人类ND4基因重组载体在制备ND4蛋白试剂盒中的应用

人类nd4基因重组载体在制备nd4蛋白试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，涉及人类nd4基因重组载体在制备nd4蛋白的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.leber遗传性视神经病变(leber hereditary optic neuropathy，lhon)是一种线粒体遗传病，呈母系遗传特点，主要表现为青年男性好发。临床表现多为双眼在数周至数月内，先后发生无痛性视力急剧下降至手动或光感，多数视力难以恢复，对患者的正常生活造成较大影响。lhon患者主要表现为眼部症状，少数可合并听力障碍，肌张力障碍等全身其他系统症状。
3.1988年wallace首次发现leber遗传性视神经病变与线粒体dna的11778位点的突变相关。目前主要认为m.11778g》a、m.14484t》c、m.3460g》a是lhon最主要的原发性致病突变位点。流行病学调查显示，不同人种的lhon患者三种原发性致病突变所占比例略有差异，但m.11778g》a始终为占比最高的原发性致病突变，且该位点突变的患者预后最差。
4.m.11778g》a主要影响线粒体复合体ⅰ的nd4亚基，该位点突变导致复合体ⅰ酶活力下降，进而影响线粒体的氧化磷酸化过程，使线粒体atp生成减少，ros水平增高，细胞凋亡增加，超过一定阈值时表现出相应的临床症状，最终导致患者rgc层变薄，视神经萎缩。
5.目前临床尚缺乏治疗leber遗传性视神经病变的有效手段，辅酶q
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、维生素c，活性氧自由基清除剂等药物可能对部分患者产生临床效果，但其疗效目前仍不明确。艾地苯醌作为辅助性治疗因子，目前认为可能仅对早期患者存在一定的治疗作用。目前，通过基因治疗技术，将突变蛋白的野生型基因导入细胞并进行正确的表达和定位，恢复线粒体功能，被认为是更具前景的lhon治疗方向。但该技术还存在基因表达效率过低，靶向性较差等缺点。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种人类nd4基因重组载体在制备nd4蛋白试剂盒中的应用。所述人类nd4基因重组载体的基因序列从n端到c端依次为cmv启动子，线粒体靶向序列cox8a-mts和优化后的核密码子编码的人类线粒体nd4核苷酸序列。
7.本发明所述编码nd4蛋白的核苷酸序列为优化后的核密码子编码的人类nd4基因，核苷酸序列如seq id no:1所示。该载体能在突变细胞中表达野生型nd4蛋白，替代突变倒置的nd4一场蛋白，进而缓解由m.11778g》a突变导致的leber遗传性视神经病变。
8.本发明所述核密码子编码的nd4蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明所述cmv启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示。
10.本发明所述线粒体靶向序列cox8a-mts如如seq id no:3所示。
11.本发明提供一种人类nd4基因重组载体，重组载体包含nd4基因核苷酸优化序列，能导入细胞并正常表达靶向人类线粒体的nd4融合蛋白，其核苷酸序列如seq id no:5所示。
12.优选的，所述重组载体的骨架载体为paav2-zsgreen，其核苷酸序列如seq id no:7所示。
13.本发明所述与nd4基因位于同一阅读框，能验证nd4基因异位表达的flag蛋白，其核苷酸序列如seq id no:6所示。
14.本发明提供一种nd4-flag基因重组载体，重组载体中人类线粒体nd4基因与flag基因位于同一阅读框，表达产生nd4-flag融合蛋白以检测蛋白表达和定位情况，nd4-flag基因重组载体的核苷酸序列如seq id no:8所示。
