免疫功能障碍自闭症的辅助筛查方法和系统与流程

1.本发明设计医学诊断领域，更具体地涉及基于效应t细胞与诱导t细胞关系的自闭症诊断和严重程度判断。


背景技术：

2.自闭症谱系障碍(asd)，也被称为自闭症，是儿童最常见的神经发育障碍之一。asd是一组具有异质性精神障碍，其特征表现为不同程度的社交障碍、沟通困难、重复刻板的行为及狭隘的兴趣等，多数患者伴有明显的精神发育迟滞。不同国家的统计数据显示，asd的患病率逐年上升，asd在总人口中的发病率可达2％甚至更高。asd已成为儿童重要的精神致残疾病，随着发病率的不断增加，自闭症将继续给家庭和社会带来巨大的负担。
3.目前，asd评估的严重程度仅取决于患者的临床症状和对患者的专业医学评估，往往缺乏可靠的生物标志物或生理指标。
4.因此，本领域迫切需要开发新的有效地进行自闭症早期诊断或辅助诊断的方法和系统。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是提供一种新的有效地进行自闭症早期诊断或辅助诊断的方法和系统，尤其是针对免疫功能障碍自闭症的辅助筛查方法和系统。
6.在本发明的第一方面，提供了一种免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，所述系统包括：
7.(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一对象外周血单个核细胞中的t细胞亚群特征数据或用于计算所述t细胞亚群特征的原始数据；其中所述的t细胞亚群特征数据包括teff/treg比值特征,所述的teff细胞选自下组：th1、th2、th17或其组合；
8.(b)处理模块，所述处理模块用于对所述t细胞亚群特征数据或所述原始数据进行处理，从而获得筛查结果；
9.其中，所述处理包括：将teff/treg比值特征与参考对照值进行比较从而获得判别标准，其中，当所述严重程度评分高于所述参考对照值时，则提示所述对象为免疫功能障碍自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群；和
10.(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的诊断结果。
11.在另一优选例中，所述的用于计算所述t细胞亚群特征的原始数据包括：treg细胞的数量和teff细胞的数量。
12.在另一优选例中，所述的teff/treg比值特征选自下组:
13.(z1)th1/treg比值；
14.(z2)th2/treg比值；
15.(z3)th17/treg比值；
16.(z4)z1～z3的任意组合。
17.在另一优选例中，所述的teff/treg比值特征选自th1/treg比值和/或th2/treg比值，更佳地为th1/treg比值。
18.在另一优选例中，所述对象包括儿童。
19.在另一优选例中，所述对象的年龄为3～16岁。
20.在另一优选例中，当所述teff/treg比值特征数据包括≥两种不同的teff/treg比值时，所述处理还包括：将各个teff/treg比值与相应的标准值进行比较，从而获得评估评分，所述评估评分包括：风险程度评分和/或严重程度评分。
21.在另一优选例中，所述处理还包括：将风险程度评分与风险截断值进行比较比较，其中，当所述风险程度评分高于风险截断值时，则提示所述对象为免疫功能障碍自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
22.在另一优选例中，所述处理还包括：将严重程度评分与程度截断值进行比较，其中，当所述严重程度评分高于程度截断值时，则提示所述对象为严重免疫功能障碍自闭症患者或患严重免疫功能障碍自闭症的风险较高(即高于正常人群或一般免疫功能障碍自闭症患者)。
23.在另一优选例中，所述输入模块还用于输入自闭症的精神状态-行为学障碍评估数据。
24.在另一优选例中，所述的精神状态-行为学障碍评估数据包括用选自下组量表获得评估数据：自闭症精神状态检查量表、儿童孤独症量表、克式孤独症行为量表、异常行为量表、医院焦虑抑郁量表、或其组合。
25.在另一优选例中，所述的处理模块还包括：在所述处理过程中，将所述精神状态-行为学障碍评估数据与teff/treg比值特征进行综合分析，从而获得筛查结果。
26.在另一优选例中，所述的筛查结果包括：免疫功能障碍自闭症的行为学障碍类型的筛查结果，即将所述对象归入相应的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群。
27.在另一优选例中，所述的th1/treg比值特征高于所述参考对照值时，则提示所述对象为所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症患者，或所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
28.在另一优选例中，所述处理还包括基于th1/treg比值特征，将所述对象归入相应的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群。
29.在另一优选例中，所述的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群选自下组：“情感反应障碍自闭症人群”、“焦虑反应障碍自闭症人群”、“对环境变化的适应障碍自闭症人群”、“听觉反应障碍自闭症人群”及“焦虑抑郁障碍自闭症人群”，
30.在另一优选例中，所述的th2/treg比值特征高于所述参考对照值时，则提示所述对象为所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症患者，或所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
