一种性能提升的突变荧光素酶及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是检测酶领域，具体涉及一种性能提升的突变荧光素酶及其应用。


背景技术：

2.荧光素酶（又称萤光素酶，luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（atp）。没有萤光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应。
3.萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)是一种在三磷酸腺苷(atp)、二价金属离子如镁离子和氧气的存在下催化氧化萤火虫荧光素并使其产生生物发光的酶。应用萤火虫荧光素酶的发光原理可以以极高灵敏度测定微量酶反应底物。萤火虫荧光素酶具有反应灵敏、结果准确、操作简便、应用范围广、无毒副作用等优点。萤光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，并且萤火虫荧光素酶被广泛用于如以atp为指标的微生物检测，测序系统，或利用各种抗体技术、基因扩增技术的高灵敏度测定法等。
4.一般情况，野生型的萤火虫荧光素酶等甲虫类荧光素酶对热不稳定，因此具有制成试剂保存时易失活的缺点。此外，甲虫类荧光素酶的发光量不足且易于衰减，对于高灵敏度测定会存在问题。为了克服上述缺陷，已有的方法在测定试剂中添加盐等，确保某种程度的荧光素酶发光特性性和稳定性。但该方法伴随着试剂组成上的各种制约，无法广泛用于各种用途、试剂，并且一般盐类的添加容易带来荧光素酶反应某种程度的反应障碍。
5.此外，本领域有专利技术公开对野生型萤火虫荧光素酶进行改造。专利文献1（cn103275995b，公告日2015-02-04）公开了一种萤火虫荧光素酶基因及其应用，是通过将野生型的萤火虫荧光素酶基因的第31位赖氨酸突变为丙氨酸后得到的mutluc基因，由于突变了野生型萤火虫荧光素酶基因以及优化了luc的密码子，使得该突变的萤火虫荧光素酶具有易于纯化，得率高(每升发酵菌获得酶蛋白大于5mg)，酶纯度高(酶比活力≥1
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rul/mg蛋白)。专利文献2（cn103409380b，公告日2014-12-10）公开了一种萤火虫荧光素酶及其编码基因及获取方法，对原有北美萤火虫荧光素酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，具体突变是将野生型北美萤火虫荧光素酶(p. pyralis luciferase)基因上的第489位的组氨酸密码子改变成脯氨酸的密码子。
6.综上，虽然现有技术对萤火虫荧光素酶已进行过突变改造，以使得其特性，比如酶活、热稳定性提升。然而，鉴于萤火虫荧光素酶在生物领域的巨大应用前景，本领域仍亟需提供性能提升的、其他不同的萤火虫荧光素酶，特别是在酶活、稳定性、荧光特性各方面性能均有所提升的突变萤火虫荧光素酶。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种多方面性能均有所提升的突变萤火虫荧光素酶，相对于野生型萤火虫荧光素酶，本发明的突变酶在酶活、稳定性、荧光特性方面均有显著提高。本发明通过对野生型萤火虫荧光素酶进行随机化学突变，获得不同的荧光强度增强突变体。再进一步进行筛选，获得酶活和发光持续率最佳的本发明luc突变体3。对luc突变体3进行结构表征，相对于luc野生型，luc突变体3的突变位点及突变类型为g26a、l120e、a238s、s442d、p544k。实验证明，luc突变体3的热稳定性、保存稳定性相对于野生型具有显著的提升。可见，本发明的luc突变体3具有良好的酶学性能，可用于检测领域，包括生物检测、药敏检测、以及毒性物质检测，具有广泛的应用前景。
8.本发明进一步提供一种突变荧光素酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：3所示。
9.本发明的另一方面提供一种分离的核酸，其特征在于，编码所述突变荧光素酶。
10.本发明的另一方面提供一种重组载体，其特征在于，包含所述的核酸。
11.进一步地，其特征在于，所述载体为原核系统表达载体或真核系统表达载体。
12.进一步地，其特征在于，所述原核系统表达载体为大肠杆菌表达载体；所述真核系统表达载体为酵母表达载体，或昆虫细胞表达载体，或哺乳类细胞表达载体。
13.本发明的另一方面提供一种重组宿主细胞，其特征在于，包含所述的核酸或所述的重组载体。
14.进一步地，其特征在于，所述重组宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
15.进一步地，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌；所述真核细胞为酵母细胞，或昆虫细胞，或哺乳类细胞。
16.本发明的另一方面提供一种检测组合物，其特征在于，包含所述突变荧光素酶。
17.本发明的另一方面提供一种突变荧光素酶的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）培养步骤，该步骤中培养所述重组宿主细胞，得到培养物；（2）回收步骤，该步骤中从通过所述培养步骤得到的培养物中回收所述突变荧光素酶。
18.本发明的另一方面提供所述突变荧光素酶在以下任一项中的用途：（1）生物检测；（2）药敏检测；或者，（3）毒性物质检测。
