用于评估缺血性心肌病干细胞治疗的一组生物标志物及其试剂盒的应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于评估缺血性心肌病干细胞治疗的一组生物标志物及其试剂盒的应用。
技术背景
2.我国现阶段心血管疾病的患病率持续上升，是城乡居民死亡的首要原因。许多心血管疾病终末期表现为心力衰竭(heartfailure,hf)。随着人口老龄化的发展，心力衰竭的发病率也逐年上升，不仅严重影响了患者的生活质量，也给医疗保健系统带来了沉重的负担。造成心力衰竭的原因是多样的，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病是主要原因之一，病程中长期心肌缺血、缺氧以至心肌细胞减少、坏死，心肌纤维化、心肌瘢痕形成导致心肌弥漫性纤维化，最后发展为缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy，icm)如何挽救受损的心肌，尽可能的恢复正常的心功能，一直是研究的热点。
3.干细胞疗法是心力衰竭治疗的一种重要辅助手段，对于扩张型心肌病、缺血性心肌病、限制型心肌病，均能提高患者的生存率和生活质量。临床试验结果表明，在总体上，手术血运重建联合干细胞移植可以更进一步提高患者术后的心功能，并改善心室的重构，然而并非所有的患者都能从这种疗法中获益，其原因尚不明确。目前工作中，对患者的评估常采用心脏超声、心肌损伤的标志物、生物力学心肌应激的生物标志物、炎症标志物和心脏纤维化的标志物等，这些检验检查缺乏特异性。因此寻找一种能够对干细胞疗法有参考价值的生物标志物，对于这种新兴的治疗手段有重要的意义。
4.长链非编码rna(longnon-coding rna，lncrna)，是一类长度超过200nt的非编码rna，是ncrna最大的组成部分。lncrna调控方式多样，作用范围广，体现在表观遗传学层面、转录前、转录中、转录后调控等过程中，且lncrna经常形成二级结构，相对更稳定，这有利于它们在体液(如尿液和血液)中作为游离核酸被检测。现在随着高通量测序技术的发展，lncrna作为生物标志物的潜力逐渐开始被重视。


技术实现要素：

5.本发明主要解决的技术问题是为缺血性心肌病的干细胞疗法提供一组可供参考的生物标志物以及体外诊断使用的试剂盒。
6.本发明提供了一组生物标志物，其在接受冠状动脉旁路移植术联合自体骨髓单个核细胞移植术的缺血性心肌病患者中的表达量与预后存在一定的相关性。
7.为了实现上述目的，本发明中的生物标志物包括通过rna测序技术筛选出的33个差异lncrna，其中5个在无反应组的患者中上调，28个在无反应组的患者中下调。
8.上调的lncrna包括：
9.urs00008bb784，urs00008c063c，urs0000d58c2c，nr_108060.1。nr_157096.2
10.下调的lncrna包括：
11.urs00009b972a，urs00008c3bbf，urs0000d6230b，nr_045494.1，urs00009bbd07，urs0000780d40，urs0000eb717f，urs00008c0830，nr_109969.1，urs00008c3ec7，nr_027451.1，xr_924836.2，urs0000d5899b，urs00008befdf，urs00009c0b2e，urs00008bcb71，urs0000d5800f，urs0000eedd84，urs0000d6e6fb，urs00008c1d6b，urs0000d5b4de，urs00009be076，urs0000e951dc，urs0000ef1a40，urs0000d58157，urs0000d5b278，urs00008b8a41，urs0000e9b358。
12.具体的，本发明的技术方案如下：
13.本发明第一个方面公开了一组评估缺血性心肌病干细胞治疗的生物标志物，所述生物标志物选自以下组别中的至少一种lncrna：urs00008bb784，urs00008c063c，urs0000d58c2c，nr_108060.1，nr_157096.2，urs00009b972a，urs00008c3bbf，urs0000d6230b，nr_045494.1，urs00009bbd07，urs0000780d40，urs0000eb717f，urs00008c0830，nr_109969.1，urs00008c3ec7，nr_027451.1，xr_924836.2，urs0000d5899b，urs00008befdf，urs00009c0b2e，urs00008bcb71，urs0000d5800f，urs0000eedd84，urs0000d6e6fb，urs00008c1d6b，urs0000d5b4de，urs00009be076，urs0000e951dc，urs0000ef1a40，urs0000d58157，urs0000d5b278，urs00008b8a41，urs0000e9b358。