31.在另一优选例中，所述处理还包括基于th2/treg比值特征，将所述对象归入相应的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群。
32.在另一优选例中，所述的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群选自下组：“听觉反应障碍自闭症人群”。
33.在另一优选例中，所述的th17/treg特征高于所述参考对照值时，则提示所述对象
为所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症患者，或所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
34.在另一优选例中，所述处理还包括基于th17/treg比值特征，将所述对象归入相应的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群。
35.在另一优选例中，当所述的th17/treg特征高于所述参考对照值时，则提示所述对象为所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症患者，或所述行为学障碍的免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
36.在另一优选例中，所述的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群选自下组：“对环境变化的适应障碍自闭症人群”和“听觉反应障碍自闭症人群”。
37.在另一优选例中，在所述的处理模块中，如下进行免疫功能障碍自闭症严重程度评分：当th1/treg比值》0.63，提示所述对象患有免疫功能障碍自闭症或风险高于正常人群。
38.在另一优选例中，所述的输出模块用来输出不同行为学障碍的自闭症人群，其中所述不同行为学障碍的自闭症人群包括下组：
39.a1情感反应障碍自闭症人群；
40.a2焦虑反应障碍自闭症人群；
41.a3对环境变化的适应障碍自闭症人群；
42.a4听觉反应障碍自闭症人群；
43.a5焦虑抑郁障碍自闭症人群；
44.a6听觉反应障碍自闭症人群。
45.在另一优选例中，所述系统包括输入模块、处理模块和输出模块。
46.在本发明的第二方面，提供了一种teff/treg比值特征检测试剂的用途，所述检测试剂用于制备一试剂盒，试剂盒用于(a)辅助诊断免疫功能障碍自闭症，(b)用于评估免疫功能障碍自闭症的严重程度，和/或(c)判断免疫功能障碍自闭症的不同行为学障碍人群。
47.在另一优选例中，所述的teff/treg比值特征检测试剂包括：
48.human th1/th2/th17phenotyping kit，内含人cd4-percp-cy5.5(克隆号:sk3)特异性抗体；人il-17a-pe(克隆号:n49-653)；人ifn-γ-fitc(克隆号:b27)；人il-4-apc(克隆号:mp4-25d2)；
49.treg通过含有特异性抗体的人cd4-fitc(agilent technologies，克隆号:sk3)、cd3-pe-cy7(agilent technologies，克隆号:ucht1)、cd45-percp-cy5.5(agilent technologies，克隆号:hi30)、cd25-apc(agilent technologies，克隆号:m-a251)和cd127-pe(agilent technologies，克隆号:a019d5)进行检测；
50.其中，利用cd4
+
ifn-γ
+
表示th1细胞；cd4
+
il-4
+
表示th2细胞；cd4
+
il-17
+
表示th17细胞；cd45
+
cd3
+
cd4
+
cd25
+
cd127
dim
表示treg细胞。
51.在本发明的第三方面，提供辅助诊断asd的方法，包括步骤：
52.(a)提供某一对象外周血单个核细胞中的t细胞亚群特征数据或用于计算所述t细胞亚群特征的原始数据；其中所述的t细胞亚群特征数据包括teff/treg比值特征,所述的teff细胞选自下组：th1、th2、th17或其组合；
53.(b)对所述t细胞亚群特征数据或所述原始数据进行处理，从而获得筛查结果；
54.其中，所述处理包括：将teff/treg比值特征与参考对照值进行比较从而获得判别标准，其中，当所述严重程度评分高于所述参考对照值时，则提示所述对象为免疫功能障碍自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
55.在另一优选例中，所述对象包括儿童。
56.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
57.图1显示了受试者工作特征(roc)曲线。
58.图2显示了asd儿童与健康对照组之间t细胞cd4
+
ifn-γ
+
(th1)的差异。
59.图3显示了asd儿童与健康对照组之间treg细胞的差异。
60.图4显示了th1/treg比值高于中位数的asd患儿tgf-β相关性分析。
61.图5显示了th1/treg比值高于中位数的asd患儿细胞因子的关系。
具体实施方式
62.本发明人经过深入而广发的研究，首次意外地开发了一种免疫功能障碍自闭症儿童的辅助筛查系统。具体地，本发明人通过对t细胞亚群的teff/treg比值特征进行深入研究，发现teff/treg比值特征(如th1/treg比值和/或th2/treg比值)的高低与免疫功能障碍自闭症儿童的患病风险、行为学障碍严重程度、以及不同行为学障碍密切相关，从而建立了一种可辅助诊断免疫功能障碍自闭症的筛查系统和方法。在此基础上完成了本发明。
63.术语
