一种孕甾烷生物碱衍生物在制备治疗眼底疾病药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，尤其是一种孕甾烷生物碱衍生物在制备治疗眼底疾病药物中的应用。


背景技术：

2.年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, amd）、增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy, pdr）、早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity, rop）是常见的不可逆致盲性眼底疾病，这类疾病的共同特征是眼底病理性、增殖性新生血管，也是致盲的主要因素。目前临床上主要治疗药物为抗vegf的抗体类药物，包括雷珠单抗和贝伐珠单抗等。但这类抗体药物需反复通过玻璃体腔注射，患者顺应性差，眼内炎等并发症的风险增加，治疗费用高。另外，临床上抗体类药物的有效率约为40%-60%，仍有大量患者对抗vegf 药物并不敏感，或产生耐药性。因此，抗体药物的临床应用受到了很大局限，仍需开发可替代、疗效佳、给药方式便捷的药物治疗眼底新生血管疾病。
3.相较于大分子生物药物，小分子药物具有稳定性高、易于给药、成本低等优点。目前在临床前研究中，将应用于抗肿瘤新生血管治疗的小分子血管生成抑制剂，或具有抗血管生成活性的天然产物及衍生物应用于治疗眼底新生血管疾病的研究或专利偶见报道。另外，至今未见应用于治疗眼底新生血管疾病的小分子抑制剂上市。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种孕甾烷生物碱衍生物在制备治疗眼底疾病药物中的应用。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
6.一种孕甾烷生物碱衍生物在制备治疗眼底疾病药物中的应用，所述孕甾烷生物碱衍生物的结构式如下：
7.。
8.进一步地，所述眼底疾病包括湿性年龄相关性黄斑变性和/或增殖型糖尿病视网膜病变和/或早产儿视网膜病变。
9.进一步地，所述应用还包括在抑制眼睛脉络膜新生血管增殖药物中的应用。
10.进一步地，所述应用还包括在抑制眼睛视网膜无灌注区和/或新生血管药物中的应用。
11.进一步地，所述孕甾烷生物碱衍生物的给药方式包括：玻璃体腔注射给药、视网膜
下给药、结膜下给药、眼表给药、球后给药和/或球周给药。最优玻璃体腔注射给药。
12.进一步地，所述药物的溶剂为含有体积浓度为0.2~0.05%二甲基亚砜的生理盐水溶液。优选0.1%二甲基亚砜（体积分数）。
13.进一步地，所述药物的给药浓度为2.5毫克/毫升、5 毫克/毫升和10 毫克/毫升。最优10毫克/毫升。
14.进一步地，所述药物的给药体积为0.5~2微升。优选1微升。
15.进一步地，所述药物的给药频次为每周1~5次，共一周。优选1次。
16.本发明取得的优点和积极效果为：
17.1、本发明克服现有技术中抗vegf的抗体类药物在临床应用上的不足，发现并证明了一种孕甾烷生物碱衍生物在治疗眼底疾病药物中的应用，可有效治疗amd、pdr和rop，有望成为治疗眼底疾病的新药物，进一步通过眼表滴眼给药，提升患者依从性，避免玻璃体腔内注射带来的副作用。
18.2、本发明发现了一种孕甾烷生物碱衍生物在眼底疾病中的应用，在细胞模型上，孕甾烷生物碱衍生物可以抑制视网膜内皮细胞的增殖、迁移和小管形成能力。
19.3、本发明发现了一种孕甾烷生物碱衍生物在眼底疾病中的应用，在湿性amd的动物模型中，可有效抑制脉络膜病理性新生血管的渗漏和增殖。
20.4、本发明发现了一种孕甾烷生物碱衍生物在眼底疾病中的应用，在pdr的动物模型中，可有效抑制视网膜无灌注区的形成和视网膜病理性新生血管的增殖。
21.5、本发明孕甾烷生物碱衍生物是小分子化学药物，相较于市售药物雷珠单抗，稳定性高，受温度、湿度等环境因素影响小，易长期储存；合成设备简易，合成工艺简便，合成原料廉价。