14.优选的，所述生物标志物用于缺心血心肌病领域。
15.本发明第二个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包上述的生物标志物。
16.优选的，所述试剂盒还包括用于rna提取、反转录以及qpcr检测的试剂。
17.更优选的，所述试剂盒包括检测引物和内参的引物。
18.在本发明的一些具体实施例中，所述检测引物包括：
19.nr_157096.2，其正向序列为：aacttctctcccagtgcgaga(seq id no：1)；其反向序列为：tctcatgctggggtttggg(seq id no：2)；
20.urs0000d58c2c，其正向序列为：gctaaaatgtagtcagacagggc(seq id no：3)；其反向序列为：tgcttaacaccaccaaaggg(seq id no：4)；
21.nr_045494.1，其正向序列为：gcgggctttggatgtgaac(seq id no：5)；
22.其反向序列为：catcatgcctccaattctgga(seq id no：6)；
23.urs00008bcb71，其正向序列为：ccctcgtctcctttctcttcc(seq id no：7)；其反向序列为：gggtactcagtcatctcaccgc(seq id no：8)；
24.urs0000d58157，其正向序列为：tttattaccaaggttgccatcg(seq id no：9)；其反向序列为：gcactgcccagcatctttca(seq id no：10)；
25.nr_027451.1(norad)，其正向序列为：gcaacatctaagctttacgaatgg(seq idno：11)；其反向序列为：agtcctgacatacactgctcagagg(seq id no：12)；
26.urs0000d5800f(linc01060)，其正向序列为：cccgaaaggaagaagctatacg(seq id no：13)；其反向序列为：tgcgacactttatctaatgagtgtg(seq id no：14)；
27.nr_108060.1(vim-as1)，其正向序列为：tggtgagtgttcgcttatgagg(seq id no：15)；其反向序列为：caaagattctgcaagcaattagtcc(seq id no：16)；
28.优选的，所述内参引物为actb，其正向序列为：agcaagcaggagtatgacgagt(seq id no：17)；其反向序列为：tcaagaaagggtgtaacgcaa(seq id no：18)。
29.本发明第三个方面公开了根据上述的试剂盒在用于判断缺血性心肌病患者在接受干细胞治疗术后的预后以及术前判断是否对干细胞治疗敏感。
30.本发明第四个方面公开了一种可以预估缺血性心肌病患者接受冠状动脉旁路移植术联合自体骨髓单个核细胞移植术的预后和判断其是否对干细胞治疗敏感的方法，包括如下步骤：
31.(1)提取患者外周血血浆中的rna；
32.(2)进行反转录反应得到cdna；
33.(3)使用上述试剂盒中的引物检测对应的lncrna的相对表达量。
34.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
35.本发明发现了一种能够对干细胞疗法有参考价值的新的生物标志物，给缺血性心肌病患者带来了福音。
附图说明
36.图1为流程示意图。
37.图2为筛选差异lncrna的upset图。
38.图3为差异lncrna的差异聚类热图。
39.图4为qpcr检测结果证实部分lncrna在术后存在一定差异。
40.图5为qpcr检测结果证实部分lncrna在术前存在一定差异。
具体实施方式
41.(1)手术治疗及样本获取：在评估患者有相应的手术指征，取得知情同意后，采集患者的骨髓，分离其中的骨髓单个核细胞(autologous bm-mncs，abm-mncs)，然后常规行冠状动脉旁路移植术，在桥血管内回输分离的骨髓单个核细胞。在患者术前、术后1月清晨空腹时，抽取患者肘静脉处的静脉血，然后立即离心分离血浆，-80℃冻存。
42.(2)患者的分组：在术前以及术后1月时给患者行心脏超声检查，以术后与术前lvef(左心室射血分数)的差值δlvef≥5％为判定标准，将患者分为有反应(response，r)组和无反应(non response，nr)组。