19.本发明提供的突变荧光素酶具有以下多种优异的技术效果：1. 本发明通过对野生型萤火虫荧光素酶进行随机化学突变，获得不同的荧光强度增强突变体。再进一步进行筛选，获得酶活和发光持续率最佳的luc突变体3，相对于野生型酶，比活提升了近10倍，发光持续率提高了近4倍。
20.2. 对于热稳定性，luc突变体3相对于luc野生型具有显著的提升。在40 ℃水浴孵育10 min，luc野生型相对活性降低到8%，而luc突变体3相对活性为93%。在45 ℃水浴孵育10 min，luc野生型几乎失活，相对活性降低到1%，而luc突变体3相对活性仍保持在90%。本发明的luc突变体3具有良好的热稳定性。
21.3. 对于保存稳定性，luc突变体3相对于luc野生型具有显著的提高。保存第6天，luc野生型活性残存率下降超过一半，降低至45%，而luc突变体3活性残存率仍保持在90%。保存至第10天，luc野生型活性残存率下降至16%，而luc突变体3活性残存率仍保持在80%以上。本发明的luc突变体3具有良好的保存稳定性。
附图说明
22.图1为本发明突变体3与野生型的萤火虫荧光素酶热稳定性测定结果图。
23.图2为本发明突变体3与野生型的萤火虫荧光素酶保存稳定性测定结果图。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施案例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；本发明实施例采用的试剂和仪器等均是本领域商业可售或通过常规途径可以获得；实施例中主要采用的分子克隆、菌株构建、测序技术、酶活检测等方法，均是本领域的普通生物技术人员所熟知和能够实现的。
25.实施例1含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组载体构建和阳性克隆筛选野生型萤火虫荧光素酶基因（简称luc，genbank accession no. x66919.1，基因序列如seq id no.1所示，基因编码的酶的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体如表1）添加xbai和bamhi酶切位点序列，委托（华大基因公司）基因序列合成。双酶切（xbai/bamhi）后插入到用同样酶消化过的表达质粒 pet28a(+) 中，构建得到重组质粒pet28a(+)-luc，转化到宿主菌大肠杆菌dh5α。
26.在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒。利用xbai和bamhi进行双酶切验证。验证成功的克隆子进行测序验证（上海英骏生物有限公司），筛选阳性克隆菌株。
27.表1 野生型萤火虫荧光素酶基因序列和氨基酸序列
实施例2随机化学突变取5ug实施例1获得的含有野生型萤火虫荧光素酶基因的阳性重组载体的质粒dna，放于100
µ
l的反应体系中，其中包括0.5m盐酸羟胺，5mm tris-hcl（ph6.0），0.5mm edta-2na，水定容到100
ꢀµ
l。
28.随后65℃反应1小时，之后用dna纯化回收柱回收经过化学突变之后的质粒dna，然后将突变的质粒用xbai和bamhi酶切，连接到构建好的pet28a(+)-luc质粒上，所用位点为xbai和bamhi，从而得到突变克隆，然后通过tecan infinite
®
m200pro多功能酶标仪检测荧光素酶的发光强度，筛选到了4个荧光强度增强的突变体luc突变体1、luc突变体2、luc突变体3、luc突变体4。
29.实施例3突变体与野生型的萤火虫荧光素酶活性测定和荧光特性
以野生萤火虫荧光素酶作为标准品，测定信号强度-活力单位标准曲线，根据标准曲线及紫外测定的蛋白浓度计算出突变体1-4的比活。突变体与野生型的萤火虫荧光素酶比活如表2所示，其中突变体luc突变体3的酶活提升最高，相对于野生型酶的比活提升了近10倍。
30.表2 突变体与野生型的萤火虫荧光素酶比活此外，采用照度计测试并计算发光持续性，反应试剂：50mm tricine-naoh，0.8mm atp，0.5mm荧光素，10mm mgso4，0.2% bsa，2%蔗糖，1mmedta。对于发光持续性，取测定开始后1.2秒后至60秒后的测定值，以60秒后的测定值相对于1.2秒后的测定值的比例（发光率持续率）进行比较。即60秒后的测定值相对于1.2秒后的测定值的比例越低则发光衰减的程度越大，发光持续性越差。
31.结果显示，luc野生型的发光持续率为35%，而对于突变体，luc突变体1、luc突变体2和luc突变体4发光持续率在100%左右，luc突变体3发光持续率为120%（相对于luc野生型提高了近4倍）。可见，突变体3显示出发光时间的显著延长。
32.实施例4 luc突变体3的表征和突变确定由实施例3可知，luc突变体3的酶活特性和荧光特性最佳，对其序列和突变进行表征确定，获得luc突变体3的氨基酸序列如seq id no.3所示，相对于luc野生型（seq id no.2），突变位点及突变类型为g26a、l120e、a238s、s442d、p544k，序列具体见表3。