22.6、本发明孕甾烷生物碱衍生物在眼底疾病中的应用，给药方式包括但不限于玻璃体腔内注射，还包括视网膜下给药、结膜下给药、眼表给药、球后给药或球周给药。侵害性小或非侵入性的给药方式能够提升患者依从性。
23.7、本发明通过体内外实验证明该种孕甾烷生物碱衍生物一方面抑制了脉络膜新生血管的增殖，另一方面抑制了视网膜无灌注区和新生血管的增殖。本发明孕甾烷生物碱衍生物可有效治疗amd、pdr和rop，有望替代现有抗vegf的抗体类药物，具有重要的临床应用价值。
24.8、本发明孕甾烷生物碱衍生物是以土家族民间药物转筋草中提取出的孕甾烷生物碱作为先导化合物进行衍生合成得到的新型孕甾烷生物碱类血管生成抑制剂（cn201310749522.7）。前期研究发现该孕甾烷生物碱衍生物通过靶向结合hsp90α，调控hif-1α/vegf/vegfr2信号通路，显著抑制具肿瘤血管新生。鉴于其优异的抗血管生成活性，结合眼部局部给药的特点，本发明孕甾烷生物碱衍生物有望能够在治疗眼底新生血管疾病中发挥优异的疗效。
附图说明
25.图1为本发明中孕甾烷生物碱衍生物对猴视网膜内皮细胞的细胞毒图；
26.图2为本发明中孕甾烷生物碱衍生物抑制猴视网膜内皮细胞的增殖能力图；
27.图3为本发明中孕甾烷生物碱衍生物抑制猴视网膜内皮细胞的迁移能力图：其中，
（a）迁移情况图，（b）统计分析图；
28.图4为本发明中孕甾烷生物碱衍生物抑制猴视网膜内皮细胞的小管形成能力图：其中，（a）小管形成情况图，（b）统计分析图；
29.图5为本发明中孕甾烷生物碱衍生物在湿性amd动物模型中（激光诱导脉络膜新生血管模型）抑制脉络膜新生血管的渗漏图：其中，（a）眼底照相和荧光素钠眼底血管造影图，（b）渗漏区域的荧光强度图，（c）脉络膜新生血管（cnv） 等级统计图；
30.图6为本发明中孕甾烷生物碱衍生物在湿性amd动物模型中（激光诱导脉络膜新生血管模型）抑制脉络膜新生血管的增殖图：其中，（a）血管特异性标记物ib4荧光染色图，（b）脉络膜新生血管（cnv）面积统计图，（c）oct成像图，（d）脉络膜新生血管（cnv）厚度统计图；
31.图7为本发明中孕甾烷生物碱衍生物在pdr动物模型中（氧诱导视网膜新生血管模型）抑制视网膜无灌注区的形成和新生血管的增殖图：其中，（a）血管特异性标记物ib4荧光染色图，（b）视网膜无灌注区面积统计图，（c）视网膜新生血管面积统计图。
具体实施方式
32.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
33.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
34.一种孕甾烷生物碱衍生物在制备治疗眼底疾病药物中的应用，所述孕甾烷生物碱衍生物的结构式如下：
35.。
36.较优地，所述眼底疾病包括湿性年龄相关性黄斑变性和/或增殖型糖尿病视网膜病变和/或早产儿视网膜病变。
37.较优地，所述应用还包括在抑制眼睛脉络膜新生血管增殖药物中的应用。
38.较优地，所述应用还包括在抑制眼睛视网膜无灌注区和/或新生血管药物中的应用。
39.较优地，所述孕甾烷生物碱衍生物的给药方式包括：玻璃体腔注射给药、视网膜下给药、结膜下给药、眼表给药、球后给药和/或球周给药。最优玻璃体腔注射给药。
40.较优地，所述药物的溶剂为含有体积浓度为0.2~0.05%二甲基亚砜的生理盐水溶液。优选0.1%二甲基亚砜（体积分数）。
41.较优地，所述药物的给药浓度为2.5毫克/毫升、5 毫克/毫升和10 毫克/毫升。最优10毫克/毫升。
42.较优地，所述药物的给药体积为0.5~2微升。优选1微升。
43.较优地，所述药物的给药频次为每周1~5次，共一周。优选1次。
44.具体地，相关制备及检测实施例如下：
45.实施例1：一种孕甾烷生物碱衍生物给药溶液的配制
46.实施方式：精密称取一定质量的孕甾烷生物碱衍生物，溶解于一定体积的二甲基亚砜溶液中，充分涡旋，配制浓度为2.5、5、10克/毫升的储备液。吸取一定体积的上述储备液加入到1000倍体积的生理盐水中，充分涡旋，即得浓度为2.5、5、10毫克/毫升的孕甾烷生物碱给药溶液。