64.本研究经中国临床试验注册中心(临床试验注册号:chictr1800018348)注册审核，并经昆明医科大学第二附属医院机构评审委员会(irb)批准(review-pj-2017-023)。研究参与者均获得了父母的知情同意。所有参与的患者的血清样本采集及后续分析均获得书面知情同意。书面同意书的副本可供查阅。
65.自闭症精神状态检查量表(amse)
66.自闭症心理状态检查是一种包含8项内容的心理状态检查工具，记录了asd的社交、交流和行为症状。amse记录社会互动，包括眼神接触、对他人的兴趣、指物能力、语言、语言的实用性、重复性行为/刻板行为、不寻常的或狭窄兴趣，不寻常的敏感性。美国的一项研究发现，当使用孤独症诊断观察量表(autism diagnostic observational schedule，ados)作为“孤独症谱系”诊断的标准时，amse评分大于或等于5的截断值时有极佳的敏感性和合理的特异性。根据dsm-5标准，中文版amse在总分≥6分(未发表数据)时，其敏感性为0.98，特异性为0.87。
67.儿童孤独症量表(cars)
68.儿童孤独症(自闭症)评定量表(childhood autism rating scale)(cars)是一个具有诊断意义的经标准化了的量表，是由e.schopler、r.j.reichler和b.r.renner于1980年所编制的
15.，评分标准如下：总分低于30分：初步判断为无孤独症；30-60分：有孤独症；其中30-36分：为轻到中度孤独症；37-60分，并至少有5项的评分高于3分：重度孤独症。(本
量表总分为60分)。儿童孤独症评定量表(cars)是目前使用最广的孤独症(自闭症)测试评定量表之一，适用于2岁以上儿童，信度、效度较好，其不仅能区分孤独症(自闭症)和智力障碍，而且还能判断孤独症的轻重程度，故有较大的实用性。
69.在本发明中，意外地发现，th1/treg比值特征与cars量表里的某些评分项的异常之间存在相关性。此外，还意外地发现，th2/treg比值特征与cars量表里的某些评分项的异常之间存在相关性，以及th17/treg比值特征与cars量表里的某些评分项的异常之间存在相关性。
70.例如，th1/treg比值特征与cars量表的焦虑反应项等的异常之间存在相关性。th2/treg比值特征与cars量表的听觉反应项等的异常之间存在相关性。th17/treg比值特征与cars量表的对环境变化的适应项的异常之间存在相关性。
71.在本发明，焦虑反应项的异常的自闭症在本发明中被定义为“焦虑反应障碍自闭症人群”。类似地，情感反应项异常的自闭症在本发明中被定义为“情感反应障碍自闭症人群”；对环境变化的适应异常的自闭症在本发明中被定义为“对环境变化的适应障碍自闭症人群”；听觉反应异常的自闭症在本发明中被定义为“听觉反应障碍自闭症人群”；焦虑抑郁异常的自闭症在本发明中被定义为“焦虑抑郁障碍自闭症人群”。
72.克氏孤独症行为量表(cabs)
73.克氏孤独症行为量表(clancy autism behavior scale，cabs)是1969年由clancy等编制，属于一种孤独症快速筛查量表，此表在孤独症的流行病学研究中广泛使用，其对孤独症和正常儿童或伴有其他障碍的非孤独症儿童有较好的鉴别意义，此表较为简洁方便，条目易于理解和评分，适合快速的筛查。
74.异常行为量表(abc)
75.异常行为量表(aberrant behavior checklist，简称abc)用于2-14岁儿童，是由患者父母来评估子女的问题行为的量表。是克鲁格等人(krug et al.1978)编制，1989年北京医科大学杨晓玲教授将其引进并进行了修订，主要用于孤独症儿童的筛查。孤独症儿童行为量表有57个描述孤独症儿童的感觉、行为、情绪、语言等方面异常表现的项目，可归纳为5个因子：
①
感觉；
②
交往；
⑧
躯体运动，
④
语言：
⑤
生活自理。总分158分；筛查界限分为53分，诊断分为67分。abc可有效评估症状改善程度，其中文版的各因子及总量表具有较好的信度及效度,适用于我国儿童孤独症群体的评估,具有一定推广使用价值。
76.医院焦虑抑郁量表(hads)
77.医院焦虑抑郁量表(hospital anxiety and depression scale，hads)由zigmond as与snaith rp于1983年创制。had共由14个条目组成，其中7个条目评定抑郁，7个条目评定焦虑。共有6条反向提问条目，5条在抑郁分量表，1条在焦虑分量表。焦虑与抑郁两个分量表的分值划分为0-7分属无症状；8-10分属症状可疑；11-21分属肯定存在症状。采用had的主要目的是进行焦虑、抑郁的筛选检查，因此重要的一点是确定一个公认的临界值。各研究中所采用的临界值不尽相同。hads显然只是一个焦虑和抑郁的筛查量表，最佳用途是作为综合医院医生筛查可疑存在焦虑或抑郁症状的病人。
78.照顾者压力问卷(cgsq)
79.照料者压力问卷(caregiver strain questionnaire，cgsq)由brannan等于1997年编制，2001年由北京大学精神卫生研究所引入国内使用，重测信度、同质信度和结构效度
较好。另有研究发现其在评定孤独症儿童照料者的压力问题上有较好的信效度。该量表共22项条目，每项均采用5级评分，总分越高，说明压力越大。
80.自闭症受试者的诊断与观察
81.研究人员使用两种评估量表来记录asd症状，即自闭症精神状态测试(amse)和儿童孤独症评定量表(cars)。一名接受过amse和cars评级相关培训的精神病学专科医师对所有受试者进行了评估。之后，amse总分≥6分、cars总分≥30分的受试者由一名儿童和青少年精神病学专家进行综合评估。采用最佳评估临床诊断(becd)方案(david grodberg et al.，2016)来判断患者是否符合dsm-5标准中的asd标准；在这些病例中，精神科医生仔细收集病史(主诉、现病史、既往病史、辅助检查结果和发育里史)，审查两种评估的结果，并与护理人员和患者面谈。