16.重组质粒能否进入细胞，正确表达人类线粒体nd4蛋白并使蛋白定位于线粒体，是重组质粒发挥功能的重要前提，为解决上述问题，本发明提供能高效异位表达nd4蛋白的细胞，优选的哺乳动物细胞为293t细胞(即人胚肾细胞)。
17.重组质粒在细胞内正确表达nd4蛋白并准确定位于线粒体后，能否提高m.11778g》a线粒体复合体ⅰ的酶活性，促进线粒体氧化磷酸化是nd4基因异位表达的目的。为解决上述问题，本发明提供m.11778g》a同质性突变的胞质融合细胞，该细胞使用购买自杭州芭蕉生物技术有限公司公司的143b细胞，去除线粒体后转入含m.11778g》a突变位点的线粒体构建而成。
18.为解决上述问题，本发明提供上述人类线粒体nd4基因重组载体异位表达试剂盒和方法制剂。
19.为解决上述问题，本发明提供上述人类线粒体nd4基因重组载体，包括筛选重组载体阳性克隆的试剂和蛋白制备及检测试剂盒。
20.为解决上述问题，本发明提供一种检测人类线粒体nd4基因重组载体异位表达时，对m.11778g》a线粒体复合体ⅰ酶活性影响的试剂盒，包括检测所需的1m tris-hcl，nadh和ntb试剂。
21.本试剂盒通过全基因合成方法，独创性地将野生型nd4线粒体密码子编码的基因调整为核密码子编码的基因，并对序列进行优化调整，以提高重组质粒nd4蛋白的表达效率。同时在野生型nd4核苷酸序列5’端添加线粒体靶向序列cox8a，使野生型nd4蛋白准确定位于线粒体并行使正常功能。该重组质粒介导的人类野生型线粒体nd4蛋白异位表达，为治疗m.11778g》a导致的lhon提供了研究思路与临床治疗方向。
22.本发明的有益效果主要如下：
23.1.本发明所述的人类线粒体nd4基因，其核苷酸序列为全基因合成方法构建，将线粒体密码子编码序列修改为核基因密码子编码的序列，并对密码子进行了优化，使重组质粒导入细胞后能正确翻译为有功能的野生型nd4蛋白并进行高效表达。
24.2.本发明所述人类线粒体nd4基因，其5’端连接有特异性线粒体靶向序列cox8a，能引导异位表达的野生型nd4蛋白正确定位于线粒体并发挥相应的功能。
25.3.本发明所述的人类线粒体nd4基因重组载体，能在m.11778g》a同质性突变的细胞中进行高效正确的表达和定位，通过提高线粒体复合体ⅰ的活性，恢复线粒体正常氧化磷酸化功能，为有效治疗m.11778g》a导致的leber遗传性视神经病变提供了广阔的研究思路和治疗方案。
hrnd4重组载体结构示意图如图1所示。
37.实施例3重组载体阳性克隆的筛选和鉴定本发明中，将实施例1和实施例2中得到的重组质粒导入感受态大肠杆菌dh5α中，37℃恒温箱amp
+
lb平板培养20h后挑选单菌落，将单菌落置于加入3ml amp
+
lb培养基中，37℃220rpm恒温震荡箱摇菌8h后进行菌液pcr。
38.菌落pcr所需特异性引物为：
39.1f：5
’‑
cgcaaatgggcggtaggcgtg-3’40.1r：5
’‑
ccagcttggttcccaataga-3’41.pcr反应体系(20ul)配置如下：双蒸水：7ul；2xpcr master mix：10ul；引物1f(10um)：1ul；引物1r(10um)：1ul；菌液：1ul。
42.菌落pcr扩增程序设置为：预变性95℃(3min)、变性95℃(30s)、退火55℃(30s)、延伸72℃1min，循环数35。
43.将pcr扩增产物进行120v 30min 1.2％的琼脂糖凝胶电泳，挑选有目标条带的菌落进行测序鉴定，测序所需特异性引物同菌落pcr，测序由杭州擎科生物技术有限公司完成。
44.测序结果分别符合seq id no:5和seq id no:8的重组质粒序列，所挑选的菌落即为包含目的重组质粒的菌落。
45.实施例4细胞内paav2-hrnd4flag免疫荧光检测。本实验中，将293t细胞按2x105/孔的数量接种在24孔透明细胞培养板中，使用无抗生素10％fbs高糖dmem培养基，37℃5％co2的细胞培养箱中培养，待细胞密度达90％时，使用hieff trans
