基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医学以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用。


背景技术：

2.近年来，新型冠状病毒导致大量的病毒性肺炎病例。2020年1月，新型冠状病毒的序列首次被公布出来，随后被命名为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars-cov-2)，该病毒感染引起的肺炎命名为“covid-19”(corona virus disease2019)。该病毒各个年龄段的人均易感，尚无有效的治疗性药物。现阶段，该病毒的控制主要依赖于物理隔离与疫苗接种。
3.本领域中，当前研发疫苗主要分为5个技术路线，分别是：灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗和减毒流感病毒载体疫苗。腺病毒由于转导效率高、可携带外源基因，易于扩增及纯化，能够激起针对外源基因有效的t细胞免疫反应，被视为优良的疫苗载体，此外已被广泛应用于各种传染病疫苗的研究，包括hiv、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病等。目前基于腺病毒载体的一代新冠疫苗，已被批准紧急使用的有：英国阿斯利康的ady25腺病毒载体疫苗、美国强生的adhu26腺病毒载体疫苗、中国康希诺的adhu5腺病毒载体疫苗、俄罗斯的adhu26与adhu5组合腺病毒载体疫苗。
4.上述这些已经研发的腺病毒疫苗证明了基于腺病毒载体的新冠疫苗的安全性和有效性。然而，随着病毒的持续传播，出现了越来越多的病毒突变株，比如世界卫生组织(who)列为值得关切的变异株(voc)：b.1.1.7(alpha)、b.1.351(beta)、p.1(gamma)、b.1.617(delta)，列为值得关注的变异株(voi)：c.37(lambda)等。与原始株相比，一些突变株产生了不同程度的免疫逃避。比如，beta、gamma、delta、lambda突变株能显著逃逸既往自然感染原始株个体所诱导的中和抗体反应，而alpha突变株则影响较小。现行的较多的疫苗还都是基于病毒的原始株设计研发的，部分突变株也存在显著的免疫逃逸，使得疫苗效果受到影响，引起了大众的担忧。所以，研发广谱的新冠疫苗迫在眉睫。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用。
6.在本发明的第一方面，提供一种制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的疫苗的方法，包括：
7.(1)在腺病毒载体中引入下组元件，获得重组腺病毒载体：
8.①
突变型spike蛋白的编码基因，或突变型spike蛋白-t细胞表位串的编码基因；其中所述t细胞表位串来自于该病毒的orf1、orf3和m蛋白；
9.②
受体结合基序(rbm)或突变型受体结合基序的编码基因；
10.(2)基于(1)的重组腺病毒载体进行病毒的包装，获得重组腺病毒疫苗。
11.在一个或多个实施方式中，所述的突变型(蛋白)包括：点突变(蛋白)，截短体(蛋
白)，n或c端增加氨基酸后的蛋白。
12.在一个或多个实施方式中，所述的点突变为一个或多个位点的突变。
13.在一个或多个实施方式中，所述突变型spike蛋白包括：两个异源的rbd二聚体(4rbd)或两个异源的rbd截短体二聚体(4trbd)；较佳地，两个异源的rbd二聚体(4rbd)包括：一个异源二聚体rbdδ和另一个异源二聚体rbdβγ，该rbdδ中的一个rbd单体相应于spike蛋白序列的第452位发生l452r突变，第478位发生t478k突变，另一个rbd单体未进行氨基酸改变，两个不同的rbd单体串联形成异源二聚体；该rbdβγ在相应于spike蛋白序列的第417、484、501位发生突变，其中一个rbd单体为k417t、e484k、n501y，另一个rbd单体为k417n、e484k、n501y(更佳的异源二聚体rbd的组合顺序及氨基酸突变包括但不限于上文所述，如包含omicron突变株rbd突变位点的rbd单体)，两个不同的rbd单体串联形成异源二聚体；较佳地rbd截短体仅存在相应于spike蛋白序列第319-537位氨基酸序列；较佳地以信号肽引导该突变型spike或异源二聚体rbd蛋白的表达(更佳地该信号肽包括但不限于spike蛋白的信号肽)。
14.在一个或多个实施方式中，所述突变型spike蛋白包括：来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2原始株或变异株的spike蛋白；较佳地，所述来自变异株的spike蛋白，包括(但不限于)以下的突变：k417n、n440k、g446s、l452r、s477n、t478k、e484k、e484a、t487k、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、a570l、t572i、d614g、p681h、r682s、r685g、f855y、n856i、k986p、v987p，或其组合；较佳地，所述spike蛋白为seq id no:3所示氨基酸序列的蛋白(vs)，或为发生n501y、a570l、t572i、d614g、p681h、r682s、r685g、f855y、n856i、k986p和v987p突变的spike蛋白(vsc)，或为发生l452r，t487k，n501y，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p突变的spike蛋白(vsδ)，或为发生k417n，n440k，g446s，s477n，t478k，e484a，q493r，g496s，q498r，n501y，y505h，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p突变的spike蛋白(vso)。
15.在一个或多个实施方式中，所述t细胞表位串串联有seq id no:2中第2-48位的来源于orf1的表位、第49-153位的来源于orf3的表位和第154-208位的来源于m蛋白的表位。
16.在一个或多个实施方式中，所述受体结合基序包括：来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2原始株或变异株的受体结合基序；所述突变型受体结合基序包括截短型受体结合基序，较佳地包括选自：seq id no:4～7任一所示氨基酸序列的蛋白。
17.在一个或多个实施方式中，所述腺病毒载体中还引入以下元件的编码基因：来源于流感病毒m1、m2和np蛋白的t细胞表位；较佳地，其位于严重急性呼吸综合征冠状病毒2的t细胞表位串的附近(靠近sars-cov-2的t细胞表位串或与sars-cov-2的t细胞表位串操作性连接，如位于sars-cov-2的t细胞表位串的n端或c端)；较佳地，其氨基酸序列如seq id no:2中第209-354位。
18.在一个或多个实施方式中，所述腺病毒载体中还引入以下元件的编码基因：来源于h1n1流感病毒的ha蛋白；较佳地，其位于t细胞表位串附近(位于t细胞表位串n端或c端，中间以2a序列连接)；较佳地，其氨基酸序列如genbank登录号：acp41953.1。
19.在一个或多个实施方式中，所述腺病毒载体包括：腺病毒载体adc68xy，adc6，adc7,adhu5,adc63,adhu26；较佳地，所述adc68xy包括以黑猩猩型腺病毒adc68基因组为基础的序列，其中e1序列和e3序列被删除，e4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒
adhu5基因组中相应的e4序列或其片段替换adc68基因组中e4序列或其片段。
20.在一个或多个实施方式中，所述adc68xy包括(但不限于)下组改造的载体：
21.(a)以adhu5基因组e4序列替换adc68基因组e4序列；更佳地，删除区域为adc68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入adhu5基因组第32914-35641位序列；
22.(b)以adhu5基因组e4序列中orf6及orf6/7区序列替换adc68基因组e4序列中orf6及orf6/7区序列；更佳地，删除区域为adc68基因组第33518-34671位序列，在该删除区域插入adhu5基因组第32914-34077位序列；或
23.(c)以adhu5基因组e4序列中orf3～orf6序列替换adc68基因组e4序列中orf1～orf6/7序列；更佳地，删除区域为adc68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入adhu5基因组第33193-34703位序列。