82.综合判断上述所有测试的结果，精神科专家将每个受试者诊断为asd和非asd。对于第一轮诊断不能确定的受试者，一个研究小组(包括1～2名儿童和青少年精神病科专家，以及1～2名精神病住院医师)重新审查所有的医疗文件，并在必要时与患者及其照顾者面谈，最后得出一个的最终结论。最后，研究小组还根据icd-10标准(the international classification of mental and behavioral disorders，第十版)确定入组受试者的亚型(f84)。
83.本发明的主要优点包括：
84.(a)首次提出了th1/treg的比值特征与asd疾病严重程度相关；
85.(b)本发明能够利用量化指标筛选出免疫功能异常的自闭症患者，使诊断结果更加客观；
86.(c)本发明能够利用量化指标在一定程度上辅助评估asd疾病的严重程度；
87.(d)本发明能够利用量化指标筛选出免疫功能异常的自闭症患者，可针对具有这一靶点异常的asd患者进行针对性的免疫治疗。
88.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
89.样本情况
90.本研究共纳入82名未经药物治疗的，临床诊断为asd的受试者，均来自昆明医科大学第二附属医院精神科。
91.健康对照组儿童来自昆明市和玉溪市。研究者采用心理发育筛选测验(dst)对6岁及6岁以下儿童进行总体发育水平评价。采用中国-韦氏儿童智力量表(c-wisc)，对6岁以上儿童进行问卷调查。所有参与本研究的受试者都被归类为发育水平或智力处于正常范围内。此外，一名儿科医生对孩子和他/她的照顾者进行问诊，以检查详细的病史。任何被诊断或疑似有以下诊断的健康受试者均被排除在本研究之外，包括精神障碍(精神分裂症、心境障碍、注意缺陷多动障碍、抽动障碍)、重大躯体疾病(急性或慢性传染病、自身免疫性疾病等)、以及血液疾病。
92.asd儿童和对照组在年龄、性别和种族等社会人口学特征上没有差异。表1为受试者社会人口特征信息。
93.表1受试者社会人口特征信息
[0094][0095][0096]
实施例1、pbmc和血清分离
[0097]
所有参与者在签署知情同意后，采用edta采血管(bd公司)和含有惰性分离胶的血清分离管(sst ii advance,bd公司)采集外周血。采用具有淋巴细胞分离试管sepmate
tm
(stem cell tech)分离外周血单个核细胞(pbmc)。分离后的单个核细胞，在pbs中洗涤两次，用于流式细胞术分析。2000g离心5min后收集血清，分装至ep管后-80℃保存，待进一步分析。
[0098]
实施例2、受试者pmbc中的t细胞表型
[0099]
pbmc在pbs中洗涤，洗涤完成后在1640培养基中培养，然后用pma/离子霉素和高尔基体阻断剂培养5小时。通过流式细胞术检测t细胞亚群，使用human th1/th2/th17phenotyping kit，内含人cd4-percp-cy5.5(克隆号:sk3)特异性抗体；人il-17a-pe(克隆号:n49-653)；人ifn-γ-fitc(克隆号:b27)；人il-4-apc(克隆号:mp4-25d2)；treg通过含有特异性抗体的人cd4-fitc(agilent technologies，克隆号:sk3)、cd3-pe-cy7(agilent technologies，克隆号:ucht1)、cd45-percp-cy5.5(agilent technologies，克隆号:hi30)、cd25-apc(agilent technologies，克隆号:m-a251)和cd127-pe(agilent technologies，克隆号:a019d5)进行检测。
[0100]
实施例3、bead-based细胞因子分析
[0101]
利用human aim-plex试剂盒(aimplex,cat#c60011)测定血清中il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-17a、tnf-α和ifn-γ水平。血清tgf-β用人tgf-β-plex试剂盒(aimplex,cat#b111206)进行定量检测。所有的实验都是根据制造商的说明书进行。
[0102]
实施例4、统计分析
[0103]
cars总分在30分以下的儿童为健康儿童，总分在30到36分之间的儿童为轻度到中度自闭症，而总分在37到60分之间的儿童为重度自闭症。采用spss21.0(lead technology inc.，charlotte,nc,usa)对数据进行分析。连续变量通过中位数
±
四分位数范围(qr)表示。用k-s检验(kolmogorov-smirnov test)测量分布的正态性。采用spearman秩相关分析asd组teff/treg与cars、cabs、abc、amse、hads、cgsq评分的比值，p值《0.05认为差异有统计学意义。
[0104]
结果
[0105]
1、asd儿童与健康对照组之间效应t细胞的差异
[0106]
由于效应t细胞(teff)参与了asd的免疫炎症反应，本发明人研究了teff在asd中的作用。分离82例asd患儿和50例健康儿童的pbmc，用pma/离子霉素(p+i)刺激，asd患者的teff细胞水平比健康对照明显上升,th1细胞(cd4
+
ifn-γ
+
)(asd组3.27(2.00,5.06)％vs正常组1.24(0.60,1.79)％,p《0.001),th2细胞(cd4
+
il-4
+
)(asd组0.76(0.38,1.28)％vs正常组0.28(0.10,0.44)％,p《0.001),th17细胞(cd4
+
il-17a
+
)(asd组0.69(0.16,1.04)％vs正常组0.23(0.12,0.55)％,p＝0.025)(表2及图2)。
[0107]
表2asd儿童与健康对照组之间t细胞亚群的差异
[0108][0109]
结果数据用中位数
±
四分位数范围(qr)表示。*p＜0.05.
