一种可重复利用的测序方法与流程

1.本发明涉及一种可重复利用的测序方法，属于基因测序领域。


背景技术：

2.现阶段，利用高通量测序技术对核酸分子进行测序依赖于基因测序芯片这个载体，测序芯片一般使用微加工技术，表面处理技术，生产难度较高，且芯片是一次性使用，每次测序都需要更换新的测序芯片，这无疑大大增加了测序成本。有一种简单的思路可以实现芯片的重复使用从而有效降低测序成本，即通过彻底去除每次测序反应的待测核酸分子或连接核酸分子的载体，使芯片恢复为可使用状态，从而可以用于新的核酸分子的测序反应，本发明即提供了上述重复利用基因测序芯片的测序方法。


技术实现要素：

3.本发明公开一种可重复利用的测序方法，其特征在于，包括：
4.1)提供基因测序芯片，所述芯片内表面有预先加工好的微坑；所述微坑表面有化学修饰；
5.2)提供测序载体，将扩增引物种植到所述测序载体表面，用于将待测核酸分子连接到所述测序载体上；所述测序载体表面有化学修饰基团；
6.3)向所述微坑内加载所述测序载体；
7.4)向芯片内通入测序反应液，对所述测序载体上连接的核酸分子进行测序；
8.5)向芯片内通入裂解剂，使得测序载体上的核酸分子分解/裂解,以去除所述测序载体上的核酸分子；
9.6)重复步骤2)，4)。
10.根据优选的实施方式，当进行多次测序反应时，步骤6)变为重复步骤2)，4)，5)。
11.根据优选的实施方式，在步骤4)之前对待测核酸分子进行扩增，可以在步骤2)之后进行扩增，或在步骤3)之后进行扩增，所述扩增是pcr或恒温扩增中的一种。
12.根据优选的实施方式，所述微坑为芯片内表面阵列排布或非阵列排布的凹陷结构，所述微坑的尺寸为0.25-5微米，优选0.3-3.5微米，更优选0.5-3微米。
13.根据优选的实施方式，所述微坑表面有化学修饰，用于固定所述测序载体，所述化学修饰包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。
14.根据优选的实施方式，所述测序载体表面有化学修饰基团，用于种植所述扩增引物，所述扩增引物上具有相应的化学修饰基团，所述化学修饰基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。
15.根据优选的实施方式，所述种植引物的方法为，根据测序载体表面的化学修饰，将带有对应修饰的引物溶液注入芯片，进行连接反应。
16.根据优选的实施方式，所述测序载体包括，聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、聚乙烯微球、二氧化硅微球、乳胶微球、聚丙烯酰胺水凝胶层等。
17.根据优选的实施方式，完成步骤3)后至少80％的微坑满足条件：每个微坑最多加载一个测序载体。
18.根据优选的实施方式，所述裂解剂包括核酸水解酶dnase i、核酸外切酶ⅰ、核酸外切酶ⅶ、非限制性核酸内切酶benzonase和biolonase中的一种或多种。
19.根据优选的实施方式，将所述核酸分子分解/裂解后，通入清洗试剂将芯片冲洗干净。
20.根据优选的实施方式，所述测序载体上的化学修饰基团是过量的，也就是说完成一次测序反应后测序载体表面还有可用的化学修饰基团，优选过量1-10倍，更优选的，过量5-10倍。
21.另一方面，本发明公开一种可重复利用的测序方法，其特征在于，包括：
22.(1)提供基因测序芯片，所述芯片表面有预先加工好的微坑；所述微坑表面有化学修饰；
23.(2)提供测序载体，将扩增引物种植到所述测序载体表面，用于将待测核酸分子连接到所述测序载体上；所述测序载体表面有化学修饰基团；
24.(3)向所述微坑内加载所述测序载体，所述测序载体通过连接分子固定于所述微坑；
25.(4)向芯片内通入测序反应液，对所述测序载体上的核酸分子进行测序；
26.(5)向芯片内通入裂解剂，使得所述连接分子分解/裂解，以去除所述测序载体；
27.(6)重复步骤(2)-(4)。
28.根据优选的实施方式，当进行多次测序反应时，步骤(6)变为重复步骤(2)-(5)。
29.根据优选的实施方式，在步骤(4)之前对待测核酸分子进行扩增，可以在步骤(2)之后进行扩增，或在步骤(3)之后进行扩增；所述扩增是pcr或恒温扩增中的一种。
30.根据优选的实施方式，所述微坑为芯片内表面阵列排布或非阵列排布的凹陷结构，所述微坑的尺寸为0.25-5微米，优选0.3-3.5微米，更优选0.5-3微米。