24.在一个或多个实施方式中，所述spike蛋白的编码基因、ha蛋白的编码基因、t细胞表位串编码基因及受体结合基序编码基因在腺病毒载体中为操作性连接的；较佳地，各蛋白编码基因顺序可变。
25.在一个或多个实施方式中，所述突变型spike蛋白的编码基因或突变型spike蛋白-t细胞表位串的编码基因或突变型spike蛋白-t细胞表位串-流感ha蛋白的编码基因引入到腺病毒的e1删除区域、e3删除区域和/或e4区域等。
26.在一个或多个实施方式中，所述受体结合基序插入到腺病毒载体中结构蛋白fiber编码基因上或结构蛋白hexon/penton，较佳地，插入位置为fiber的hi loop。
27.在一个或多个实施方式中，突变型spike蛋白的编码基因与t细胞表位串的编码基因之间，还包括连接序列；较佳地所述连接序列为2a序列；更佳地所述连接序列为e2a、p2a、t2a或f2a。
28.在一个或多个实施方式中，所述两个异源的rbd二聚体(4rbd)之间，通过2a序列进行连接；较佳地t细胞表位串位于两个异源rbd二聚体之间，各蛋白编码基因序列间通过2a序列连接。
29.在一个或多个实施方式中，所述两个异源的rbd截短体二聚体(4trbd)之间，通过2a序列进行连接；较佳地t细胞表位串位于两个异源rbd截短体二聚体之间，各蛋白编码基因序列间通过2a序列连接。
30.在一个或多个实施方式中，(2)中，所述方法还包括：对所述含有病毒的培养液进行纯化。
31.在一个或多个实施方式中，(2)中，所述重组腺病毒疫苗中还添加免疫佐剂，例如但不限于氢氧化铝佐剂。
32.在一个或多个实施方式中，(2)中，所述重组腺病毒疫苗中还含有药学上可接受的载体。
33.在一个或多个实施方式中，所述编码基因是经过密码子优化后的dna序列或天然的dna序列。
34.在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒载体，其中引入下组元件：
①
突变型spike蛋白的编码基因，或突变型spike蛋白-t细胞表位串的编码基因或突变型spike蛋白-t细胞表位串-流感ha蛋白的编码基因；其中所述t细胞表位串来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2的orf1、orf3和m蛋白或新冠病毒的orf1、orf3和m蛋白及流感病毒的m1、m2和np
蛋白；
②
严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合基序或突变型严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合基序的编码基因。
35.在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒，其由前面所述的重组腺病毒载体包装获得。
36.在一个或多个实施方式中，将所述的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。
37.在一个或多个实施方式中，所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地为整合腺病毒e1基因的细胞；较佳地包括(但不限于)：hek293细胞。
38.在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒的应用，用于制备抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染或流感病毒感染的药物组合物或药盒；较佳地，所述严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染或流感病毒感染导致的疾病包括：病毒性肺炎、严重急性呼吸道感染、肠道疾病、心脏衰竭、肾衰竭或严重急性呼吸道综合征；较佳地，所述药物组合物为疫苗。
39.在本发明的另一方面，提供一种抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2和/或流感病毒感染的药物组合物或药盒，所述的药物组合物或药盒中含有：有效量的所述的重组腺病毒，可选地还含有免疫佐剂；和药学上可接受的载体；较佳地，所述药物组合物为疫苗。
40.在一个或多个实施方式中，所述疫苗为液体疫苗或喷雾型疫苗。
41.在一个或多个实施方式中，所述疫苗包括但不限于：鼻腔内给药剂型、肌肉内给药剂型、静脉内给药剂型、皮内给药剂型或皮下给药剂型。
42.在本发明的另一方面，提供一种用于制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2和/或流感病毒感染的疫苗的试剂盒，包括：前面所述的重组腺病毒载体；病毒生产细胞。
43.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
44.图1、c57bl/6小鼠针对spike(a)和nucleoprotein(b)的结合抗体。
45.图2、c57bl/6小鼠免疫adc68xy3-s、adc68xy3-vsn后2周、4周和8周中和抗体滴度(a-b)，以及免疫adc68xy3-vsmnl-vtrbm后2周的中和抗体滴度(c)。
46.图3、adc68xy3-vsn和adc68xy3-vsmnl-vtrbm诱导小鼠针对spike的t细胞反应：a为鼻腔免疫(i.n.)结果，b为肌肉免疫(i.m.)结果。
47.图4、adc68xy3-vsn和adc68xy3-vsmnl-vtrbm诱导小鼠针对nucleoprotein的t细胞反应：a为鼻腔免疫结果，b为肌肉免疫。
48.图5a-c、优化后的候选疫苗的结合抗体水平。
49.图6、优化后的候选疫苗adc68xy3-vs-vtrbm的中和抗体水平。
50.图7a-b、优化后候选疫苗adc68xy3-4rbdt-c.37、adc68xy3-4trbdt-c.37、adc68xy3-4rbdtha-c.37和、adc68xy3-4trbdtha-c.37和adc68xy3-vst-vtrbm诱导的中和抗体水平。
51.图8、优化后候选疫苗adc68xy3-vst-vtrbm诱导的t细胞免疫反应。a为spike特异性的t细胞免疫反应；b为orf1、orf3和m特异性的t细胞免疫反应。
52.图9、优化后候选疫苗adc68xy3-4rbdt-c.37和adc68xy3-4trbdt-c.37诱导的t细胞免疫反应。a为rbd特异性的t细胞免疫反应；b为插入的新冠t细胞表位(orf1、orf3和m)特异性的t细胞免疫反应。
具体实施方式
53.本发明人经过深入的研究，揭示了一种基于腺病毒的针对新冠病毒的广谱性重组腺病毒疫苗。所述的重组腺病毒表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的spike蛋白、t细胞表位串及受体结合基序(rbm)。本发明的重组腺病毒作为疫苗，能够激活机体产生针对sars-cov-2的很强的应答，对各种新冠病毒突变株的复制都能起到理想的控制效果、具有广谱性；且可提高机体对病毒的清除能力。
54.术语
55.如本发明所用，术语“新型冠状病毒”、“2019新型冠状病毒”、“2019-ncov”和“sars-cov-2”可互换使用，均为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)”的简称。
56.如本发明所用，术语“表面刺突蛋白”、“spike蛋白”和“s蛋白”具有相同的含义，可互换使用，是指sars-cov-2的一种膜蛋白。
57.如本发明所用，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid-19”是指，因sars-cov-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
58.如本发明所用，术语“原始的”、“野生的”或“天然的”可互换地使用。当这些术语用于描述核酸分子、多肽(蛋白)或病毒时，其表示该核酸分子、多肽(蛋白)或病毒在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰或加工。如本发明所用，原始的sars-cov-2(原始株)的spike蛋白是指天然存在的，具有生物学活性的spike蛋白。本领域技术人员可以方便地从各种公共数据库(例如genbank数据库)获得spike蛋白的氨基酸序列。
59.如本发明所用，术语“载体”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，腺病毒、腺相关病毒、逆转录酶病毒(包括慢病毒)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
60.如本发明所用，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293(a)细胞或人细胞等的动物细胞。