[0110]
2、asd患者treg细胞减少
[0111]
cd4
+
foxp3
+
treg细胞在维持外周免疫耐受性方面起着核心作用，与健康儿童相比，asd患者的外周耐受性明显减弱，提示asd患者中treg细胞可能减少。因此，决定使用cd127(il-7ra)和cd25(il-2ra)这两种已知的treg标记物来比较asd和健康儿童之间的treg差异。虽然没有发现两组之间总cd4+t和cd8+t细胞比例有差异,但asd组中cd127-cd25
+
treg的频率相较于健康对照组明显减小，asd组1.20(0.84,1.70)％vs正常组4.71(3.03,7.19)％,p《0.001)(表2及图3)。
[0112]
3、asd患者的teff/treg比值改变
[0113]
已有研究证实，teff/treg细胞轴失衡与许多自身免疫性疾病的生物学异常密切相关。根据th1、th2、th17和treg在asd组中与健康对照表现出明显的差异，研究了asd患者是否存在teff/treg失衡，结果显示，asd患儿th1/treg比值(asd组3.07(1.05-6.18)vs.正
常组0.26(0.11-0.44)、th2/treg比值(asd组0.51(0.30-1.07)vs.正常组0.06(0.02-0.12)、th17/treg比值(asd组0.36(0.09-0.95)vs.正常组0.06(0.03-0.13)明显高于正常对照组(表3)。
[0114]
表3 asd儿童与健康对照组之间teff/treg的差异
[0115][0116]
结果数据用中位数
±
四分位数范围(qr)表示。*p＜0.05.
[0117]
4、asd患者与健康对照组相比出现炎症状态
[0118]
为探讨asd患者是否存在免疫系统功能障碍,收集了受试者的血液以分析各种促炎/抗炎细胞因子在血清asd(n＝82)和健康儿童(n＝50)中的表达情况。各种细胞因子包括th1(il-2),th2(il-4,il-5),asd组患者与健康对照组相比显著增加。与促炎细胞因子形成鲜明对比，asd患者血清中具有重要免疫调节功能的细胞因子tgf-β水平显著降低(表4)。这些结果表明与健康儿童相比，asd患者的免疫系统存在炎症状态。
[0119]
表4自闭症组与健康对照组外周血血清细胞因子浓度比较(pg/ml)
[0120][0121][0122]
结果数据用中位数
±
四分位数范围(qr)表示。*p＜0.05.
[0123]
5、asd患者teff/treg比值与行为学特征之间的关系
[0124]
为了确定asd儿童各种失调的免疫指标与asd行为的潜在关系，利用cars、cabs、abc、amse、hads、cgsq量表对asd的行为特征、临床体征和症状与asd患者自身的teff/treg比值进行相关性分析。spearman相关分析显示，th1/treg比率与“对环境变化的适应”(rs＝0.29,p《0.001)和“焦虑反应”(rs＝0.30,p《0.001)两个分量表得分呈显著正相关，与cars的另外两个分量表得分“语言交流”(rs＝-0.31,p《0.001)和“智力功能”(rs＝-0.31,p《0.001)呈显著负相关。(r＝-0.48,p《0.001)。th2/treg比率与cars的亚量表得分“非语言交流”(rs＝0.27,p＝0.021)呈正相关。th17/treg比率与cars的三个分量表得分“对环境变化的适应”(rs＝0.45,p《0.001)、“听觉反应”(rs＝0.25,p＝0.043)和“焦虑反应”(rs＝0.21,
p＝0.041)呈正相关(表5)。
[0125]
表5asd组患者teff/treg与cars总分及各分量表评分之间的相关分析(n＝82)
[0126][0127]
*p＜0.05.