31.根据优选的实施方式，所述微坑表面有化学修饰，用于固定所述测序载体，所述化学修饰包括生物素、链霉亲和素、羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。
32.根据优选的实施方式，所述测序载体表面有化学修饰基团，用于种植所述扩增引物，所述扩增引物上具有相应的化学修饰基团，所述化学修饰基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。
33.根据优选的实施方式，所述测序载体包括，聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、聚乙烯微球、二氧化硅微球、乳胶微球、聚丙烯酰胺水凝胶层等。
34.根据优选的实施方式，完成步骤(3)后至少80％的微坑满足条件：每个微坑最多加载一个测序载体。
35.根据优选的实施方式，所述连接分子为包括生物素或链霉亲和素在内的蛋白质。
36.根据优选的实施方式，所述裂解剂包括非特异性蛋白酶，所述非特异性蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶和链霉蛋白酶、蛋白酶k等。
37.根据优选的实施方式，将所述连接分子分解/裂解后，通入清洗试剂将芯片冲洗干净。
38.有益效果
39.本发明的基因测序方法，通过将连有待测基因的测序载体加载到基因测序芯片表面的微坑内，在完成测序反应后，通过去除测序载体表面连接的dna链或去除测序载体，即可实现芯片的重复使用，可重新在测序载体表面连接扩增引物(特定序列的单链dna)，重新开始扩增及测序过程；通过上述过程实现有限次数的重复使用测序芯片进行测序。本方法简化了实验操作，降低了测序成本。
附图说明
40.根据本发明提供的实施例，参照以下附图详细地描述本公开。附图中的尺寸和比例仅用于示意本发明的方法，并不一定全部按照比例尺绘制。
41.图1.可重复利用的基因测序方法示意图。其中，101为测序载体，102为测序载体表面修饰的化学基团，103为待测dna片段，104为可以降解dna的裂解剂，105为微坑。图1最右侧为去除了已测序dna片段后的测序载体(有黑色弯曲的部分表示此修饰基团已不可用)。
42.图2.裂解剂处理前的芯片表面荧光图。
43.图3.裂解剂处理后的芯片表面荧光图。
44.图4.再次连接扩增引物后的芯片表面荧光图。
具体实施方式
45.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
46.需要注意的是，除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
47.本发明的第一方面提供了一种可重复利用的测序方法，其特征在于，包括：
48.1)提供基因测序芯片，所述芯片内表面有预先加工好的微坑；所述微坑表面有化学修饰；
49.2)提供测序载体，将扩增引物种植到所述测序载体表面，用于将待测核酸分子连接到所述测序载体上；所述测序载体表面有化学修饰基团；
50.3)向所述微坑内加载所述测序载体；
51.4)向芯片内通入测序反应液，对所述测序载体上连接的核酸分子进行测序；
52.5)向芯片内通入裂解剂，使得测序载体上的核酸分子分解/裂解,以去除所述测序载体上的核酸分子；
53.6)重复步骤2)，4)。
54.根据优选的实施方式，当进行多次测序反应时，步骤6)变为重复步骤2)，4)，5)。也就是说，在使用同一测序芯片进行多次测序反应时，只需要在第一次测序反应时进行一次测序载体的加载反应，在第二次以及之后的测序反应中，都不需要再加载测序载体，而只需要将新的待测核酸固载到前述测序载体上。
55.根据优选的实施方式，在步骤4)之前对待测核酸分子进行扩增，可以在步骤2)之后进行扩增，或步骤3)之后进行扩增。当扩增在步骤2)之后进行，即所述扩增反应是在芯片外进行，再将连有扩增产物的测序载体加载到测序芯片中；在步骤3)之后进行扩增，则是芯片原位扩增，将测序载体加载到微坑后，通入扩增反应物进行扩增。所述扩增可以是恒温扩
增或普通pcr，包括，例如rpa、raa、lamp、sda、ia500、examp等等。所述扩增反应物包括：dntps、dna聚合酶、离子缓冲液等。