61.如本发明所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体(腺病毒载体)。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上
保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。
62.如本发明所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
63.如本发明所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的dna片段的单链或者双链dna分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。
64.如本发明所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的核酸与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
65.如本发明所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。
66.如本发明所用，“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本发明所用。
67.如本发明所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
68.优化的新型腺病毒疫苗
69.本发明建立了一种优化的腺病毒载体、以用于sars-cov-2病毒疫苗的制备。所述的腺病毒载体包括以下操作性相连的元件：突变型spike蛋白的编码基因，或突变型spike蛋白-t细胞表位串的编码基因；以及，受体结合基序(rbm)或突变型受体结合基序的编码基因。
70.spike突变
71.sars-cov-2病毒属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars-cov-2病毒的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank登录号：nc_045512.2。sars-cov-2病毒至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars-cov-2病毒的受体是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptor binding domain，rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后，病毒进行膜融合和入胞，s蛋白在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。spike蛋白简称s蛋白，可作为抗原，也可称为“s抗原”。
72.本发明中，包括原始病毒株来源的spike蛋白，也包括各种变异病毒株来源的spike蛋白或人工突变的spike；在本发明优化的方案中，应用突变型的spike，例如本发明实施例中称为vs、vsc、vsδ、vso的突变型spike。
73.在优化候选疫苗时，本发明人应用了spike的rbd区域(spike的319-541位氨基
酸)，较佳地该rbd为相应于spike的319-541位氨基酸的区域。考虑到半胱氨酸可能会影响rbd蛋白的稳定性。
74.在另一优选的方案中，本发明人应用该rbd的截短体(trbd)，在实施例中，该trbd呈现了良好的稳定性。本发明中，包括原始病毒株来源的rbd单体，也包括各突变株来源的rbd单体或人工突变的rbd单体，发明人将含两个不同突变的rbd单体串联，形成二聚体，即异源的rbd二聚体。两个异源的rbd二聚体或trbd二聚体操作性连接，从而形成4rbd或4trbd。应理解，除了本发明提供具体序列的突变rbd，进一步还可包含其它突变的rbd，如含omicron突变株突变位点的rbd。尽管本专利中优选两个异源的rbd二聚体或trbd二聚体，但也可采用三个或四个异源rbd二聚体，不同突变的rbd组合及排列顺序是可以变化的。
75.t细胞表位串
76.sars-cov-2属于rna病毒，传播的过程中容易出现突变，产生突变株。在病毒防控过程中，除了lgg介导的体液免疫外，细胞免疫对病毒的清除也起到了重要的作用。sars-cov-2的突变集中在spike上，其它基因相对保守。在优化候选疫苗时，经过反复研究，本发明人分离了sars-cov-2的orf1、orf3和m基因上的多个t细胞表位，构成串联的表位序列(融合序列)，插入到腺病毒中进行表达。本发明人惊讶地发现，这可非常有效地激活机体产生针对新冠病毒保守区的t细胞反应。应理解，除了本发明提供具体序列的表位串结构，进一步还可包含其它的t细胞表位。尽管本发明中优选cov2t(seq id no:2，第2-208位)序列，但分别来源于orf1、orf3和m基因上的表位序列的排列顺序是可以变化的。
77.除了所述应用来自sars-cov-2的t细胞表位串，还可进一步引入来自其它病毒的表位，从而形成联合疫苗。所述的其它病毒优选地为导致流行性传染疾病的病毒。例如，流感病毒，其它冠状病毒，带状疱疹病毒，单纯疱疹病毒，呼吸道合胞病毒。在本发明的优选实施例中，应用了来自流感病毒m1、m2和np蛋白的t细胞表位及ha蛋白。实验结果显示，本发明成功制备获得联合疫苗，在针对sars-cov-2产生中和抗体的基础上，还能针对流感病毒产生中和抗体。
78.受体结合基序
79.本发明的腺病毒表达载体中，还包括受体结合基序(rbm)或其截短体(trbm)，较佳地将rbm展示在腺病毒的结构蛋白fiber上，从而可进一步诱导机体产生针对新冠病毒的中和抗体；此外，也可展示在腺病毒的其他结构蛋白上，如hexon、penton等。
80.尽管本发明中优选截短的rbm(相应于spike序列的451-501位)，但全长序列的rbm也是可用的(相应于spike序列的451-525位)。截短体蛋白与全长蛋白相比，缩减了自身长度，在腺病毒结构蛋白上外源基因装载量有限的情况下，本发明的截短的rbm及其变体可尽可能展示新冠病毒与受体hace2的结合位点，引起相对应的中和抗体。
81.本发明中，提供了串联的蛋白(融合蛋白)、突变体蛋白和/或截短体蛋白。通过一系列改造，本发明成功获得优化的新型腺病毒疫苗。
82.本发明串联的蛋白(融合蛋白)、突变体蛋白或截短体蛋白可以是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从宿主中产生。
83.本发明还包括所述串联的蛋白、突变体蛋白或截短体蛋白的片段、衍生物和类似物，其基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。所述片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的
突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白。此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。
84.本发明在提供具体的序列的基础上，与所述序列具有85％以上(较佳地90％以上，92％以上，95％以上，98％以上或99％以上)的序列相同性(同源性)的蛋白也被包含在本发明中。然而，应理解，对于本发明中所指定的特定突变位点而言，这些位点的氨基酸应根据本发明所指定而保守地存在。
85.本发明也包括这些蛋白的编码基因。所述“编码基因”的序列通常可以通过pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。用人工合成的方法来合成有关序列、可选地将突变引入到序列中也是本领域常用的技术。
86.本发明提供了包含所述串联的蛋白、突变体蛋白或截短体蛋白的编码序列的载体，其为腺病毒载体。
87.腺病毒的基因组比较大，在此前的研究中，本发明人尝试了多种腺病毒改造方案，提供了优选的基于黑猩猩型腺病毒的改造策略。在本发明的优选方式中，以黑猩猩型腺病毒adc68为模板，利用其基因组序列，制备e1/e3删除的复制缺陷型重组腺病毒载体。腺病毒基因组包含e1-e4早期基因，e1a可激活e1b、e2a、e2b、e3和e4的启动子。腺病毒e4区包括7个开放阅读框，其产物分别为orf1、orf2、orf3、orf4、orf3/4、orf6和orf6/7。在更为优选的方案中，本发明人将adc68的e4序列全部或部分替换成adhu5的e4序列，设计成多个分别带有不同e4序列的重组adc68载体，分别命名为adc68xy1、adc68xy2、adc68xy3、adc68xy4。
