检测波长：210nm；
18.柱温：40℃。
19.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述确定其检测波长的步骤包括，取紫苏醇标准品溶液,经紫外分光光度法在190～
300nm全波长下进行扫描，确定其有吸收峰的波长位置为检测波长。
20.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述标准曲线在紫苏醇浓度为0.0078125～1g/l时的质量浓度与峰面积的线性化关系良好。
21.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述线性回归方程为y＝18741700x+35071.4(r2＝0.996)，其中，y表示峰面积，x表示标准品溶液的质量浓度。
22.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述测定待测菌株发酵液中紫苏醇的产量的方法包括，取发酵液,离心后经0.22μm膜过滤，通过自动进样器将10μl的发酵液样品注入液相色谱，进行检测。
23.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述待测菌株发酵液为产紫苏醇的菌株发酵液。
24.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述产紫苏醇的菌株构建方法包括，
25.构建携带分枝杆菌(mycobacterium sp)来源的紫苏醇合成酶的质粒pet-cyp450，序列如seq id no:1所示，所述质粒pet-cyp450转入大肠杆菌bl21(de3)(escherichia coli bl21 de3)中表达得到述产紫苏醇的菌株。
26.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述检测方法直接对样品及发酵液进行检测，样品损失率低。
27.作为本发明所述菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法的一种优选方案，其中：所述检测方法操作简便，灵敏度高。
28.本发明有益效果：
29.本发明提供了一种直接对菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，相比于气相色谱的检测方法,更为直接,直接对培养基进行检测,省去了气相色谱对培养基的后处理步骤,步骤相对于气相色谱来说较为简单,省去了对发酵液中的产物萃取的手段，并且检测灵敏度与气相色谱检测相当，同时还能够减少样品的损失率。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
31.图1为本发明实施例1的pet-cyp450质粒的序列图谱。
32.图2为本发明实施例2中紫苏醇全波长扫描图。
33.图3为本发明实施例2中紫苏醇标准品的标准曲线图。
34.图4为本发明实施例2中紫苏醇标准品在色谱柱中的保留时间。
35.图5为本发明实施例2中待测发酵液中紫苏醇在色谱柱中的保留时间。
36.图6为本发明实施例2中测定的待测发酵液样品中紫苏醇含量。
37.图7为本发明实施例3中流动相浓度为20％时的色谱图。
38.图8为本发明实施例3中流动相浓度为40％时的色谱图。
39.图9为本发明实施例3中流动相浓度为60％时的色谱图。
40.图10为本发明实施例3中流动相浓度为80％时的色谱图。
41.图11为本发明实施例4中检测波长为220nm时的色谱图。
42.图12为本发明实施例4中检测波长为230nm时的色谱图。
43.图13为本发明对比例1测定的待测发酵液样品中紫苏醇含量。
具体实施方式
44.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
45.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
46.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
47.实施例1
48.本实施例提供了一种创建产紫苏醇的特定菌株的方法，后续用于通过发明的检测方法直接检测该菌株发酵液中的紫苏醇含量。
49.携带分枝杆菌(mycobacterium sp)来源的紫苏醇合成酶的质粒构建:
50.在金唯智公司合成该基因,并进行大肠杆菌密码子优化,序列如seq idno:1所示，优化得到质粒pet-cyp450，如图1所示；
51.质粒pet-cyp450在大肠杆菌中的表达：