56.如图1所示，本发明中，待测基因片段103并不是直接固定在芯片表面的微坑105(微井、微阱、微反应室)，而是连接在测序载体101上，再将测序载体101固定于基因芯片内表面的微坑105中，所述固定是通过测序载体101表面修饰的化学基团102实现的。在完成测序后，通过使用裂解剂104直接降解待测基因片段103，再将基因片段103从芯片表面去除，从而实现测序载体101及芯片的重复使用。
57.根据优选的实施方式，所述微坑为芯片内表面阵列排布或非阵列排布的凹陷结构，为圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合；所述微坑的尺寸为0.25-5微米，优选0.3-3.5微米，更优选0.5-3微米；周期为0.6-8微米，优选1-5微米。微坑之间的间隔区为疏水性区域，便于进行油封。
58.根据优选的实施方式，所述测序载体包括，聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、聚乙烯微球、二氧化硅微球、乳胶微球、磁性微球、聚丙烯酰胺水凝胶层等。测序载体是待测核酸分子的载体，所述测序载体可以直接连接待测分子，也可以通过种植扩增引物，进而通过杂交将待测核酸分子固定到载体上，所述测序载体表面修饰有化学基团，用于种植所述扩增引物或连接待测核酸分子，所述扩增引物上也具有相应的化学修饰基团，所述化学修饰基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。
59.根据优选的实施方式，将待测核酸分子连接到测序载体可采用多种方法。第一种方法，可以将适量的待测dna单链直接连接到测序载体(如微球)上，待测dna单链和微球上具有合适的化学修饰，例如，可将炔基修饰的dna与叠氮基团修饰的微球进行click连接；可将叠氮基团修饰的dna与炔基修饰的微球进行click连接；可将氨基修饰的dna与羧基修饰的微球通过nhs/edc连接；可将羧基修饰的dna与氨基修饰的微球通过nhs/edc连接。以及其他常用的化学连接方法。
60.第二种方法，首先通过第一种方法将扩增引物连接到微球表面，此即扩增引物的种植过程，然后加入待测dna单链或者dna文库(需事先连接上合适的接头)，通过待测dna单链与扩增引物的互补配对，将待测核酸序列固定到微球载体上。通过控制条件使每个微球上仅结合一条dna模板链(或者部分微球上仅有一条dna模板链)。
61.根据优选的实施方式，所述聚丙烯酰胺水凝胶层可直接在芯片表面引发聚合产生，或者采用化学连接的方法把线性水凝胶连接到芯片表面。
62.根据优选的实施方式，所述测序载体上的化学修饰位点是过量的，也就是说完成一次测序反应后测序载体表面还有可用的化学修饰基团，优选过量1-10倍，更优选的，过量5-10倍。例如，可以提供2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次测序反应所需的量。所述化学修饰位点在一次测序反应结束后，即变为不可用状态，例如，若微球表面共有10000个化学修饰位点，一次测序反应使用1000个，则后续测序反应可用的修饰位点最多为9000个，每一次测序反应都会使可用修饰位点减少。
63.根据优选的实施方式，加载完成后，至少80％的微坑满足条件：每个微坑最多加载一个测序载体，优选的，至少90％的微坑内最多加载一个测序载体。将测序载体加载到芯片微坑内可以采用离心法：将合适浓度的微球悬浮液注入芯片腔体内，以胶带封住芯片出入口，高速离心使微球进入微坑，芯片微坑面应在外侧。然后通过起泡液冲刷，将微坑外的微
球去除，保留结合在微坑内部的微球。微球溶液加入的量应根据微坑数目调整，使得微球的数目大于微坑数目，以获得较高的进坑比率；同时微球不宜过多，造成浪费。例如一亿个微坑搭配一亿五千万至五亿个微球。也可采用多次离心的方式获得更高的进坑比率。
64.根据优选的实施方式，本发明涉及的测序方法是多碱基的测序方法，作为公开的内容，申请人之前申请的专利，例如cn201510212788.7，例如cn201510212789.1，例如cn201510822361.9，例如cn201680079417.9等描述了多碱基测序的方法。这些专利的内容可以通过引用的形式加入本专利。在此简要描述荧光发生测序过程：将各种所需的水相测序相关试剂注入芯片，然后注入油封试剂，使微球和水相的测序反应液被油封在微坑内。油封试剂可选各种电子氟化液，例如3m的novec