88.在本发明的优选方式中，提供了一种重组腺病毒载体(质粒)，该重组腺病毒载体包括：改造的黑猩猩型腺病毒adc68基因组序列；其中e1全部序列和e3部分序列被删除，e4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒adhu5基因组中相应的e4序列或其片段替换adc68基因组中e4序列或其片段。作为本发明的更优选方式，所述改造选自：(a)adhu5基因组e4序列替换adc68基因组e4序列；(b)以adhu5基因组e4序列中orf6及orf6/7区序列替换adc68基因组e4序列中orf6及orf6/7区序列；或(c)以adhu5基因组e4序列中orf3～orf6序列替换adc68基因组e4序列中orf1～orf6/7序列。
89.可选地，所述的腺病毒载体还可包括报告基因、反向末端重复序列和/或酶切位点。应理解，报告基因、酶切位点等元件的设计有时候是为了在进行研究时提供方便观测或检测的途径，而当将本发明的重组腺病毒载体或重组腺病毒应用于临床药学领域时，其并非是必要的；或者，可以在所述报告基因的位置上以能表达具有药学活性的目的蛋白的基因替代。
90.所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。根据本发明的提示，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如cmv)上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止
子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
91.本发明的表达载体中的各元件是可操作性连接的，从而有利于病毒的包装或目的蛋白的有效表达。
92.获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。所述的病毒生产细胞可以是本领域公知的各种能够繁殖腺病毒的细胞，例如hek293(a)细胞等。
93.作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(tcid
50
)的测定可以根据本领域常规方法进行。所获得的重组腺病毒也包含在本发明中。
94.疫苗组合物及药盒
95.本发明还提供了一种组合物(疫苗组合物)，它含有有效量的所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。所述的腺病毒能够表达spike蛋白、t细胞表位串及rbm。
96.通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地，ph约为6-8。
97.本发明的药物组合物可以被制成注射剂、冻干粉剂、喷雾剂等给药剂型，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。例如，所述腺病毒疫苗可以是鼻腔内注射剂、肌肉内注射剂、静脉内注射剂、皮内注射剂或皮下注射剂。在实际应用时，可以根据转染效率、局部免疫监视等临床需要进行调整和选择，如选择单一的剂型进行注射免疫，或者选择多种混合剂型进行注射免疫。活性成分(重组腺病毒)的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
98.所述的药物组合物以单位剂量形式存在。
99.本发明还提供了一种试剂盒/药盒，其中包括所述的腺病毒表达载体或所述的腺病毒。所述的试剂盒/药盒还可包括病毒生产细胞(如293细胞)，培养基等。此外，所述的试剂盒/药盒中还可包括说明表达方法后腺病毒使用方法的使用说明书。
100.针对新冠病毒，本发明的腺病毒疫苗(组合物)具有广谱性，对各种新冠病毒突变株的复制都能起到更好的控制效果，提高对病毒的清除能力，进一步增强疫苗的广谱性。
101.本发明也提供了根据如前所述的所述的重组腺病毒疫苗(组合物)用途，用于在受试者中预防或治疗sars-cov-2感染或与sars-cov-2感染相关的疾病。所述疾病例如为新型冠状病毒肺炎。所述受试者为能被sars-cov-2感染的哺乳动物，例如人。
102.本发明也提供了一种在受试者中预防或治疗sars-cov-2感染或sars-cov-2感染相关的疾病的方法，其包括，给有此需要的受试者施用有效量的根据如前所述的重组腺病毒疫苗或组合物。
103.本发明的腺病毒疫苗具有良好的免疫原性，能够激活机体产生针对sars-cov-2的很强的应答，诱导高水平的抗体表达。本发明的腺病毒疫苗对多种新冠病毒突变株的复制都能起到理想的控制效果、具有广谱性；且可提高机体对病毒的清除能力。
104.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照
制造厂商所建议的条件。
105.材料
106.质粒、菌株、细胞及动物
107.腺病毒质粒padc68xy3-egfp由本发明人构建；其在adc68基因组序列(genbank登录号：ac_000011.1)基础上，部分e1和e3序列删除、e1删除大小为2552bp、e3删除大小为3721bp；同时还改造e4区域，将orf6/7和orf6替换成adhu5来源的相应orf(参见中国专利申请201910777937.2)。
108.将目的基因按人密码子进行优化，然后克隆到puc57的多克隆位点中，获得重组质粒。携带目的基因的质粒puc57-spike、puc57-mnl、puc57-cov2flut、puc57-ha由天津擎科生物技术有限公司合成。其中mnl编码的氨基酸序列如seq id no:1；cov2flut编码的氨基酸序列如seq id no:2。其中，原始病毒株spike氨基酸序列见genbank登录号：yp_009724390.1。流感ha编码的氨基酸序列见genbank登录号：acp41953.1。
109.新冠病毒核衣壳蛋白n(n蛋白)氨基酸序列见genbank登录号：yp_009724397.2。
110.新型冠状病毒原始株为sars-cov-2，本发明中也标为origin stain，5种突变株分别为：b.1.1.7(alpha)、b.1.351(beta)、p.1(gamma)、b.1.617(delta)，c.37(lambda)。
111.hek 293细胞株购自中国科学院上海细胞库。
112.大肠杆菌菌株dh5α、stbl 2购自上海唯地生物技术有限公司。
113.实验小鼠6-8周龄c57小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。
114.主要试剂
115.所有限制性内切酶购自new england biolabs。
116.引物合成于北京擎科新业生物技术有限公司。
117.质粒小量提取纯化试剂盒、dna纯化试剂盒、dna凝胶回收和纯化试剂盒均购自天根生化科技有限公司。
118.dmem培养基、胎牛血清、0.25％胰酶、二抗购自hyclone。
119.荧光素酶检测试剂盒购自promega。
120.流式抗体均购自biolegend。
121.fixation/permeabilization solution kit with bd golgiplug购自bd bioscience。
122.rbd及s1肽库和rbd肽库由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。
123.elispot检测试剂盒购买自mabtech公司。
124.序列设计
125.mnl(seq id no:1)(对n蛋白进行了修饰，n端加入lamp-1蛋白的信号肽，c端加入lamp-1蛋白的跨膜区)：
126.maapgsarrpllllllllllglmhcasasdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgi iwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytaaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqalipi
avggalaglvlivliaylvgrkrshagyqti
127.cov2flut(seq id no:2)(为针对新型冠状病毒和流感病毒基因组筛选获得的多个t细胞表位的串联后产物，其中2-48位为来源于新冠病毒orf1的t细胞表位，49-153位为来源于新冠病毒orf3的t细胞表位，154-208位为来源于新冠病毒m蛋白的t细胞表位；209-354位为来源于流感病毒的t细胞表位串)：mttdpsflgryctddnalayyylitpvhvmfyyvwksyvnsfsgylklrgvyypdkvfrssvkgiyqtsnfrvqptesivrftsnqvavlyqdvnctevcrsknpllydanyflcwhtncydycipynsvtssivyflqsinfalskgvhfvrlfartrsmwsfnpetnillnvplhgtiltrplleselvigavilrghlriaghhlgilgfvftlilspltkgiilgfvftltrmvlasttalgfvftltvvttevafglilhlilwillltevetpiiigilhlilatyqrtralrrsgaagaavkelrsrywailpferatvmslenfrayvceltdsswiceltdsswi