52.取2μl pet-cyp450质粒加入100μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中,冰浴30min后放入42℃水浴锅中，热击90s，立即冰浴5min，立即加入已预热的37℃的500μl lb恢复培养基中，转入37℃摇床中恢复培养1h，得到菌株1；
53.菌株1涂布于100μg/ml氨苄青霉素抗性的lb固体培养基中,于37℃培养箱中培养12h；
54.取菌株1的三个菌落接种到5ml lb培养基中，在37℃下培养作为种子液，按照1％接菌量转接在20ml密封小瓶中，37℃培养3h，当od 600达到0.6～0.8时，添加0.5mm iptg及5mm的柠檬烯底物,并在30℃继续生长24h，即得到待测发酵液。
55.实施例2
56.本实施例提供了一种菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法。
57.s1：配制紫苏醇标准品溶液:
58.精密称取紫苏醇标准品50mg，置于10ml容量瓶中,加无水甲醇溶液并稀释至刻度,摇匀，经0.22μm膜过滤，即得到浓度为5g/l的紫苏醇标准品溶液。
59.s2：确定检测波长：
60.取一定浓度的紫苏醇甲醇溶液，经紫外分光光度法在190～300nm全波长下进行扫描,结果如图2所示，可知,紫苏醇在210～230nm处有吸收峰,故检测波长可选范围在210～
230nm，本发明选定210nm。
61.s3：制备梯度浓度的紫苏醇标准品溶液：
62.分别精密吸取5g/l的紫苏醇标准品溶液2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125ml于10ml容量瓶中,再分别用无水甲醇稀释定容至刻度，即得到梯度浓度的紫苏醇标标准品溶液。
63.s4：绘制标准曲线，计算线性回归方程：
64.取s3制备的梯度标准品溶液进行高效液相色谱测定，色谱条件为：
65.色谱柱：c18(4.6mmx150 mm,5μm)；
66.流动相：无水甲醇-水(60:40,v/v)；
67.流动相流速为1.0ml/min；
68.检测波长：210nm；
69.柱温：40℃；
70.分别进样10μl,,以峰面积y为纵坐标,标准品溶液的质量浓度x(g/l)为横坐标,绘制紫苏醇标准品的标准曲线,如图3,通过计算得到线性回归方程为y＝18741700x+35071.4(r2＝0.996)，结果表明,当紫苏醇的浓度在1-0.0078125g/l时,其质量浓度与峰面积的线性化关系良好，由图4可知,可用于紫苏醇的含量测定。
71.s5：检测菌株发酵液中的紫苏醇含量：
72.取实施例1是待测发酵液,12000g离心2min,经0.22μm膜过滤,通过自动进样器将10μl的待测发酵液样品注入液相色谱，由图5可知,发酵液中的紫苏醇与紫苏醇的标准品峰峰对应性良好,符合测定要求,按s4线性关系考察中的紫苏醇的标准曲线进行计算,结果如图6所示。
73.实施例3
74.本实施例对高效液相色谱测定的色谱条件中的流动相浓度进行优选，其他色谱条件如下：
75.色谱柱：c18(4.6mmx150 mm,5μm)；
76.流动相流速为1.0ml/min；
77.检测波长：210nm；
78.柱温：40℃。
79.流动相浓度分别为：
80.20％：无水甲醇-水(20:80,v/v)；
81.40％：无水甲醇-水(40:60,v/v)；
82.60％：无水甲醇-水(60:40,v/v)；
83.80％：无水甲醇-水(80:20,v/v)；
84.按上述流动相浓度的色谱条件测定1g/l紫苏醇标准品，结果如图7～图10所示，可以看出，在流动相浓度为60％，也即无水甲醇-水(60:40,v/v)的条件下,紫苏醇峰的分离度及响应最好，因此本发明选定检测流动相浓度为60％
85.实施例4
86.本实施例对高效液相色谱测定的色谱条件中的检测波长进行优选，其他色谱条件如下：
87.色谱柱：c18(4.6mmx150 mm,5μm)；
88.流动相：无水甲醇-水(60:40,v/v)；
89.流动相流速为1.0ml/min；
90.柱温：40℃。
91.检测波长分别为：
92.210nm；
93.220nm；
94.230nm；
95.按上述检测波长的色谱条件测定1g/l紫苏醇标准品，结果分别如图9、图11、图12所示，可以看出，在其他条件一定的情况下，在210nm检测波长下,紫苏醇峰的分离度及响应最好，因此本发明选定检测波长为210nm。
96.对比例1
97.为验证本发明有益效果，本对比例提供了一种传统气相色谱检测紫苏醇含量的方法。