33.表3 luc突变体3氨基酸序列 氨基酸序列luc突变体3menmendenivygpepfypieegsaaaqlrkymdryaklgaiaftnaltgvdytyaeylekscclgealknyglvvdgrialcsenceeffipvlaglfigvgvaptneiytlrelvhsegiskptivfsskkgldkvitvqktvtaiktivildskvdyrgyqsmdnfikkntpqgfkgssfktvevnrkeqvalimnssgstglpkgvqlthenavtrfshardpiygnqvspgtsiltvvpfhhgfgmfttlgyltcgfrivmltkfdeetflktlqdykcssvilvptlfailnrselldkydlsnlveiasggaplskeigeavarrfnlpgvrqgygltettsaiiitpegddkpgasgkvvplfkakvidldtkktlgpnrrgevcvkgpmlmkgyvdnpeatreiideegwlhtgdigyydeekhffivdrlkdlikykgyqvppaelesvllqhpnifdagvagvpdpiagelpgavvvlekgksmtekevmdyvasqvsnakrlrggvrfvdevpkgltgkidgkaireilkkkvakm（seqidno.3）
实施例5突变体3与野生型的萤火虫荧光素酶热稳定性测定将luc突变体3分别放置在 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃水浴中孵育10 min， 迅速取出放入冰水中冷却1min，取1 μl 加入到10 μl测活反应液，测定其信号强度，以不经孵育的 luc野生型得到的信号为 100％，计算各温度孵育后的重组酶的相对信号，具体如表4所示。以相对信号强度对孵育温度作图，并与luc野生型作对比，结果如图1所示。
34.结果显示，luc突变体3的热稳定性相对于luc野生型具有显著的提升。在40 ℃水浴孵育10 min，luc野生型相对活性降低到8%，而luc突变体3相对活性为93%。在45 ℃水浴孵育10 min，luc野生型几乎失活，相对活性降低到1%，而luc突变体3相对活性仍保持在90%。本发明的luc突变体3具有良好的热稳定性。
35.表4 突变体3与野生型萤火虫荧光素酶热稳定性测定实施例6突变体3与野生型的萤火虫荧光素酶保存稳定性测定在37℃下保存luc突变体3和luc野生型，评价保存后的活性残存率。保存溶液组成：0.1m磷酸钾缓冲液（ph7.0）、2mm edta-2na、0.2%bsa、0.02%酪蛋白、0.05%nan3，luc突变体3、luc野生型以0.1μg/ml的浓度在37℃下保存10天，将保存试验开始时的活性设为100%，数据如表5所示。以活性残存率（%）对保存天数作图，并与luc野生型作对比，结果如图2所示。
36.结果显示，luc突变体3的保存稳定性相对于luc野生型具有显著的提高。保存第6天，luc野生型活性残存率下降超过一半，降低至45%，而luc突变体3活性残存率仍保持在90%。保存至第10天，luc野生型活性残存率下降至16%，而luc突变体3活性残存率仍保持在80%以上，为81%。本发明的luc突变体3具有良好的保存稳定性。
37.表5 突变体3与野生型萤火虫荧光素酶保存稳定性测定
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种突变荧光素酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：3所示。2.一种分离的核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的突变荧光素酶。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为原核系统表达载体或真核系统表达载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述原核系统表达载体为大肠杆菌表达载体；所述真核系统表达载体为酵母表达载体，或昆虫细胞表达载体，或哺乳类细胞表达载体。6.一种重组宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸或权利要求3-5任一项所述的重组载体。7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为原核细胞或真核细胞。8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌；所述真核细胞为酵母细胞，或昆虫细胞，或哺乳类细胞。9.一种检测组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的突变荧光素酶。10.一种突变荧光素酶的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）培养步骤，该步骤中培养权利要求6-8任一项所述的重组宿主细胞，得到培养物；（2）回收步骤，该步骤中从通过所述培养步骤得到的培养物中回收所述突变荧光素酶。11.权利要求1所述的突变荧光素酶在以下任一项中的用途，其特征在于，（1）生物检测；（2）药敏检测；或者，（3）毒性物质检测。

技术总结
本发明提供一种性能提升的突变荧光素酶及其应用。通过对野生型萤火虫荧光素酶进行随机化学突变，获得不同的荧光强度增强突变体。再进一步筛选，获得酶活和发光持续率最佳的本发明Luc突变体3。Luc突变体3相对于野生型，其突变位点及突变类型为G26A、L120E、A238S、S442D、P544K。实验证明，Luc突变体3的热稳定性、保存稳定性相对于野生型具有显著的提升。本发明的Luc突变体3具有良好的酶学性能，可用于检测领域，包括生物检测、药敏检测、以及毒性物质检测等，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。


技术研发人员：林巧
受保护的技术使用者：苏州驾玉生物医药有限公司
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/8/9