128.vs(seq id no:3)(为spike蛋白的突变体)：
129.mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqgvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnshsragsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldppeaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt
130.vtrbm(seq id no:4)(相应于trbm，第2位氨基酸发生l
→
r突变)：
131.yryrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptn
132.vvtrbm(seq id no:5)(相应于trbm，第2位氨基酸发生l
→
r突变，第34位发生e
→
k突变)：
133.yryrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvkgfncyfplqsygfqptn
134.trbm(seq id no:6)(截短的受体结合基序(receptor binding motif，rbm)，t表示“截短”)：
135.ylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptn
136.rbmc.37(seq id no:7)(相应于trbm，第2位氨基酸发生l
→
q突变，第40位发生f
→
s突变)
137.yqyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncysplqsygfqptn
138.实施例1、构建重组腺病毒质粒
139.将腺病毒质粒padc68xy3-egfp经srfi酶切，同时，设计引物以puc57-spike为模板，pcr得到携带腺病毒载体同源臂的目的基因表达框，利用同源重组的方法，将原始株spike表达框克隆到padc68xy3中的e1删除区域，得到基于原始株spike的一代重组腺病毒质粒padc68xy3-s。
140.将腺病毒质粒padhu5(ncbi登录号为：ac_000008.1，以此为骨架，删除e1和e3区，删除的e1区加入i-ceui和pi-seci酶切位点)用i-ceui和pi-seci双酶切。以padc68xy3-s为模板，设计引物pcr得到spike的表达框(cmv-spike-bgh ploya)，用同源重组的方法将其插入到经线性化的padhu5的e1删除区，得到padhu5-s。
141.通过点突变的方法，将puc57-spike中spike的部分氨基酸进行突变，包括：k417n，e484k，n501y，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p(见seq id no:3)，得到包含有突变后目的基因的载体puc57-vs。将腺病毒载体padc68xy3-egfp用srfi酶切，回收载体骨架。设计引物，以puc57-vs为模板，利用同源重组克隆法，将vs克隆到经线性化的padc68xy3载体中，得到目的质粒padc68xy3-vs。随后，在vs序列后面插入新冠病毒核衣壳蛋白n(n蛋白)，中间用p2a连接，得到padc68xy3-vsn。
142.同样利用同源重组克隆法，在padc68xy3-vs基础上，腺病毒的结构蛋白fiber的hi loop结构处插入截短的、含氨基酸突变(相应于trbm的第2位氨基酸发生l
→
r突变)的vtrbm，见seq id no:4，得到目的质粒padc68xy3-vs-vtrbm。
143.随后，在vs序列后面分别插入外源基因mnl(seq id no:1)，中间用p2a连接，得到padc68xy3-vsmnl-vtrbm。
144.得到的重组腺病毒质粒padc68xy3-vs-vtrbm、padc68xy3-vsmnl-vtrbm用apa i、mfei、xho i酶切鉴定分析，与酶切图谱片段大小分析相同，证明重组腺病毒载体构建成功。
145.实施例2、重组腺病毒的拯救及扩增、纯化
146.重组腺病毒质粒padc68xy3-s、padc68xy3-vsn、padc68xy3-vs-vtrbm、padc68xy3-vsmnl-vtrbm、padc68xy3-vst-vtrbm经pac i线性化后，用lipofectatimetm 2000转入hek 293细胞中，待培养8-13天后，出现噬斑，待细胞变圆、悬浮后收集细胞，反复冻融三次后取病毒上清感染hek 293细胞(75cm2细胞培养瓶)。重复以上步骤至收集适量病毒(30个150cm2细胞培养皿)，利用氯化铯密度梯度离心法纯化，获得候选疫苗adc68xy3-s、adc68xy3-vsn、adc68xy3-vs-vtrbm、adc68xy3-vsmnl-vtrbm、adc68xy3-vst-vtrbm。
147.提取各候选疫苗基因组，并用apa i、mfei、xho i限制性内切酶进行酶切、电泳，与图谱比较显示酶切片段正确，表明重组腺病毒候选疫苗包装正确，在扩增过程中无片段丢失或插入。
148.实施例3、候选疫苗的免疫学检测
149.1、体液免疫反应检测
150.选取8周龄c57 bl/6雌鼠，分为六组，阴性对照组小鼠肌肉和鼻腔免疫2
×
10
10
vp adc68xy3-empty，一代疫苗对照组小鼠免疫2
×
10
10
vp adc68xy3-s，实验组小鼠免疫新冠候选疫苗2
×
10
10
vp adc68xy3-vsn，adc68xy3-vsmnl-vtrbm。免疫后2周、4周和8周，通过脸颊取血，分离血清，采用elisa检测抗原特异性结合抗体，采用假病毒检测中和抗体。
151.结合抗体检测步骤：(1)包板：用包板buffer稀释重组s蛋白或n蛋白，100ng/
100ul/孔，4℃过夜包被；(2)封闭：pbst(0.05％)洗三次后，用8％的脱脂牛奶对酶标板进行封闭，200ul/孔，37℃孵育2h；(3)孵一抗：pbst(0.05％)洗三次后，加入100ul用1％bsa稀释好血清，37℃孵育2h(稀释方法：1：400起始，3倍比连续稀释，每个样本共计设置8个稀释梯度)；(4)孵二抗：pbst(0.05％)洗三次后，加入100ul 1:100000倍稀释的hrp偶联山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h；(5)显色：pbst(0.05％)洗三次后，加入100ul tmb显色液，室温避光反应10分钟后加入50ul1m h2so4终止液终止显色反应，酶标仪读取od450和od630双波长吸光度值，计算endpoint值。
152.c57bl/6小鼠免疫后2周针对spike和nucleoprotein的结合抗体滴度结果见图1。如图1a所示，候选疫苗免疫c57bl/6品系小鼠后2周即诱导机体产生针对spike的、高滴度的结合抗体。然而，只有adc68xy3-vsmnl-vtrbm候选疫苗经鼻腔后，才能诱导小鼠产生针对nucleoprotein的结合抗体，肌肉免疫无抗体产生。同时，当n蛋白为原始序列，未经修饰时(adc68xy3-vsn)，不管是肌肉免疫还是鼻腔免疫，都无法诱导出特异性抗体(图1b)。
153.2、中和抗体检测
154.中和抗体检测步骤如下：
155.(1)细胞铺板：hek293t-hace2细胞用胰酶消化、dmem完全培养基重悬后，铺96孔细胞培养板，50000个细胞/孔，37℃，5％co2培养16-24h；
156.(2)稀释血清并与假病毒进行孵育：用dmem完全培养基稀释小鼠血清(稀释方法：1：20起始，3倍比连续稀释，每个样本共计设置9个稀释梯度)，50ul稀释后的小鼠血清同50ul假病毒于37℃，5％co2细胞培养箱中孵育1h，并设置阳性孔(不加小鼠血清，只加等量假病毒)和空白孔(不加小鼠血清和假病毒)；
157.(3)感染细胞：弃掉hek293t-hace2细胞中的培养基，加入100ul孵育后的血清-假病毒混合物，感染48小时后检测报告基因表达；
158.(4)报告基因检测：将感染后的细胞和luciferase(萤火虫荧光素酶)化学发光底物放置至室温，每孔加入100ul化学发光底物，室温反应5分钟，将反应体系转移至96孔黑板中，用酶标仪检测rlu值。(6)nt50计算：中和活性＝((阳性孔rlu值-空白孔rlu值)-(血清孵育孔rlu值-空白孔rlu值))/(阳性孔rlu值-空白孔rlu值)*100％；拟合4参数回归曲线，计算中和活性＝50％对应的血清稀释度，即为nt50。