43.(3)血浆游离rna的提取、鉴定、文库构建及测序：
44.根据患者术后的心超差异将患者分组，每组4例患者(每个病例术前术后2个样本，共计16个样本)术前以及术后1月留取的血浆样本进行研究。首先解冻血浆，使用qiagen mirneasy serum/plasma kit按照试剂盒说明中的步骤进行totalrna的提取，并在进行测序建库前，使用agilent 2100 bioanalyzer检测上一步提取的total rna，主要包括total rna的浓度、rin值、28s/18s和片段大小，评估提取的rna质量。之后将使用mgieasy rrna去除试剂盒去除核糖体rrna。在纯化之后，将rna在一定的温度和离子环境下片段化。随后使用mgieasy rna方向性文库制备试剂盒中的随机引物和反转录酶合成cdna一链，然后使用dna聚合酶i和rnaseh来合成双链的cdna。在cdna二链合成过程中，rna模板被去除，dttp被dutp所替换。dutp的参与使cdna的二链无法在后续流程中被扩增，因为聚合酶在延伸时无法跨过模板上的dutp位点。双链的cdna产物随后进行了加“a”碱基和接头连接。连接产物将被扩增，pcr产物热变性成单链，再用一段桥式引物将单链dna环化得到单链环状dna文库后
在dbseq平台上进行上机测序。
45.(4)差异lncrna的筛选
46.使用deseq2软件对术前及术后样本中测得的lncrna进行差异分析，满足|log2(flod change)|≥1且q value≤0.05认为存在显著差异，fold change为两组基因表达量的比值。需注意的是，deseq2方法基于负二项分布原理计算差异lncrna，并非直接通过表达量均值计算。结果如图2中所示，各组差异lncrna取交集之后，可以得到与r组的患者相比，nr组的患者外周血中，有5个lncrna表达上调，28个表达下调。该33例差异lncrna的实验结果如下表1所示(正数为上调，负数为下调)。
47.表1
48.[0049][0050]
(5)qpcr检测
[0051]
根据筛选结果检测部分差异lncrna，在数据库中差找对应的lncrna序列，我们委托广州锐博生物技术科技有限公司进行引物的设计和合成，每个lncrna设计一对包含正向
和反向序列的引物，使用actb作为内参基因，引物信息见表2所示。
[0052]
表2
[0053][0054]
采用两步法实时荧光定量聚合酶链反应(two-step real-time polymerase chain reaction，two-step rt-pcr)对目标lncrna进行检测。
[0055]
反转录反应使用primescript rt reagent kit(takara，rr037aa)按照说明配置逆转录反应体系如下表3所示：
[0056]
表3
[0057]
[0058][0059]
反转录反应程序设置依次为：37℃15min，然后85℃5sec，最后降温至4℃。
[0060]
在反转录反应结束后进行rt-pcr反应，使用tb green ex taq(takara，rr420b)根据说明配置pcr反应液，本研究中使用10μl体系，反应液的配置在冰上进行。体系如下表4所示。
[0061]
表4
[0062][0063]
应用rt-pcr反应程序设置为：预变性阶段：95℃，30sec，1次循环；pcr反应：95℃，5sec，60℃，34sec，40次循环。每个lncrna每个样本设置复孔3个，rna的相对表达量使用2
‑△△
ct
法计算得到。
[0064]
(6)结果如图4、图5所示，可以看到在两组患者的外周血中，术后和术前都存在着部分lncrna表达的差异，可以为判断患者的预后，亦或是在术前评估患者是否对干细胞疗法敏感提供参考。
[0065]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一组评估缺血性心肌病干细胞治疗的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自以下组别中的至少一种lncrna：urs00008bb784，urs00008c063c，urs0000d58c2c，nr_108060.1，nr_157096.2，urs00009b972a，urs00008c3bbf，urs0000d6230b，nr_045494.1，urs00009bbd07，urs0000780d40，urs0000eb717f，urs00008c0830，nr_109969.1，urs00008c3ec7，nr_027451.1，xr_924836.2，urs0000d5899b，urs00008befdf，urs00009c0b2e，urs00008bcb71，urs0000d5800f，urs0000eedd84，urs0000d6e6fb，urs00008c1d6b，urs0000d5b4de，urs00009be076，urs0000e951dc，urs0000ef1a40，urs0000d58157，urs0000d5b278，urs00008b8a41，urs0000e9b358。