tm
电子氟化液71da，novec
tm
电子氟化液71ipa，novec
tm
7100电子氟化液，novec
tm
7300电子氟化液，novec
tm
7200电子氟化液，novec
tm
7000电子氟化液，novec
tm
7500电子氟化液，fc-3284，fc-72，fc-3283，fc-40等等。升温进行测序反应，测序引物被延伸，同时释放出荧光信号分子，由于油封的作用，自由荧光基团分子被限制在微坑内，控制光源(特定激发光)及信号采集系统可获得测序信号，再根据采集系统获得的测序信号，通过专用的分析软件将光强信号转化成序列信息。
65.根据优选的实施方式，在测序完成后通入甲酰胺清洗，将新生链解旋洗掉，在芯片上只留下了单链dna。去除这些单链dna后此芯片和测序载体即可用于新的测序反应。
66.根据优选的实施方式，去除芯片微坑内dna的方法是向芯片内通入裂解剂，优选的，通入酶溶液，包括，例如：核酸水解酶dnaseⅰ、特定的核酸外切酶和非限制性核酸内切酶。其中，脱氧核糖核酸酶i(dnase i)，是一种核酸内切酶，靶向切割邻近嘧啶的磷酸二酯键，产生多聚核苷酸，平均消化产物最小为多聚四核苷酸。dnaseⅰ可催化多种形式dna，如单链dna、双链dna，最佳反应ph为7-8，其活性依赖于ca
2+
。
67.根据优选的实施方式，特定的核酸外切酶包括，例如核酸外切酶ⅰ，核酸外切酶ⅶ等，这两种酶均能从单链dna的3’端开始切割，能够将微球上的单链dna切割为单核苷酸，再通入清洗液将芯片表面冲洗干净。由于测序载体与芯片微坑之间通过化学连接固定，清洗液不会将测序载体洗掉，该测序载体可以继续用于新的待测核酸分子的测序反应，也就是后续的测序反应不需要再进行测序载体的加载环节，简化了实验流程。
68.根据优选的实施方式，非限制性核酸内切酶包括全能核酸酶，典型的，例如：默克公司的benzonase和上海拜朗生物科技有限公司的biolonase，这两种酶均具有广泛的水解核酸的能力，能够降解各种形式的dna和rna，对核酸序列没有要求，对单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的dna和rna的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5
’‑
磷酸核苷酸或5
’‑
磷酸寡核苷酸。
69.根据优选的实施方式，将所述核酸分子分解/裂解后，通入清洗试剂冲洗干净。所述清洗液可以是含有表面活性剂的水溶液，如十二烷基磺酸钠，冲洗多次，在显微镜下观察清洗的效果。
70.根据优选的实施方式，将一次测序反应后的dna全部去除后，需要重新连接扩增引物。根据测序载体表面的化学修饰将带有对应修饰的引物溶液注入芯片，进行连接反应。例如可将炔基修饰的引物与叠氮基团修饰的微球进行click连接；可将叠氮基团修饰的引物与炔基修饰的微球进行click连接；以及其他常用的化学连接方法。
71.根据优选的实施方式，芯片经过一定次数的使用后，测序载体表面修饰的化学基
团会逐步耗尽，此时无法将合适浓度的引物再次连接到微球表面，此时应废弃此芯片，通常一块芯片可重复使用2-10次。
72.本发明的第二方面提供一种可重复利用的测序方法，其特征在于，包括：
73.(1)提供基因测序芯片，所述芯片表面有预先加工好的微坑；所述微坑表面有化学修饰；
74.(2)提供测序载体，将扩增引物种植到所述测序载体表面，用于将待测核酸分子连接到所述测序载体上；所述测序载体表面有化学修饰基团；
75.(3)向所述微坑内加载所述测序载体，所述测序载体通过连接分子固定于所述微坑；
76.(4)向芯片内通入测序反应液，对所述测序载体上的核酸分子进行测序；
77.(5)向芯片内通入裂解剂，使得所述连接分子分解/裂解，以去除所述测序载体；
78.(6)重复步骤(2)-(4)。
79.根据优选的实施方式，当进行多次测序反应时，步骤(6)变为重复步骤(2)-(5)。
80.根据优选的实施方式，在步骤(4)之前对待测核酸分子进行扩增，可以在步骤(2)之后进行扩增，或步骤(3)之后进行扩增。
81.根据优选的实施方式，提供扩增反应物进行扩增反应，所述扩增可以是恒温扩增或普通pcr，恒温扩增包括，例如rpa、raa、lamp、sda、ia500、examp等等。所述扩增反应物包括：dntps、dna聚合酶、离子缓冲液等。