tm liposomal transfection reagent(产品编号40802es03)脂质体核酸转染试剂盒转染paav2-hrnd4flag重组质粒。
46.将转染后的细胞置于37℃5％co2的细胞培养箱中培养4h后，更换为新鲜无抗生素10％fbs高糖dmem培养基继续培养48h，弃去培养基，1xpbs清洗3min，4％pfa室温固定10min。
47.使用0.25％tritonx-100处理细胞后，使用1％bsa溶液室温封闭1h。mouse anti ddddk-tag mab(abclonal ae005)和tom20 rabbit mab(abclonal a19403)按1：2000稀释后室温孵育1h。
48.1xpbs 5min 3次洗去一抗后，使用goat anti mouse alexa 488和goat anti rabbit alexa 594荧光二抗按1：2000稀释后室温孵育1h；洗去多余荧光二抗后dapi(1ug/ml)复染细胞核，用荧光显微镜观察荧光。
49.tom20是定位于线粒体外膜上的线粒体转运蛋白，属于线粒体特异性蛋白，可以作为线粒体定位marker蛋白。由于nd4基因和flag基因位于同一阅读框内，表达为nd4-flag融合蛋白，故flag蛋白可反应nd4蛋白的翻译与定位情况。
50.tom20与alexa 594荧光二抗结合显红色荧光，flag与alexa 488荧光二抗特异性
结合显绿色荧光，dapi染细胞核并显示蓝色荧光。293t细胞内paav2-hrnd4flag重组质粒flag蛋白表达免疫荧光结果如图3所示，结果显示，nd4-flag蛋白在细胞中能表达翻译并正确定位于线粒体。
51.实施例5细胞内paav2-hrnd4蛋白表达western-blot结果本实验中，将293t细胞按4x106数量接种于10cm细胞培养皿中，使用无抗生素10％fbs高糖dmem培养基，37℃5％co2的细胞培养箱中培养，待细胞密度达90％时，使用hieff trans
tm liposomal transfection reagent(产品编号40802es03)脂质体核酸转染试剂盒转染paav2-hrnd4重组质粒。
52.将转染后的细胞置于37℃5％co2的细胞培养箱中培养4h后，更换新鲜的10％fbs高糖dmem培养基，继续培养48h后收集细胞沉淀，加入ripa裂解液与蛋白酶抑制剂pmsf，充分裂解细胞后离心收集上清得细胞蛋白。
53.使用bca法测定蛋白浓度，将蛋白与loading buffer混匀后按20ug/孔的上样量进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过电转将蛋白转移至pvdf膜上，封闭后使用1:1000稀释的mt-nd4 rabbit pab(abclonal a17970)抗体4℃孵育过夜，洗膜后使用1：5000稀释的goat anti rabbit igg辣根过氧化物酶孵育2h，pbst洗去多余二抗后，使用hrp-ecl发光法进行显影。
54.用同种方法，使用gapdh mouse monoclonal antibody(proteintech cat no.60004-1-ig)检测样本中gapdh，以gapdh作为内参。293t细胞内paav2-hrnd4重组质粒nd4蛋白表达的western-blot结果如图4所示，对比western-blot结果可得，转入paav2-hrnd4flag与paav2-hrnd4重组质粒的293t细胞，其细胞内nd4蛋白的表达水平明显高于未转入重组质粒的293t细胞。
55.实施例6 m.11778g》a cybrid细胞线粒体复合体ⅰ胶内酶活水平检测本实验中，将cybrid-control细胞和m.11778g》a cybrid细胞按2x106数量接种于10cm细胞培养皿中，使用无抗生素的10％fbs高糖dmem培养基，37℃5％co2细胞培养箱中培养过夜。待细胞密度达90％时，使用hieff trans