2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物用于缺心血心肌病领域。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-2所述的生物标志物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于rna提取、反转录以及qpcr检测的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测引物和内参的引物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测引物包括：nr_157096.2，其正向序列为：aacttctctcccagtgcgaga(seq id no：1)；其反向序列为：tctcatgctggggtttggg(seq id no：2)；urs0000d58c2c，其正向序列为：gctaaaatgtagtcagacagggc(seq id no：3)；其反向序列为：tgcttaacaccaccaaaggg(seq id no：4)；nr_045494.1，其正向序列为：gcgggctttggatgtgaac(seq id no：5)；其反向序列为：catcatgcctccaattctgga(seq id no：6)；urs00008bcb71，其正向序列为：ccctcgtctcctttctcttcc(seq id no：7)；其反向序列为：gggtactcagtcatctcaccgc(seq id no：8)；urs0000d58157，其正向序列为：tttattaccaaggttgccatcg(seq id no：9)；其反向序列为：gcactgcccagcatctttca(seq id no：10)；norad，其正向序列为：gcaacatctaagctttacgaatgg(seq id no：11)；其反向序列为：agtcctgacatacactgctcagagg(seq id no：12)；linc01060，其正向序列为：cccgaaaggaagaagctatacg(seq id no：13)；其反向序列为：tgcgacactttatctaatgagtgtg(seq id no：14)；vim-as1，其正向序列为：tggtgagtgttcgcttatgagg(seq id no：15)；其反向序列为：caaagattctgcaagcaattagtcc(seq id no：16)。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物为actb，其正向序列为：agcaagcaggagtatgacgagt(seq id no：17)；其反向序列为：tcaagaaagggtgtaacgcaa(seq id no：18)。8.根据权利要求3-7任一项所述的试剂盒在用于判断缺血性心肌病患者在接受干细胞治疗术后的预后以及术前判断是否对干细胞治疗敏感。9.一种可以预估缺血性心肌病患者接受冠状动脉旁路移植术联合自体骨髓单个核细胞移植术的预后和判断其是否对干细胞治疗敏感的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取患者外周血血浆中的rna；(2)进行反转录反应得到cdna；(3)使用权利要求3-8任一项所述试剂盒中的引物检测对应的lncrna的相对表达量。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于评估缺血性心肌病干细胞治疗的一组生物标志物及其试剂盒的应用，所述生物标志物选自33种差异lncRNA中的至少一种。本发明发现了一种能够对干细胞疗法有参考价值的新的生物标志物，给缺血性心肌病患者带来了福音。给缺血性心肌病患者带来了福音。给缺血性心肌病患者带来了福音。


技术研发人员：沈振亚 杨秭莹 陈一欢 黄浩岳 沈晗 姜垠昊 邵联波 滕小梅
受保护的技术使用者：苏州大学附属第一医院
技术研发日：2022.10.21
技术公布日：2023/8/9