82.本发明中，待测基因片段并不是直接固定在芯片表面的微坑(微井、微阱、微反应室)，而是连接在测序载体上，再将测序载体固定于基因芯片内表面的微坑中，所述固定是测序载体表面修饰的化学基团与微坑表面修饰的化学基团通过连接分子的连接实现的。在完成测序后，通过使用裂解剂直接降解连接分子，即可打断测序载体与微坑的连接，再洗脱测序载体，实现芯片的重复使用。
83.根据优选的实施方式，所述微坑为芯片内表面阵列排布或非阵列排布的凹陷结构，为圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合；所述微坑的尺寸为0.25-5微米，优选0.3-3.5微米，更优选0.5-3微米；周期为0.6-8微米，优选1-5微米。微坑之间的间隔区为疏水性区域，便于进行油封。
84.根据优选的实施方式，所述测序载体包括，聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、聚乙烯微球、二氧化硅微球、乳胶微球、聚丙烯酰胺水凝胶层等。
85.根据优选的实施方式，所述测序载体表面修饰有化学基团，用于种植所述扩增引物，所述扩增引物上也含有相应的化学修饰基团，所述化学修饰基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。
86.根据优选的实施方式，所述测序载体表面修饰有化学基团，用于与连接分子相互作用，所述化学基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。例如的，测序载体表面修饰了生物素，连接分子为链霉亲和素，由于生物素和链霉亲和素之间会发生特异性结合，测序载体可与连接分子连接；所述芯片微坑表面修饰有化学基团，用于与连接分子相互作用，所述化学修饰基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。例如的，微坑表面修饰了生物素，连接分子为链霉亲和素，由于生物素和链霉亲和素之间会发生特异性结合，微坑可与连接分子
连接；从而，所述测序载体通过连接分子固定于所述微坑。
87.根据优选的实施方式，上述连接分子可被特异性地分解/裂解。例如的，连接分子可以是蛋白质，核酸，含有二硫键的线性分子等，所述蛋白质中包括链霉亲和素，生物素等。
88.根据优选的实施方式，将待测基因片段连接到微球上可采用多种方法。方法一，将适量的待测dna单链直接连接到微球上：例如可将biotin修饰的dna与streptavidin修饰的微球混合反应；可将炔基修饰的dna与叠氮基团修饰的微球进行click连接；可将叠氮基团修饰的dna与炔基修饰的微球进行click连接；可将氨基修饰的dna与羧基修饰的微球通过nhs/edc连接；可将羧基修饰的dna与氨基修饰的微球通过nhs/edc连接。以及其他常用的化学连接方法。
89.方法二，通过方法一将扩增引物连接到微球表面，然后加入待测dna单链或者dna文库(需事先连接上合适的接头)，在微球表面进行扩增反应。通过控制条件使每个微球上仅结合有一条dna模板链(或者部分微球上仅有一条dna模板链)。
90.根据优选的实施方式，至少80％的微坑满足条件：每个微坑最多加载一个测序载体，优选的，至少90％的微坑内最多加载一个测序载体。将测序载体加载到芯片微坑内可以采用离心法：将合适浓度的微球悬浮液注入芯片腔体内，以胶带封住芯片出入口，高速离心使微球进入微坑，芯片微坑面应在外侧。然后通过起泡液冲刷，将微坑外的微球去除，保留结合在微坑内部的微球。微球溶液加入的量应根据微坑数目调整，使得微球的数目大于微坑数目，以获得较高的进坑比率；同时微球不宜过多，造成浪费。例如一亿个微坑搭配一亿五千万至五亿个微球。也可采用多次离心的方式获得更高的进坑比率。
91.根据优选的实施方式，本发明涉及的是多碱基的测序方法，作为公开的内容，申请人之前申请的专利，例如cn201510212788.7，例如cn201510212789.1，例如cn201510822361.9，例如cn201680079417.9等描述了多碱基测序的方法。这些专利的内容可以通过引用的形式加入本专利。在此简要描述荧光发生测序过程。将各种所需的水相测序相关试剂注入芯片，然后注入油封试剂，使微球和水相的测序反应液被油封在微坑内。油封试剂可选各种电子氟化液，例如3m的novec