[0128]
teff/treg比值与cabs评分的相关分析结果显示，th1/treg比值与cabs“聋听而不闻，好像是耳聋”(rs＝0.24,p＝0.048)，“不望对方的脸”(rs＝0.25,p＝0.041)和“不喜欢别人拥抱”(rs＝0.24,p＝0.048)三个分量表得分呈正相关。th2/treg比率与cabs的分量表“不停地动，坐不住，活动量过大”得分(rs＝0.25,p＝0.038)呈正相关。th17/treg比率与分量表“莫名其妙地笑”得分呈负相关(rs＝-0.25,p＝0.043)(表6)。
[0129]
表6 asd组患者teff/treg与cabs总分及各分量表之间的相关性分析(n＝82)
[0130][0131]
*p＜0.05.
[0132]
有趣的是，在asd患者的teff/treg比值与abc、cgsq、hads、amse评分的相关性分析中只有th1/treg与had评分呈正相关(r
焦虑
＝0.39,p＝0.028；r
抑郁
＝0.37,p＝0.043)(表7)。
[0133]
表7 asd组患者teff/treg与abc、cgsq、had、amse评分之间的相关性分析(n＝82)
[0134][0135]
在某种程度上，这些结果表明高水平的效应t细胞和降低的treg群体可能与asd的严重程度有关。
[0136]
6、th1/treg作为自闭症儿童免疫功能障碍或炎症的较好的辅助诊断标志物
[0137]
敏感性和特异性是诊断测试准确性的基本衡量标准。
[0138]
如图1所示，通过受试者工作特征(roc)曲线分析，th1/treg比th2/treg和th17/treg具有更高的敏感性和特异性。
[0139]
th1/treg曲线下面积(auc)为95.02％，约登指数(youden index)为80.24，截断值(cut point)为0.63。
[0140]
th2/treg的auc为94.74％，约登指数为80.68，截断值为0.17。
[0141]
th17/treg的auc为76.33％，约登指数为45.17，截断值为0.11。
[0142]
上述结果表明，当th1/treg》0.63时，患者的自闭症疾病严重程度评分(cars)与th1/treg有相关性。这提示患者是合并免疫功能障碍的自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。虽然将th1/treg的截断值定为0.63，仍然应理解，th1/treg越高，则提示患者的患自闭症的风险越高或自闭症更严重。
[0143]
当th2/treg》0.17时，则提示患者是合并免疫功能障碍的自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
[0144]
当th17/treg》0.11时，则提示患者是合并免疫功能障碍的自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群。
[0145]
7、teff/treg高比值(th1/treg
high
)asd患者中th1/treg与cars总分和分量表得分的相关性
[0146]
根据roc和auc的结果，从82例患者中筛选出高于th1/treg截断值以上的患者72例，这些患者的社会人口学特征总结如表8所示。再次分析了这一患者群teff/treg比率和cars总分和分量表得分的相关性。
[0147]
相关性分析结果如表9所示。
[0148]
spearman相关分析表明,th1/treg比率与四个分量表得分呈正相关,分别是“情感反应”(r＝0.38,p《0.001),“对环境变化的适应”(r＝0.35,p＝0.003),“听觉反应”(r＝0.32,p＝0.007),“焦虑反应”(r＝0.36,p＝0.002)以及与cars的总得分(r＝0.25,p＝0.036呈正相关),另一个分量表“智力一致性”得分则呈负相关“(rs＝-0.42,p《0.001)。th2/treg比率与cars的分量表评分“听觉反应”(rs＝0.25,p＝0.035)呈正相关。th17/treg比率与cars的两个分量表得分“对环境变化的适应”(rs＝0.41,p《0.001)、“听觉反应”(rs＝0.27,p＝0.022)呈正相关(表9)。
[0149]
表8：th1/treg
high asd患者社会人口特征信息表
[0150][0151]
表9 th1/treg
high asd患者teff/treg与cabs总分及各分量表之间的相关性分析asd children(n＝72)
[0152][0153][0154]
*p＜0.05.
[0155]
8、th1/treg高比值的asd患儿细胞因子相关分析:
[0156]
研究结果还表明，th1/treg高比值的asd患儿中，一些细胞因子也相应升高。如表
10所示，ifn-γ与il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-17a呈正相关。
[0157]
表10 th1/treg比值高于中位数之上的asd患者的血清细胞因子之间的相关性分析(n＝44)
[0158][0159]
*p＜0.05.
[0160]
9、th1/treg中位数以上asd患儿血清细胞因子浓度与对照组比较
[0161]
根据表3的结果，从82例th1/treg中位数以上的患者中筛选出44例患者，进行进一步分析。
[0162]
如表11所示，与正常对照组相比，44例asd患者血清中ifn-γ、tnf-α、il-4、il-5、il-6、il-10、il-17a显著升高，血清tgf-β水平均显著降低。
[0163]
表11 th1/treg比值高于中位数之上的asd患者的血清细胞因子浓度比较(n＝44)(pg/ml)
[0164]
[0165]
结果数据用中位数
±
四分位数范围(qr)表示。*p＜0.05.