tm liposomal transfection reagent(产品编号40802es03)脂质体核酸转染试剂盒分别转染paav2-hrnd4flag与paav2-hrnd4重组质粒。
56.将转染后的细胞置于37℃5％co2细胞培养箱中培养4h后更换新鲜10％fbs高糖dmem培养基，继续培养48h后收集细胞沉淀，使用匀浆液重悬细胞沉淀后，用组织匀浆机破碎细胞，离心后提取细胞线粒体。
57.使用bca法定量提取的细胞线粒体，按线粒体/洋地黄皂苷为8g/g的比例处理细胞线粒体以提取线粒体蛋白，测定提取获得的线粒体蛋白浓度，根据内参调整上样量，配置3％-11％的非变性梯度胶并进行blue native page电泳，电泳结束后小心取出凝胶，冰水中浸泡15min。
58.配置20ml线粒体复合体ⅰ底物溶液，配制方法如下：20ml ddh2o；1m tris-hcl(ph＝7.4)：40ul终浓度2mm；nadh：2mg(终浓度为0.1mg/ml)；ntb(nitrotetrazolium blue chloride)：50mg(终浓度2.5mg/ml)。
59.将bng胶放置于20ml复合体ⅰ的底物溶液(现配现用)中约45min，出现稳定紫色条带后取出，用10％醋酸终止酶促反应，ddh2o洗胶后扫描胶图。m.11778g》a cybrid细胞线粒体复合体ⅰ胶内酶活检测结果如图5所示，根据结果可见相对于不携带突变的cybrid-control细胞和分别转入paav2-hrnd4flag重组质粒、paav2-hrnd4重组质粒的m.11778g》a cybrid细胞，未进行任何处理的m.11778g》a cybrid细胞线粒体复合体ⅰ酶活性明显较低。

技术特征：
1.人类nd4基因重组载体在制备nd4融合蛋白试剂盒中应用，其特征在于，所述人类nd4基因重组载体的基因序列从n端到c端依次为cmv启动子，线粒体靶向序列cox8a-mts和优化后的核密码子编码的人类线粒体nd4核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人类nd4基因重组载体核苷酸序列为优化后的核密码子编码的人类nd4基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示，人类nd4基因重组载体能在突变细胞中表达野生型nd4蛋白，替代突变导致的nd4异常蛋白，进而缓解m.11778g>a突变导致的leber遗传性视神经病变。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核密码子编码的人类nd4基因翻译的nd4蛋白，其氨基酸序列如seq id no:2所示，所述线粒体靶向序列cox8a-mts如seq id no:3所示，cmv启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述重组载体的骨架载体为paav-zsgreen质粒，其序列如seq id no:7所示，所述重组载体为paav-nd4质粒，其序列如seq id no:5所示。

技术总结
本发明公开人类ND4基因重组载体在制备ND4蛋白试剂盒中的应用。通过全基因合成方法，合成核密码子编码的ND4核苷酸序列，构建人类ND4基因重组载体，将重组载体导入细胞后合成靶向线粒体的ND4蛋白，定位于线粒体并发挥功能。ND4基因重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明还公开了上述制备ND4蛋白的氨基酸序列，线粒体靶向序列，CMV启动子序列和表达载体序列。包括ND4蛋白制备方法与所用制剂。本发明所述人类ND4基因重组载体能在细胞中高效表达，制备的ND4融合蛋白能靶向线粒体，发挥正常ND4蛋白功能，缓解m.11778G>A突变导致的ND4蛋白异常对细胞功能造成的影响。致的ND4蛋白异常对细胞功能造成的影响。


技术研发人员：管敏鑫 冀延春 王静 陈加荣
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.10.09
技术公布日：2023/8/9