159.c57bl/6小鼠免疫adc68xy3-s、adc68xy3-vsn后2周、4周和8周中和抗体滴度结果见图2a-图2b，免疫adc68xy3-vsmnl-vtrbm后2周的中和抗体滴度结果见图2c。如图2a-图2b所示，一代疫苗adc68xy3-s和候选疫苗adc68xy3-vsn免疫后2周即产生较高滴度的中和抗体，随后的4周、8周中和抗体水平进一步升高，但针对beta突变株的中和抗体明显下降了。而adc68xy3-vsmnl-vtrbm候选疫苗免疫后两周，抗体水平显著高于前两个疫苗免疫后两周(图2c)。
160.更重要的是，不论肌肉免疫还是鼻腔免疫，adc68xy3-vsmnl-vtrbm候选疫苗诱导的中和抗体不仅对原始株有很高的抑制水平，对alpha、beta突变株也同样。
161.3、细胞免疫反应检测
162.上述相同的免疫策略免疫8周龄c57 bl/6雌鼠，14天时将小鼠安乐死，取脾脏分离淋巴细胞，用流式细胞术检测cd4+和cd8+t细胞反应，结果见图3和图4。
163.其中，图3a-b为adc68xy3-vsn和adc68xy3-vsmnl-vtrbm诱导的针对spike蛋白的t
细胞免疫反应。如图所示，候选疫苗免疫后都诱导机体产生了较高比例的针对spike的特异性效应t细胞。肌肉免疫引起的t细胞反应强于鼻腔免疫：肌肉免疫时，脾脏中s1抗原特异性ifn-γ
+
cd8
+
t细胞比例达1.2％左右。产生的cd8 t细胞反应强于cd4 t细胞反应，cd4 t细胞反应以th1型为主。
164.图4a-b为adc68xy3-vsn和adc68xy3-vsmnl-vtrbm诱导的针对n蛋白的t细胞免疫反应。如图所示，无论是鼻腔免疫还是肌肉免疫，在激发小鼠产生强烈的、针对n蛋白的t细胞反应(包括cd4+t细胞和cd8+t细胞)方面，还需要进一步提高。
165.实施例4、候选疫苗的进一步优化及其免疫学检测
166.1、候选疫苗优化
167.由于n蛋白没有诱导出特异性t细胞免疫反应，本发明人在adc68xy3-vsmnl-vtrbm的基础上，对新冠疫苗进行了进一步优化。经过反复研究，确定优化策略如下：
168.(1)基于adc68xy3-vsmnl-vtrbm，去掉mnl蛋白的编码基因，得到候选疫苗adc68xy3-vs-vtrbm。
169.(2)针对新型冠状病毒基因组筛选获得多个t细胞表位(针对新冠病毒基因筛选获得，尤其位于其orf1、orf3、m基因)，将其串联在一起，通过基因合成得到序列，命名为cov2t(seq id no:2，第2-208位)。基于adc68xy3-vsmnl-vtrbm，将mnl替换成cov2t，得到候选疫苗adc68xy3-vst-vtrbm。
170.(3)改变spike的突变位点得到不同的突变型s，包括：vsc(包含：n501y，a570l，t572i，d614g，p681h，r682s，r685g，f855y，n856i，k986p，v987p)，vsδ(包含：l452r，t487k，n501y，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p)和vso(包含：k417n，n440k，g446s，s477n，t478k，e484a，q493r，g496s，q498r，n501y，y505h，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p)。在padc68xy3-vs中，用这些突变型s替代vs。得到adc68xy3-vsct、adc68xy3-vsδt、adc68xy3-vsot。然后，在腺病毒结构蛋白fiber的hi loop结构处可插入截短的trbm(不含突变，见seq id no:6)，也可插入插入截短的、含氨基酸突变的vvtrbm(相应于trbm的第2位氨基酸发生l
→
r突变，第34位发生e
→
k突变，seq id no:5)。从而得到优化后的候选疫苗adc68xy3-vsct-trbm、adc68xy3-vsδt-vvtrbm、adc68xy3-vsot-vtrbm等。
171.(4)不使用全长spike，而用其中的rbd基因(spike的319-541位氨基酸)作为抗原，将vs用两个异源的rbd二聚体替代(二聚体)，具体做法如下：以puc57-spike为模板，设计引物pcr得到sars-cov-2的信号肽序列sp(spike的1-12位)和rbd序列(spike的319-541位)，同源重组的方法将其克隆到pshuttle-cmv载体的多克隆位点中，得到pshuttle-sprbd。将pshuttle-sprbd中rbd区域的相应于spike蛋白的417、484、501位氨基酸进行突变，得到pshuttle-sprbdβ(k417n，e484k，n501y)。相同的方法，将rbd序列(spike的319-541位)克隆到puc57载体的多克隆位点区，得到puc57-rbd，在此基础上对rbd进行部分氨基酸突变(相应于spike蛋白的452、417、484、501位)，得到puc57-rbdδ(l452r)和puc57-rbdγ(k417t，e484k，n501y)。设计引物，以puc57-rbdδ为模板，将rbdδ克隆到pshuttle-sprbd后，得到pshuttle-2sprbdδ；相同的方法，以puc57-rbdγ为模板，将rbdγ克隆到pshuttle-sprbdβ后，得到pshuttle-2sprbdβγ。酶切连接的方法，将pshuttle-2sprbdβγ中的2sprbdβγ克隆到pshuttle-2sprbdδ后，中间用p2a连接，得到pshuttle-4sprbd。将腺病毒载体padc68xy3-egfp用srfi酶切，回收载体骨架。设计引物，以pshuttle-4sprbd为模板，将
4sprbd克隆到经srfi线性化的padc68xy3-egfp中(将4sprbd插入到
△
e1区)，得到padc68xy3-4rbd。
172.t细胞表位串保持不变，在4rbd序列后面插入外源基因cov2t，中间用e2a连接，得到padc68xy3-4rbdt。随后，在腺病毒fiber上插入截短的trbmc.37(相应于trbm，第2位氨基酸发生l
→
q突变，第40位发生f
→
s突变)，见seq id no:7，得到padc68xy3-4rbdt-c.37。
173.这样，候选疫苗一共有4个含不同氨基酸突变的rbd基因，分别为原始株rbd、beta突变株关键位点突变的rbd、gamma突变株关键位点突变的rbd、delta突变株关键位点突变的rbd，还含有lambda突变株关键位点突变的截短rbm。
174.(5)半胱氨酸可能会影响rbd蛋白的稳定性，所以，在adc68xy3-4rbdt-c.37的基础上，对4个rbd进行截短，得到trbd(spike的319-537位氨基酸，在c548前进行截短)，其他保持不变，构建方法也相同，得到候选疫苗adc68xy3-4trbdt-c.37。
175.(6)在adc68xy3-4trbdt-c.37和adc68xy3-4rbdt-c.37基础上，在新冠t细胞表位串cov2t后面加入流感t细胞表位串(氨基酸序列见seq id no：2，第209-354位)，再将流感病毒的ha基因(氨基酸序列见genbank登录号：acp41953.1)克隆到t细胞表位串后面，中间用t2a连接，得到流感与新冠联合候选疫苗adc68xy3-4trbdtha-c.37和adc68xy3-4rbdtha-c.37。
176.2、体液免疫反应检测
177.针对以上优化(1)：选取8周龄c57 bl/6雌鼠，分为四组：对照组小鼠肌肉和鼻腔免疫2
×
10
10
vp adc68xy3-empty，实验组小鼠肌肉和鼻腔免疫新冠候选疫苗2
×
10
10
vp adc68xy3-vs-vtrbm。免疫后2周和4周，通过脸颊取血，分离血清，采用上述相同的方法检测spike抗原特异性结合抗体和新冠病毒及其突变株中和抗体。
178.针对以上优化(4)和(5)：选取8周龄balb/c雌鼠，分为六组：对照组小鼠肌肉和鼻腔免疫2
×
10
10
vp adc68xy3-empty，实验组小鼠肌肉和鼻腔免疫新冠候选疫苗2
×
10
10
vp adc68xy3-4rbdt-c.37、adc68xy3-4trbdt-c.37。免疫后2周、4周和8周，通过脸颊取血，分离血清，采用上述相同的方法检测rbd抗原特异性结合抗体和新冠病毒及其突变株中和抗体。
179.针对以上优化(6)：选取8周龄c57 bl/6c雌鼠，分为三组：对照组小鼠肌肉2
×
10
10
vp adc68xy3-empty，实验组小鼠肌肉免疫新冠候选疫苗2
×
10
10
vp adc68xy3-4rbdtha-c.37、adc68xy3-4trbdtha-c.37。免疫后2周、6周和8周，通过脸颊取血，分离血清，采用上述相同的方法检测rbd抗原特异性结合抗体和针对流感pandemic h1n1(ph1n1)中和抗体。