tm
电子氟化液71da，novec
tm
电子氟化液71ipa，novec
tm
7100电子氟化液，novec
tm
7300电子氟化液，novec
tm
7200电子氟化液，novec
tm
7000电子氟化液，novec
tm
7500电子氟化液，fc-3284，fc-72，fc-3283，fc-40等等。升温进行测序反应，测序引物被延伸，同时释放出荧光信号分子，由于油封的作用，自由荧光基团分子被限制在微坑内，控制光源(特定激发光)及信号采集系统可获得测序信号，再根据采集系统获得的测序信号，通过专用的分析软件将光强信号转化成序列信息。
92.根据优选的实施方式，在测序完成后，直接去除测序载体后此芯片即可用于新的测序反应。
93.根据优选的实施方式，去除芯片微坑内测序载体的方法是向芯片内通入裂解剂，所述裂解剂包括非特异性蛋白酶，所述非特异性蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶和链霉蛋白酶、蛋白酶k等。例如的，向芯片内通入蛋白酶k溶液，用以降解链霉亲和素，破坏测序载体和微坑的化学连接，使测序载体脱离微坑，从而轻松将其去除。蛋白酶k是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可以切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，在较广的ph范围(4～12.5)内及高温(50～70℃)均有活性，可以用于消化各种蛋白质。枯草杆菌蛋白酶是芽孢杆菌属细菌所分泌的胞外碱性蛋白酶,属丝氨酸蛋白水解酶类，催
化水解蛋白质为氨基酸；链霉蛋白酶是一种具有包括细胞外丝氨酸蛋白酶在内至少三种蛋白水解活性的混合物，通常，丝氨酸蛋白酶可显示出广泛的底物特异性。
94.根据优选的实施方式，将连接分子分解/裂解后，通入清洗试剂将芯片冲洗干净。所述清洗试剂可以是含有表面活性剂的水溶液，如十二烷基磺酸钠，冲洗多次，在显微镜下观察清洗的效果。
95.根据优选的实施方式，一次测序反应完成后将测序载体全部去除，需要重新载入测序载体。根据微球表面的官能团修饰，将带有对应修饰的连接分子溶液注入芯片，进行连接反应。例如，可将链霉亲和素溶液连接在微坑内表面修饰的生物素上，然后重复上述的载入方法将表面修饰生物素的测序载体载入芯片。
96.根据优选的实施方式，经过一定次数的使用后，微坑内表面的修饰基团会逐步损耗，此时无法将足够比率的测序载体再次载入到微坑内，此时应废弃此芯片，通常一块芯片可重复使用2-10次。
97.实施例1
98.1.微球制备及引物种植。
99.1)配制am(丙烯酰胺)水溶液，浓度50g/l；配制am-n3(甲基丙烯酰胺叠氮单体)水溶液，浓度50g/l；配制am-biotin(丙烯酰胺生物素单体)水溶液，浓度20g/l。配置acva的水/异丙醇溶液，浓度25g/l。配制n,n-二甲基双丙烯酰胺。
100.2)加热至70-90℃，经聚合反应即得到目标功能性聚合物微球。
101.3)微球清洗及提纯。使用ipa清洗微球，去除未反应的单体等物质。使用合适的离心方案将微球浓缩提纯。
102.4)连接扩增引物，将炔基修饰的引物连接到微球表面。
103.2.芯片制备。
104.芯片由两个基板粘合构成，两个基板与粘合材料(如双面胶带，胶水等)共同围成一个空腔(反应室)，空腔的一面即一个基板(称为第一基板)的表面具有周期2.6um，直径1.8um，深1.8um的微坑结构。空腔的另一面(第二基板)是平的。
105.第一基板为含微坑结构的石英片，尺寸为20x45x0.7mm；第二基板为尺寸25x75x1mm的玻璃片，带两个直径1mm的进出样孔。反应室区域的表面修饰为,第一基板用三甲基氯硅烷修饰，第二基板用三甲基氯硅烷修饰。第一、第二基板用双面胶+液态胶粘合在一起，胶层厚度为100um即为反应室的厚度。芯片封装后，用马来酰亚胺-streptavidin溶液进行修饰。
106.3.微球载入微坑。
107.采用合适离心力及离心时间，例如500rpm，2分钟。离心后应采用起泡试剂冲洗芯片，将未进入微坑的微球冲走。
108.4.扩增及测序。
109.1)扩增待测文库