[0166]
10、th1/treg比值高的asd患儿tgf-β相关性分析
[0167]
根据表3的结果，从82例th1/treg中位数以上的患者中筛选出44例患者，进一步分析tgf-β水平与cars评分的关系。
[0168]
结果如图4所示，th1/treg比值高的asd患儿中，tgf-β水平与cars评分呈负相关。
[0169]
11、th1/treg比值高的asd患儿细胞因子的关系
[0170]
根据表3的结果，从82例th1/treg中位数以上的患者中筛选出44例患者，进一步分析细胞因子之间的关系。
[0171]
在th1/treg比值高于中位数的asd患儿中，其外周血细胞因子ifn-γ、tnf-α、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-17a之间的相关性分布图如如图5所示。部分细胞因子之间存在一定的相关性。
[0172]
讨论
[0173]
长期以来，自闭症(autism spectrum disorder,asd)严重程度的评估主要依赖临床评估，评估时间较长，对临床医师的工作增加了一定的负担。此外，许多量表评估过于依赖父母对患者病情的描述报告，这些报告有时可能不准确，如夸大或隐瞒。因此，寻找一些相对可靠的生物标志物来评价asd患者的严重程度具有重要意义。
[0174]
尽管遗传因素被认为是asd的主要原因，然而免疫功能障碍在asd中也起着重要作用。神经免疫相互作用发生在胚胎发育的早期，并持续一生。神经发育受神经细胞和t细胞相互作用的调控，t细胞数量、活性的变化会影响神经系统的发育，任何t细胞亚群的过度激活都会导致神经组织的损伤。
[0175]
虽然一些asd患者存在t淋巴细胞功能障碍，然而，很多研究结果并不一致。例如，有研究发现asd患者的淋巴细胞总数和cd4
+
t辅助性淋巴细胞数量与健康对照组相比明显减少。asd患者体内可能参与了炎症病变的几种重要的辅助性t细胞亚群，如辅助性t细胞(th1)、辅助性t细胞2(th2)的相关报道也出现了不一致，例如，ashwood等发现asd患儿th1免疫反应受到抑制，而th2免疫反应增强。但之后ahmad等人却发现asd患者th1及th2的核心转录因子信号出现上调。的asd患儿的调节性t细胞(treg)水平较低。虽然在一些asd中观察到部分免疫异常，然而由于免疫系统的复杂性以及个体的差异性，在本发明之前，未报道过teff/treg比值特征在asd筛查或辅助诊断中的潜在价值。
[0176]
本发明的研究中，本发明人调查了82名asd儿童与50名健康儿童的各种免疫指标。通过“受试者工作特征曲线”(receiver operating characteristic，roc)分析，意外地发现th1细胞与treg细胞的比值是免疫功能障碍自闭症儿童的潜在辅助诊断标志物。通过儿童孤独症量表(child autism rating scale,cars)与asd严重程度的综合相关性分析，本发明人发现在一群高th1/treg比值(th1/treg
high
)的asd患者中，其th1/treg的比值与asd的疾病严重程度相关。这提示th1/treg可作为免疫功能障碍的自闭症儿童辅助诊断标志物，并可开发新的asd治疗靶点。
[0177]
具体地，在各种不同的免疫指标中，本发明人发现asd组th1/treg,th2/treg的比值相对于正常组是明显升高的。同时，通过相关性分析，发现asd组th1/treg,th2/treg,th17/treg的比值与患者的cars，cabs中的分量表评分出现相关性，特别是th1/treg表现出了更多的与分量表的相关性。同时，分析各种促炎/抗炎细胞因子在血清和健康儿童中的表
达情况。各种细胞因子包括th1(il-2),th2(il-4,il-5),th17(il-17a),asd组患者与健康对照组相比均显著增加。与促炎细胞因子形成鲜明对比，asd患者血清中具有重要免疫调节功能的细胞因子tgf-β水平显著降低。这些结果表明与健康儿童相比，asd患者的免疫系统存在炎症状态。此外，th1/treg还与had量表的焦虑评分，抑郁评分均呈正相关，这提示着th1/treg升高的asd表型可能与更严重的行为障碍有关。
[0178]
基于本研究设定的asd诊断标准，通过“受试者工作特征曲线”(receiver operating characteristic，roc)分析，本发明人发现th1/treg相对于th2/treg,th17/treg拥有较高的灵敏度和特异性，th1/treg可能是免疫功能障碍自闭症儿童的潜在辅助诊断标志物。
[0179]
之后，本发明根据roc和auc的结果，从82例患者中筛选出高于th1/treg截断值以上的患者72例，再次分析了这一患者群teff/treg比率和cars总分和分量表得分的相关性。结果显示这一部分患者th1/treg表现出了与cars的分量表有相关性，更重要的是它还与cars的总分有相关性，这进一步提示了th1/treg可以分类出一类免疫障碍的asd表型，并且这类表型的asd患儿随着比值的升高，出现了更严重的行为学障碍。
[0180]