180.针对以上优化(1)：图5为优化后候选疫苗诱导的结合抗体水平。如图5a所示，adc68xy3-vs-vtrbm肌肉免疫小鼠后2周，即诱导机体产生较高滴度的针对spike的结合抗体，随后抗体水平有显著性升高。鼻腔免疫时，2周时，抗体迅速达到较高水平(高于同期肌肉免疫)，4周时略有升高。
181.针对以上优化(4)和(5)：如图5b、5c所示，adc68xy3-4rbdt-c.37、adc68xy3-4trbdt-c.37、adc68xy3-4rbdtha-c.37、adc68xy3-4trbdtha-c.37肌肉免疫小鼠后2周，迅速产生了针对rbd的结合抗体，此后第8周/6周，结合抗体水平显著性升高。
182.针对以上优化(1)：adc68xy3-vs-vtrbm诱导的中和抗体的检测结果见图6，候选疫苗免疫后第14天即产生高滴度的中和抗体，且针对原始株和5种突变株均有高的中和活性，
且第28天中和抗体滴度进一步显著升高，具有较好的中和抗体广谱性。肌肉免疫及鼻腔免疫均适合。
183.针对以上优化(4)和(5)：adc68xy3-4rbdt-c.37、adc68xy3-4trbdt-c.37免疫后2周、6周和8周的中和抗体检测结果见图7a，候选疫苗免疫后2周已产生针对原始株和5种突变株的中和抗体。免疫后8周，抗体水平显著性升高。此外，adc68xy3-4rbdt-c.37诱导的中和抗体高于adc68xy3-4trbdt-c.37。
184.针对以上优化(6)：adc68xy3-4rbdtha-c.37、adc68xy3-4trbdtha-c.37免疫后2周、6周和8周，诱导机体产生了针对新冠原始株和4个突变株广谱的中和抗体，结果见7a。同时，免疫后6周检测到较强的针对ph1n1活病毒的中和抗体，结果见图7b。
185.针对以上优化(3)：此外，也检测了adc68xy3-vsct-trbm、adc68xy3-vsδt-vvtrbm、adc68xy3-vsot-vtrbm候选疫苗诱导的中和抗体水平，均显著地诱导产生新冠病毒的中和抗体，中和抗体水平针对不同的突变株有一定差异，比如：adc68xy3-vsct-trbm诱导的针对原始株、alpha、gamma、delta、lambda突变株抗体水平高；adc68xy3-vsδt-vvtrbm诱导的针对原始株、alpha、delta、lambda突变株抗体水平较高；adc68xy3-vsot-vtrbm诱导的针对omicron和delta突变株抗体水平较高。
186.3、细胞免疫反应检测
187.选取8周龄c57 bl/6雌鼠，分为四组：对照组小鼠肌肉和鼻腔免疫2
×
10
10
vp adc68xy3-empty，实验组小鼠肌肉和鼻腔免疫新冠候选疫苗2
×
10
10
vp adc68xy3-vst-vtrbm。10天时，将小鼠安乐死，取脾脏分离淋巴细胞，用流式细胞术检测cd4和cd8 t细胞反应，结果见图8。其中，图8a为针对spike蛋白的t细胞免疫反应，图8b为针对插入的新冠t细胞表位的t细胞免疫反应。
188.针对以上优化(4)和(5)：选取8周龄c57 bl/6雌鼠，分为四组：对照组小鼠肌肉和鼻腔免疫2
×
10
10
vp adc68xy3-empty，实验组小鼠肌肉和鼻腔免疫新冠候选疫苗2
×
10
10
vp adc68xy3-4rbdt-c.37或adc68xy3-4trbdt-c.37。13天时，将小鼠安乐死，取脾脏分离淋巴细胞，用流式细胞术检测cd4和cd8 t细胞反应。图9为候选疫苗adc68xy3-4rbdt-c.37和adc68xy3-4trbdt-c.37诱导的针对rbd蛋白和新冠t细胞表位串的t细胞免疫反应。候选疫苗可诱导出强烈的、针对rbd的cd4+和cd8+t细胞反应(图9a)，同时可诱导针对orf1、orf3和m的cd8+t细胞反应(图9b)。
189.针对以上优化(2)：如图8a所示，候选疫苗adc68xy3-vst-vtrbm免疫后诱导机体产生较高比例的spike抗原特异性的效应t细胞，肌肉免疫时，脾脏中s1抗原特异性ifn-γ+cd8+t细胞比例达3.5％，ifn-γ
+
cd4
+
t细胞、il-2
+
cd4
+
t细胞和tnf-α
+
cd4
+
t细胞比例也分别达到了0.18％、0.18％和0.12％。如图8b所示，优化后的候选疫苗诱导机体产生了针对新冠orf1、orf3、m的效应t细胞，以cd8+t细胞为主。其中，针对orf1、orf3、m的ifn-γ+cd8+t细胞比例分别为0.95％、0.09％和0.01％。
190.针对以上优化(6)：也检测了候选疫苗adc68xy3-4rbdtha-c.37和adc68xy3-4trbdtha-c.37免疫后诱导的细胞免疫反应，也产生了针对新冠rbd、orf1、orf3和m的较强的t细胞反应。
191.结论
192.本发明揭示了一种针对新冠病毒的广谱疫苗和一种新冠病毒与流感病毒的联合
疫苗。实验发现，此新冠疫苗可诱导小鼠产生针对alpha、beta、gamma、delta、lambda突变株和原始株均较高的中和抗体，具有广谱中和性。而且，本发明的疫苗同时可产生强的细胞免疫反应，不光包括针对易突变的spike，还针对较保守的orf1、orf3、m，增加了候选疫苗的广谱性。本发明也提供了联合疫苗，其一方面可以诱导出针对各种新冠病毒的中和抗体，能产生针对易突变rbd和较保守的orf1、orf3、m的t细胞免疫；另一方面可诱导产生针对流感ph1n1的中和抗体，扩大了疫苗的适用性。
193.因此，本发明的系列新冠疫苗具有理想的广谱性，对于防控新冠疫情有积极意义。
194.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

技术特征：
1.一种制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)在腺病毒载体中引入下组元件，获得重组腺病毒载体：
①
突变型spike蛋白的编码基因，或突变型spike蛋白-t细胞表位串的编码基因；其中所述t细胞表位串来自于该病毒的orf1、orf3和m蛋白；
②
受体结合基序或突变型受体结合基序的编码基因；(2)基于(1)的重组腺病毒载体进行病毒的包装，获得重组腺病毒疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变型spike蛋白包括：两个异源的rbd二聚体或两个异源的rbd截短体二聚体；较佳地，两个异源的rbd二聚体包括：一个异源二聚体rbdδ和另一个异源二聚体rbdβγ，该rbdδ中的一个rbd单体相应于spike蛋白序列的第452位发生l452r突变，第478位发生t478k突变，另一个rbd单体未进行氨基酸改变，两个不同的rbd单体串联形成异源二聚体；该rbdβγ在相应于spike蛋白序列的第417、484、501位发生突变，其中一个rbd单体为k417t、e484k、n501y，另一个rbd单体为k417n、e484k、n501y，两个不同的rbd单体串联形成异源二聚体；较佳地不同的rbd单体可任意两两串联形成异源二聚体；较佳地组成异源二聚体的rbd单体突变位点包括但不限于以上四种，可根据不同新冠突变株进行调整，比如：包含omicron突变株rbd的突变位点：g339d、s371l、s373p、s375f、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h的rbd单体，包含alpha突变株rbd突变位点n501y的rbd单体等；较佳地rbd截短体仅存在相应于spike蛋白序列第319-537位氨基酸序列；较佳地以信号肽引导该突变型spike或异源二聚体rbd蛋白的表达；和/或所述突变型spike蛋白包括：来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2原始株或变异株的spike蛋白；较佳地，所述来自变异株的spike蛋白，包括以下的突变：k417n、n440k、g446s、l452r、s477n、t478k、e484k、e484a、t487k、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、a570l、t572i、d614g、p681h、r682s、r685g、f855y、n856i、k986p、v987p，或其组合；较佳地，所述spike蛋白为seq id no:3所示氨基酸序列的蛋白，或为发生n501y、a570l、t572i、d614g、p681h、r682s、r685g、f855y、n856i、k986p和v987p突变的spike蛋白，或为发生l452r，t487k，n501y，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p突变的spike蛋白，或为发生k417n，n440k，g446s，s477n，t478k，e484a，q493r，g496s，q498r，n501y，y505h，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p突变的spike蛋白；和/或所述t细胞表位串串联有seq id no:2中第2-48位的来源于orf1的表位、第49-153位的来源于orf3的表位和第154-208位的来源于m蛋白的表位；和/或所述受体结合基序包括：来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2原始株或变异株的受体结合基序；所述突变型受体结合基序包括截短型受体结合基序，较佳地包括选自：seq id no:4～7任一所示氨基酸序列的蛋白；和/或所述腺病毒载体中还引入以下元件的编码基因：来源于流感病毒m1、m2和np蛋白的t细胞表位；较佳地，其位于严重急性呼吸综合征冠状病毒2的t细胞表位串的附近；较佳地，其氨基酸序列如seq id no:2中第209-354位；和/或所述腺病毒载体中还引入以下元件的编码基因：来源于h1n1流感病毒的ha蛋白；较佳地，其位于t细胞表位串附近；较佳地，其氨基酸序列如genbank登录号：acp41953.1。