110.将微球表面的扩增引物与待测的dna单链杂交，对待测dna链进行恒温扩增。
111.2)运行流体控制程序进液。首先将测序引物杂交在扩增后的模板上。通过芯片台控制降温至4摄氏度，按照ipa，清洗试剂(wash buffer)，测序试剂(含bst酶，cip酶，mncl2，荧光修饰底物dn4p等)，氟油的顺序依次进液至芯片反应室内。
112.3)测序反应。控制芯片台升温至65摄氏度，持续40秒。测序反应在芯片内的微坑内进行。控制温度至25摄氏度。
113.4)信号采集。控制测序系统的光源及信号采集系统对芯片进行扫描及拍照。
114.5)重复步骤2)至4)，每一轮(cycle)可得到一系列的照片。
115.5.测序数据分析。
116.使用分析软件分析照片，得到测序结果。每一cycle所进测序底物是已知且受控的，如待测序列在此cycle发生了延伸反应，则此位置为此底物的互补碱基(at互补，cg补)，扣除背景后的亮度则代表了延伸的“长度”：一倍信号代表延伸了一个碱基，多倍信号代表延伸了多个碱基。
117.6.将单链dna从微球表面移除。
118.将dna水解酶(dnaseⅰ)溶液灌入芯片，升温至37℃，持续20分钟，之后，用清洗溶液清洗芯片，向芯片内通入表面活性剂的水溶液，如十二烷基磺酸钠，清洗3次。在显微镜下观察，图2所示为裂解剂处理之前的芯片表面荧光图，亮点表示有dna，裂解剂处理后的显微结果如图3所示，此时芯片表面基本不可见dna，清除效率非常高。
119.7.重新连接引物。
120.在去除掉dna后，将0.1～1μmol/l的炔基修饰的引物及催化剂溶液灌入芯片，升温至40度，持续20分钟，用清洗溶液清洗芯片。如图4所示，扩增引物的连接效率非常高。之后，可重复使用该芯片，或将保存试剂注入芯片后将芯片放置于4度冰箱备用。
121.8.芯片废弃。
122.根据微球表面修饰的化学基团的数量和每次测序连接的引物数量不同，经过特定使用次数之后，化学基团趋于耗尽，此时将无法连接足够的引物，此芯片应作废弃处理。例如微球表面有二十万个基团，每次连接引物使用两万个基团，则芯片总共可使用的次数必然少于十次。
123.实施例2
124.本实施例的微球制备及引物种植、芯片制备、微球载入微坑、扩增及测序、测序数据分析步骤同实施例1。
125.测序完成后，进行如下步骤：
126.1.加入裂解剂将微球移除。
127.将蛋白酶k溶液灌入芯片，升温至37度，持续120分钟，之后，用清洗溶液清洗芯片，向芯片内通入表面活性剂的水溶液，如十二烷基磺酸钠，清洗3次。在显微镜下观察确定是否去除掉绝大部分微球，如仍残留有超过要求的比例的微球可继续重复上述步骤。蛋白酶k作用120分钟后，芯片表面基本不可见微球，清除效率非常高。
128.2.重新加载测序载体。
129.在去除掉微球后，将适当浓度的链霉亲和素溶液灌入芯片，升温至37度，持续20分钟，用清洗溶液清洗芯片。然后将合适浓度的微球悬浮液注入芯片腔体内，以胶带封住芯片出入口，高速离心使微球进入微坑，芯片微坑面应在外侧。然后通过起泡液冲刷，将微坑外的微球去除，保留结合在微坑内部的微球。之后，可重复使用该芯片，或将保存试剂注入芯片后将芯片放置于4度冰箱备用。
130.3.芯片废弃。
131.经过一定次数的使用后，芯片内部的表面修饰层会被逐渐磨损，导致载入微球比率下降或测序效果变差，此时应废弃此芯片。
132.以上实施例仅是本发明较佳的实施例，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文阐述的具体描述、构造或相对比例，这些取决于各种条件和变量。对本发明实施方案的形式和细节的各种修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。因此可以预期，本发明也应涵盖任何这样的修改、变化和等同物。意图以所附权利要求限定本发明的范围，由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

技术特征：