47.实施例2：一种孕甾烷生物碱衍生物对猴视网膜内皮细胞的细胞毒性
48.实施方式：培养猴视网膜内皮细胞（rf/6a），取96孔板，每孔接种细胞数为5
×
104个，待细胞贴壁增殖至板底面积的70%，添加梯度浓度孕甾烷生物碱衍生物（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μm），共孵育24小时后，弃去培养基，更换100 μl无酚红培养基，加入10 μl的0.5 mg/ml的mtt（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）溶液，于培养箱中孵育4小时。在酶联免疫检测仪450 nm波长下检测各孔的吸光度。
49.实施结果：如图1所示，本发明孕甾烷生物碱衍生物对rf/6a细胞毒性的ic50为7.229 μm，药物浓度为2.5 μm及以下时对细胞活力无影响。
50.实施例3：一种孕甾烷生物碱衍生物抑制猴视网膜内皮细胞的增殖能力
51.实施方式：培养猴视网膜内皮细胞rf/6a，取96孔板，每孔接种细胞数为5
×
104个，待细胞贴壁增殖至板底面积的70%，添加含有vegf（血管内皮生长因子，20 ng/ml）的梯度浓度孕甾烷生物碱衍生物（0、0.5、1、2.5 μm），共孵育24小时后，弃去培养基，更换100 μl无酚红培养基，加入10 μl的0.5 mg/ml的mtt溶液，于培养箱中孵育4小时。在酶联免疫检测仪450 nm波长下检测各孔的吸光度。
52.实施结果：如图2所示，本发明孕甾烷生物碱衍生物能够在非细胞毒浓度下（0.5，1，2.5 μm）剂量依赖性地抑制vegf诱导的rf/6a的增殖活力，经统计分析，具有显著性差异（p*《0.05，p**《0.01，p***《0.001）。
53.实施例4：一种孕甾烷生物碱衍生物抑制猴视网膜内皮细胞的迁移能力
54.实施方式：于12孔板中每孔接种5
×
105个rf/6a，待细胞长满板底，与孕甾烷生物碱衍生物（0、0.5，1，2.5 μm）共孵育24小时后，用10 μl枪头在每个孔板底部轻轻画一条直线，使其板底细胞出现一条伤痕。pbs清洗，更换不含血清的培养基，在划痕后0、6、8、12、24小时拍照，计算细胞迁移率。
55.实施结果：如图3所示，本发明孕甾烷生物碱衍生物能够在非细胞毒浓度下（0.5，1，2.5 μm）剂量依赖性地抑制vegf诱导的rf/6a的迁移距离（a图），经统计分析（b图），具有显著性差异（p*《0.05，p**《0.01，p***《0.001）。
56.实施例5：一种孕甾烷生物碱衍生物抑制猴视网膜内皮细胞的小管形成能力
57.实施方式：将与孕甾烷生物碱衍生物（0、0.5，1，2.5 μm）共孵育24小时后的rf/6a接种于被matrigel胶包被的48孔板中，于细胞接种后6、8、10、12小时后观察细胞成管情况，拍照分析小管的管长。
58.实施结果：如图4所示，本发明孕甾烷生物碱衍生物能够在非细胞毒浓度下（0.5，1，2.5 μm）剂量依赖性地抑制vegf诱导的rf/6a形成小管的长度，经统计分析，具有显著性差异（p*《0.05，p**《0.01，p***《0.001）。
59.综上，本发明所述的一种孕甾烷生物碱衍生物能够在非细胞毒浓度下剂量依赖性
地抑制vegf诱导的rf/6a的增殖、迁移和小管形成能力。
60.实施例6：一种孕甾烷生物碱衍生物在湿性amd动物模型中（激光诱导脉络膜新生血管模型）抑制脉络膜新生血管的渗漏和增殖
61.实施方式：采用激光诱导脉络膜新生血管模型作为湿性amd的动物模型。选择8周龄的c57bl/6小鼠，利用532 nm倍频激光围绕视盘2-3视盘的距离，在血管之间光凝4个点，光斑直径为50 μm，曝光时间0.05 s，功率400 mw，聚焦于bruch膜，有气泡产生或伴有轻度出血标志着bruch膜被击破，记为有效光凝点。使用光学相干断层扫描仪（oct）显示bruch's 膜的情况。激光照射后，分组给药，具体分组为：空白（阴性）对照组、阳性对照组、给药2.5 mg/ml组、给药5 mg/ml组和给药10 mg/ml组，共计5组。