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺病毒载体包括：腺病毒载体adc68xy，adc6，adc7,adhu5,adc63,adhu26；较佳地，所述adc68xy包括以黑猩猩型腺病毒adc68基因
组为基础的序列，其中e1序列和e3序列被删除，e4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒adhu5基因组中相应的e4序列或其片段替换adc68基因组中e4序列或其片段。4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述突变型spike蛋白的编码基因或突变型spike蛋白-t细胞表位串的编码基因或突变型spike蛋白-t细胞表位串-流感ha蛋白的编码基因引入到腺病毒的e1删除区域、e3删除区域和/或e4区域等；所述受体结合基序插入到腺病毒载体中结构蛋白fiber编码基因上或结构蛋白hexon/penton，较佳地，插入位置为fiber的hiloop。5.一种重组腺病毒载体，其中引入下组元件：
①
突变型spike蛋白的编码基因，或突变型spike蛋白-t细胞表位串的编码基因或突变型spike蛋白-t细胞表位串-流感ha蛋白的编码基因；其中所述t细胞表位串来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2的orf1、orf3和m蛋白或新冠病毒的orf1、orf3和m蛋白及流感病毒的m1、m2和np蛋白；
②
严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合基序或突变型严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合基序的编码基因。6.如权利要求5所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述突变型spike蛋白包括：两个异源的rbd二聚体或两个异源的rbd截短体二聚体；较佳地，两个异源的rbd二聚体包括：一个rbdδ和一个rbdβγ，该rbdδ中的一个rbd单体相应于spike蛋白序列的第452位发生l452r突变，第478位发生t478k突变，另一个rbd单体未进行氨基酸改变，两个不同的rbd单体串联形成异源二聚体；该rbdβγ在相应于spike蛋白序列的第417、484、501位发生突变，其中一个rbd单体为k417t、e484k、n501y，另一个rbd单体为k417n、e484k、n501y，两个不同的rbd单体串联形成异源二聚体；较佳地不同的rbd单体可任意两两串联形成异源二聚体；较佳地组成异源二聚体的rbd单体突变位点包括但不限于以上四种，可根据不同新冠突变株进行调整，比如：包含omicron突变株rbd的突变位点：g339d、s371l、s373p、s375f、s477n、t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h的rbd单体，包含alpha突变株rbd突变位点n501y的rbd单体等；较佳地rbd截短体仅存在相应于spike蛋白序列第319-537位氨基酸序列；较佳地以信号肽引导该突变型spike蛋白的表达；和/或所述突变型spike蛋白包括：来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2原始株或变异株的spike蛋白；较佳地，所述来自变异株的spike蛋白，包括以下的突变：k417n、n440k、g446s、l452r、s477n、t478k、e484k、e484a、t487k、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h、a570l、t572i、d614g、p681h、r682s、r685g、f855y、n856i、k986p、v987p，或其组合；较佳地，所述spike蛋白为seq id no:3所示氨基酸序列的蛋白，或为发生n501y、a570l、t572i、d614g、p681h、r682s、r685g、f855y、n856i、k986p和v987p突变的spike蛋白，或为发生l452r，t487k，n501y，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p突变的spike蛋白，或为发生k417n，n440k，g446s，s477n，t478k，e484a，q493r，g496s，q498r，n501y，y505h，d614g，p681h，r682s，r685g，k986p，v987p突变的spike蛋白；和/或所述t细胞表位串串联有seq id no:2中第2-48位的来源于严重急性呼吸综合征冠状病毒2的orf1的表位、第49-153位的来源于严重急性呼吸综合征冠状病毒orf3的表位和第154-208位的来源于严重急性呼吸综合征冠状病毒m蛋白的表位；和/或所述受体结合基序包括：来自于严重急性呼吸综合征冠状病毒2原始株或变异株的受
体结合基序；所述突变型受体结合基序包括截短型受体结合基序，较佳地包括选自：seq id no:4～7任一所示氨基酸序列的蛋白；和/或所述腺病毒载体中还引入以下元件的编码基因：来源于流感病毒m1、m2和np蛋白的t细胞表位；较佳地，其位于严重急性呼吸综合征冠状病毒2的t细胞表位串的附近；较佳地，其氨基酸序列如seq id no:2中第209-354位；和/或所述腺病毒载体中还可以引入以下元件的编码基因：来源于h1n1流感病毒的ha蛋白；较佳地，其位于t细胞表位串附近；较佳地，其氨基酸序列如genbank登录号：acp41953.1。7.一种重组腺病毒，其由权利要求5或6所述的重组腺病毒载体包装获得。8.权利要求7所述的重组腺病毒的应用，用于制备抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染或流感病毒感染的药物组合物或药盒；较佳地，所述严重急性呼吸综合征冠状病毒2感染或流感病毒感染导致的疾病包括：病毒性肺炎、严重急性呼吸道感染、肠道疾病、心脏衰竭、肾衰竭或严重急性呼吸道综合征；较佳地，所述药物组合物为疫苗。9.一种抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2和/或流感病毒感染的药物组合物或药盒，其特征在于，所述的药物组合物或药盒中含有：有效量的权利要求7所述的重组腺病毒，可选地还含有免疫佐剂；和药学上可接受的载体；较佳地，所述药物组合物为疫苗。10.一种用于制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2和/或流感病毒感染的疫苗的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求5或6所述的重组腺病毒载体；病毒生产细胞。

技术总结
本发明提供了一种基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用。所述重组腺病毒表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-COV-2)的Spike蛋白、T细胞表位串及受体结合基序(RBM)。本发明的重组腺病毒作为疫苗，能够激活机体产生针对SARS-COV-2的很强的免疫应答，产生的抗体对各种新冠病毒突变株都有较强的中和效果，具有广谱性；且可提高机体对病毒的清除能力。且可提高机体对病毒的清除能力。


技术研发人员：周东明 邢嫚
受保护的技术使用者：苏州相奕生物技术有限公司
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/9