1.一种可重复利用的测序方法，其特征在于，包括：1)提供基因测序芯片，所述芯片内表面有预先加工好的微坑；所述微坑表面有化学修饰；2)提供测序载体，将扩增引物种植到所述测序载体表面，用于将待测核酸分子连接到所述测序载体上；所述测序载体表面有化学修饰基团；3)向所述微坑内加载所述测序载体；4)向芯片内通入测序反应液，对所述测序载体上连接的核酸分子进行测序；5)向芯片内通入裂解剂，使得测序载体上的核酸分子分解/裂解,以去除所述测序载体上的核酸分子；6)重复步骤2)，4)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当进行多次测序反应时，步骤6)变为重复步骤2)，4)，5)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)之前对待测核酸分子进行扩增，可以在步骤2)之后进行扩增，或在步骤3)之后进行扩增；所述扩增是pcr或恒温扩增中的一种。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解剂包括核酸水解酶dnaseⅰ、核酸外切酶ⅰ、核酸外切酶ⅶ、非限制性核酸内切酶benzonase、biolonase中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序载体上的化学修饰基团是过量的，优选过量1-10倍，更优选的，过量5-10倍。6.一种可重复利用的测序方法，其特征在于，包括：(1)提供基因测序芯片，所述芯片表面有预先加工好的微坑；所述微坑表面有化学修饰；(2)提供测序载体，将扩增引物种植到所述测序载体表面，用于将待测核酸分子连接到所述测序载体上；所述测序载体表面有化学修饰基团；(3)向所述微坑内加载所述测序载体，所述测序载体通过连接分子固定于所述微坑；(4)向芯片内通入测序反应液，对所述测序载体上的核酸分子进行测序；(5)向芯片内通入裂解剂，使得所述连接分子分解/裂解，以去除所述测序载体；(6)重复步骤(2)-(4)。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当进行多次测序反应时，步骤(6)变为重复步骤(2)-(5)。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(4)之前对待测核酸分子进行扩增，可以在步骤(2)之后进行扩增，或在步骤(3)之后进行扩增；所述扩增是pcr或恒温扩增中的一种。9.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述微坑表面有化学修饰，用于固定所述测序载体，所述化学修饰包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。10.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述测序载体表面有化学修饰基团，用于种植所述扩增引物，所述扩增引物上具有相应的化学修饰基团，所述化学修饰基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。
11.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述测序载体包括，聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、聚乙烯微球、二氧化硅微球、乳胶微球、磁性微球、聚丙烯酰胺水凝胶层等。12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述连接分子为包括生物素或链霉亲和素在内的蛋白质。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述裂解剂包括非特异性蛋白酶，所述非特异性蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶和链霉蛋白酶、蛋白酶k等。

技术总结
本专利公开一种可重复利用的测序方法，将待测基因连接到测序载体上，将此测序载体加载到基因测序芯片表面的微坑内，通入测序反应液进行测序反应；在完成测序反应后，通过去除测序载体表面连接的DNA链或去除测序载体，使芯片恢复为可用状态，从而实现芯片的重复利用。从而实现芯片的重复利用。从而实现芯片的重复利用。


技术研发人员：石磊 宋豫京 乔朔
受保护的技术使用者：赛纳生物科技(北京)有限公司
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/9