其中空白对照组为激光损伤后，玻璃体腔内注射2 μl生理盐水，阳性对照组注射2 μl 10 mg/ml的雷珠单抗（诺华制药股份有限公司，诺适得），等剂量于孕甾烷生物碱衍生物给药10 mg/ml组，而实验组分别注射2 μl的2.5、5、10 mg/ml的孕甾烷生物碱衍生物。在诱导模型后的第7天麻醉小鼠并散瞳，静脉注射20 mg/ml fitc-葡聚糖，使用小动物眼底成像仪观察并拍摄眼底荧光造影图像，使用oct检测视网膜各层变化情况。成像后迅速摘除小鼠眼球，置于4%pfa中固定过夜，进行脉络膜-巩膜复合物的固定铺片和血管内皮细胞抗体（ib4）的荧光染色。染色步骤具体为，组织先以含有0.3% triton x100的生理盐水溶液洗涤，随后与ib4于4℃下共孵育12小时。继续用生理盐水洗涤组织，然后使用激光共聚焦扫描显微镜观察并拍照，分析新生血管的增殖。
62.实施结果：如图5所示，本发明孕甾烷生物碱衍生物在湿性amd动物模型中（激光诱导脉络膜新生血管模型）抑制脉络膜新生血管的渗漏。其中，a图为利用眼底照相和荧光素钠眼底血管造影的情况，b图和c分别为根据眼底血管造影的情况对渗漏区域（团雾样部分为渗漏区域）的荧光强度和脉络膜新生血管（cnv） 等级的统计情况。如图所示，a图中，空白对照组中观察到非常明显的血管渗漏（弥散的团雾样的高荧光区域），反观阳性对照组和给药组中的血管渗漏的情况得到了显著改善。随着孕甾烷生物碱衍生物的浓度增加，血管渗漏区域的荧光强度（b图）减弱，同时cnv等级（c图）降低，与空白对照组相比，各给药组均具有显著性差异（p*《0.05，p**《0.01）。
63.图6为本发明所述的一种孕甾烷生物碱衍生物在湿性amd动物模型中（激光诱导脉络膜新生血管模型）抑制脉络膜新生血管的增殖。其中，a图为利用荧光标记的血管特异性标记物ib4染色标记的脉络膜上新生血管的增殖情况，b图为根据a图中各增殖点进行的面积统计情况。如图所示，a图中，相较于空白对照组，阳性对照组和给药组的病理性新生血管的增殖（团块样高亮部分）明显减少。随着孕甾烷生物碱衍生物的浓度增加，新生血管的面积（b图）不断减少，与空白对照组相比，给药10 mg/ml组具有显著性差异（p***《0.001）。c图中，展示了oct成像下各组小鼠眼底的脉络膜厚度，相较于空白对照组，阳性对照组和各给药组的脉络膜厚度明显减小，统计分析结果（d图）显示，随着孕甾烷生物碱衍生物的浓度增加，脉络膜厚度不断减少，与空白对照组相比，给药5 mg/ml和10 mg/ml组具有显著性差异（p**《0.01，p***《0.001）。
64.综上，本发明所述的一种孕甾烷生物碱衍生物在湿性amd动物模型中（激光诱导脉络膜新生血管模型）能够剂量依赖性地抑制脉络膜新生血管的渗漏和增殖。
65.实施例7：一种孕甾烷生物碱衍生物在pdr动物模型中（氧诱导视网膜新生血管模型）抑制视网膜无灌注区的形成和新生血管的增殖
66.实施方式：采用氧诱导视网膜病变模型作为pdr的动物模型。将新出生7天的c57bl/6乳鼠和母鼠一起放入氧舱中（75% o2），饲养5天，于出生后的第12天取出，返回正常环境（21% o2），继续饲养5天。期间，进仓后的第2天（出生后的第9天）为无灌注区形成的高峰期，出仓后的第5天（出生后的第17天）为视网膜新生血管增殖的高峰期。其中无灌注区指的是幼鼠的视网膜在氧舱高氧的情况下，会自然退化形成没有血管的区域，形成无灌注区。在幼鼠出氧舱后，在正常环境中，无灌注区会因为没有血管而缺氧，从而诱导大量的新生血管增殖。出仓（出生后的第12天）开始分组给药，具体分组为：空白（阴性）对照组、阳性对照组、给药2.5 mg/ml组、给药5 mg/ml组和给药10 mg/ml组，共计5组。其中空白对照组为出仓后，玻璃体腔内注射1 μl生理盐水，阳性对照组注射1 μl 4 mg/ml的雷珠单抗，而实验组分别注射1 μl的2.5、5、10 mg/ml的孕甾烷生物碱衍生物。出生后的第17天，摘除小鼠眼球，置于4% pfa中固定过夜，进行视网膜的固定铺片和血管内皮细胞抗体（ib4）的荧光染色，染色步骤具体为，组织先以含有0.3% triton x100的生理盐水洗涤，随后与ib4于4℃下共孵育12小时。继续用生理盐水洗涤组织，然后使用激光共聚焦扫描显微镜观察并拍照，分析无灌注区面积和新生血管的增殖。