98.气质检测采用日本岛津公司的气相色谱质谱联用仪器和db-5(30m
×
0.320mm
×
0.25μm)色谱柱,以氦气作为载体进行分析检测,定性定量检测发酵液中紫苏醇的含量,检测方法如下:
99.发酵液进行后处理：:取一定体积发酵液,加入等体积的乙酸乙酯,混匀离心,吸取上层乙酸乙酯于新的离心管,加入无水na2so4，将乙酸乙酯中的水分充分抽离,离心得到上层的乙酸乙酯作为待检测样品，得到的样品按照下述检测条件进行检测：
100.质谱检测条件:采用选择离子扫描模式(sim),离子源温度:260℃,进样口温度:260℃,
101.气相检测条件：进样口温度:260℃；
102.分流模式:分流比5:1；
103.柱温箱:80℃起始,保持2min,20℃/min升至250℃,保持2min；
104.进样量:1μl；
105.检测结果如图13所示，可以看出，采用本发明方法的检测灵敏度与传统检测方法相当，但本发明方法相比于气相色谱的检测方法,更为直接,直接对培养基进行检测,省去了气相色谱对培养基的后处理步骤,无需对发酵液中的产物进行萃取，同时还能够减少样品的损失率。
106.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括，配置紫苏醇标准品溶液，通过紫外分光光度法确定其检测波长；通过高效液相色谱法测定梯度浓度的紫苏醇标准品溶液；绘制标准曲线，计算得到线性回归方程；通过高效液相色谱法测定待测菌株发酵液中紫苏醇的产量，代入线性回归方程计算，得到最终结果。2.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱测定的色谱条件为：色谱柱：c18(4.6mmx150 mm,5μm)；流动相：无水甲醇-水(60:40,v/v)；流动相流速为1.0ml/min；检测波长：210nm；柱温：40℃。3.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述确定其检测波长的步骤包括，取紫苏醇标准品溶液,经紫外分光光度法在190～300nm全波长下进行扫描，确定其有吸收峰的波长位置为检测波长。4.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述标准曲线在紫苏醇浓度为0.0078125～1g/l时的质量浓度与峰面积的线性化关系良好。5.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述线性回归方程为y＝18741700x+35071.4(r2＝0.996)，其中，y表示峰面积，x表示标准品溶液的质量浓度。6.如权利要求1或2所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述测定待测菌株发酵液中紫苏醇的产量的方法包括，取发酵液,离心后经0.22μm膜过滤，通过自动进样器将10μl的发酵液样品注入液相色谱，进行检测。7.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述待测菌株发酵液为产紫苏醇的菌株发酵液。8.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述产紫苏醇的菌株构建方法包括，构建携带分枝杆菌(mycobacterium sp)来源的紫苏醇合成酶的质粒pet-cyp450，序列如seq id no:1所示，所述质粒pet-cyp450转入大肠杆菌bl21(de3)(escherichia coli bl21 de3)中表达得到产紫苏醇的菌株。9.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法直接对样品及发酵液进行检测，样品损失率低。10.如权利要求1所述的菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测方法操作简便，灵敏度高。

技术总结
本发明公开了一种菌株发酵液中紫苏醇的高效液相色谱检测方法，本发明方法能够直接对菌株发酵液中紫苏醇进行高效液相色谱检测，相比于气相色谱的检测方法,更为直接,直接对培养基进行检测,省去了气相色谱对培养基的后处理步骤,步骤相对于气相色谱来说较为简单,并且检测灵敏度与气象色谱检测相当，同时还能够减少样品的损失率。减少样品的损失率。减少样品的损失率。


技术研发人员：刘春立 郝云鹏 白仲虎 杨艳坤 刘秀霞
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/8/9