最后，本发明人继续分析了th1/treg比值在中位数以上的患者细胞因子情况，从82例th1/treg中位数以上的患者中筛选出44例患者，与正常对照组相比，44例asd患者血清中ifn-γ、tnf-α、il-4、il-5、il-6、il-10、il-17a显著升高，血清tgf-β水平均显著降低。选出的44例患者，其tgf-β水平与cars评分呈负相关。这些结果说明，高th1/treg比值asd患者除了体现出t细胞亚群表型的不同特征，这些患者细胞因子的异常则说明患者的免疫在细胞功能的层面已经出现了异常，这些异常可能是加重这部分患者行为学恶化的原因之一。
[0181]
本发明的研究结果为t细胞亚群及其炎症因子在asd患者中的作用提供了新的见解，并为探索自闭症潜在的诊断和治疗策略提供基础。
[0182]
例如，在一些高th1/treg比值(th1/treg
high
)的asd患者中，其th1/treg的比值与asd的疾病严重程度相关，这提示th1/treg可作为免疫功能障碍的自闭症儿童辅助诊断标志物，并可开发新的asd治疗靶点。
[0183]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述系统包括：(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一对象外周血单个核细胞中的t细胞亚群特征数据或用于计算所述t细胞亚群特征的原始数据；其中所述的t细胞亚群特征数据包括teff/treg比值特征,所述的teff细胞选自下组：th1、th2、th17或其组合；(b)处理模块，所述处理模块用于对所述t细胞亚群特征数据或所述原始数据进行处理，从而获得筛查结果；其中，所述处理包括：将teff/treg比值特征与参考对照值进行比较从而获得判别标准，其中，当所述严重程度评分高于所述参考对照值时，则提示所述对象为免疫功能障碍自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群；和(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的诊断结果。2.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述的teff/treg比值特征选自下组:(z1)th1/treg比值；(z2)th2/treg比值；(z3)th17/treg比值；(z4)z1～z3的任意组合。3.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述输入模块还用于输入自闭症的精神状态-行为学障碍评估数据。4.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述的免疫功能障碍自闭症不同行为学障碍的人群选自下组：“情感反应障碍自闭症人群”、“焦虑反应障碍自闭症人群”、“对环境变化的适应障碍自闭症人群”、“听觉反应障碍自闭症人群”及“焦虑抑郁障碍自闭症人群”。5.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群选自下组：“听觉反应障碍自闭症人群”。6.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述的免疫功能障碍自闭症的行为学障碍人群选自下组：“对环境变化的适应障碍自闭症人群”和“听觉反应障碍自闭症人群”。7.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，在所述的处理模块中，如下进行免疫功能障碍自闭症评估：当th1/treg比值>0.63，则提示所述对象患有免疫功能障碍自闭症或风险高于正常人群。8.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述的输出模块用来输出不同行为学障碍的自闭症人群，其中所述不同行为学障碍的自闭症人群包括下组：a1情感反应障碍自闭症人群；a2焦虑反应障碍自闭症人群；a3对环境变化的适应障碍自闭症人群；a4听觉反应障碍自闭症人群；a5焦虑抑郁障碍自闭症人群；a6听觉反应障碍自闭症人群。
9.如权利要求1所述的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统，其特征在于，所述系统包括输入模块、处理模块和输出模块。10.一种teff/treg比值特征检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于(a)辅助诊断免疫功能障碍自闭症，(b)用于评估免疫功能障碍自闭症的严重程度，和/或(c)判断免疫功能障碍自闭症的行为学障碍类型。

技术总结
本发明提供了免疫功能障碍自闭症的辅助筛查方法和系统。本发明的免疫功能障碍自闭症辅助筛查系统包括：(a)输入模块；(b)处理模块，所述处理模块用于对所述T细胞亚群特征数据或所述原始数据进行处理，从而获得筛查结果；其中，所述处理包括：将Teff/Treg比值特征与参考对照值进行比较从而获得判别标准，其中，当所述严重程度评分高于所述参考对照值时，则提示所述对象为免疫功能障碍自闭症患者或患免疫功能障碍自闭症的风险高于正常人群；(c)输出模块。本发明可以对免疫功能障碍自闭症进行辅助筛查，对免疫功能障碍自闭症的行为学障碍严重程度分析起辅助作用。重程度分析起辅助作用。


技术研发人员：曹霞 聂祖庆 康传媛 徐莉 韩冬 张琨 赵琳 李志伟 李萌 申晨 文婕 杨淑钧
受保护的技术使用者：曹霞
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/9