67.实施结果：图7为本发明所述的一种孕甾烷生物碱衍生物在pdr动物模型中（氧诱导视网膜新生血管模型）抑制视网膜无灌注区的形成和新生血管的增殖。其中a图为视网膜平铺后利用荧光标记的血管特异性标记物ib4染色标记的视网膜上新生血管的增殖情况及其局部放大图。此外，在a图中标记出无灌注区，并对空白对照组、阳性对照组和各给药组的无灌注区面积进行了统计，统计结果如b图所示；在a图中标记出新生血管区，并对空白对照组、阳性对照组和各给药组的无灌注区面积进行了统计，统计结果如c图所示。结果显示，a图中，相较于空白对照组，阳性对照组和各给药组的无灌注区和新生血管明显减少。统计分析显示（b图和c图），随着孕甾烷生物碱衍生物的浓度增加，无灌注区面积和新生血管面积不断减少，与空白对照组相比，各给药组均具有显著性差异（p*《0.05，p**《0.01，p***《0.001）。此外，与阳性对照组相比，给药10 mg/ml组的无灌注区面积显著减少（p***《0.001）。
68.综上，本发明孕甾烷生物碱衍生物在pdr动物模型中（氧诱导视网膜新生血管模型）能够剂量依赖性地抑制视网膜无灌注区的形成和新生血管的增殖。且给药10 mg/ml具有比雷珠单抗更强的抑制视网膜无灌注区形成的作用。
69.尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种孕甾烷生物碱衍生物在制备治疗眼底疾病药物中的应用，其特征在于：所述孕甾烷生物碱衍生物的结构式如下：。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述眼底疾病包括湿性年龄相关性黄斑变性和/或增殖型糖尿病视网膜病变和/或早产儿视网膜病变。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用还包括在抑制眼睛脉络膜新生血管增殖药物中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用还包括在抑制眼睛视网膜无灌注区和/或新生血管药物中的应用。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述孕甾烷生物碱衍生物的给药方式包括：玻璃体腔注射给药、视网膜下给药、结膜下给药、眼表给药、球后给药和/或球周给药。6.根据权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述药物的溶剂为含有体积浓度为0.2~0.05%二甲基亚砜的生理盐水溶液。7.根据权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述药物的给药浓度为2.5毫克/毫升、5 毫克/毫升和10 毫克/毫升。8.根据权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述药物的给药体积为0.5~2微升。9.根据权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述药物的给药频次为每周1~5次，共一周。

技术总结
本发明属于医药技术领域，公开了一种孕甾烷生物碱衍生物在制备治疗眼底疾病药物中的应用。本发明克服现有技术中抗VEGF的抗体类药物在临床应用上的不足，发现并证明了一种孕甾烷生物碱衍生物在治疗眼底疾病药物中的应用，可有效治疗AMD、PDR和ROP，有望成为治疗眼底疾病的新药物，进一步通过眼表滴眼给药，提升患者依从性，避免玻璃体腔内注射带来的副作用。避免玻璃体腔内注射带来的副作用。避免玻璃体腔内注射带来的副作用。


技术研发人员：倪天雯 李筱荣 段宏泉 段晓川 张晓敏 苏琳 秦楠
受保护的技术使用者：天津医科大学眼科医院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/8/9