一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法及其应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法及其应用。


背景技术：

2.血栓性疾病是指血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引起的疾病，血栓性疾病严重威胁人类的生命健康，其发病率高居各种疾病之首，且近年来还有渐增之势，是当代医学研究的重点和热点之一。随着生活环境及习惯的变化、学习工作压力的增加，使得有心脑血管疾病的人数也逐年增加，并且更趋于年轻化，超过了癌症和糖尿病，使其成为威胁人类生命和健康的三种主要疾病中的首位。
3.溶栓药物是当前治疗血栓类疾病的有效手段，传统溶栓药物效果显著，但还存在着出血、再栓塞、价格昂贵等缺陷。因此，迫切需要寻找副作用小、安全、价格低廉的新型溶栓药物。微生物以具有易培养、来源广等优点，微生物源纤溶酶的发酵、纯化和性质研究成为开发新型溶栓药物和具有溶栓特性功能食品的重要工作。
4.鸡腿菇(coprinuscomatus)学名毛头鬼伞，属真菌门，层菌纲伞菌目，鬼伞科，鬼伞属，是一种重要的药食兼用真菌，鸡腿菇营养丰富，味道鲜美且具有多种生物功能，如抗氧化、抗疲劳和提高机体免疫力等。但目前尚无由固态发酵的鸡腿菇菌丝体获得高活性纤溶酶的报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法，得到的固体发酵基质中富含菌种鸡腿菇yy-17的菌丝体以及纤溶酶，酶活力高，可作为功能性原料用于预防血栓疾病的产品中。
6.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法，所述方法包括如下步骤：
8.将活化后的鸡腿菇菌株接种于液体种子培养基中进行摇床培养，得到种子液；取所述种子液接种于鸡腿菇固体发酵培养基中进行固体发酵，所得固体发酵基质即富含鸡腿菇菌丝体和纤溶酶；
9.所述固体发酵培养基包括大米和麸皮，所述大米和麸皮的质量比为3:1-1:3。
10.优选的，所述鸡腿菇菌株接种于斜面培养基中培养7-12天得到活化后的鸡腿菇菌株；所述斜面培养基包括：20％土豆液100ml、琼脂2.5g、葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g。
11.优选的，所述鸡腿菇菌株为鸡腿菇菌株yy-17，于2023年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.40393。
12.优选的，所述液体种子培养基包括：20％土豆液100ml、葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g。
13.优选的，所述摇床培养的温度为23-25℃，转速为170-190r/min，时间为5-6天。
14.优选的，所述固体发酵培养基的含水量为45％-85％，所述固体发酵培养基的ph为4-8。
15.优选的，所述固体发酵培养基还包括无机盐；所述无机盐的浓度为0.1％-0.5％；所述无机盐包括kh2po4、(nh4)2so4、nacl、cacl2、feso4、mgso4。
16.优选的，所述固体发酵种子液的接种量为15％-30％；所述固体发酵的时间为5-6天。
17.优选的，将所述固体发酵基质经pbs缓冲液浸提、离心后即得所述纤溶酶。
18.本发明还提供了上述方法在制备预防血栓疾病产品中的应用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果：
20.本发明提供了一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法，以鸡腿菇菌株yy-17作为发酵菌种，以大米和麸皮为培养基，经种子培养液制备和固体发酵步骤，制备得到的固体发酵基质中富含鸡腿菇菌株yy-17菌丝体和纤溶酶，其中纤溶酶活力达到1859.13
±
1.2u/g。本发明所述方法菌种及原料安全可靠，培制时间短，易于实现；制备的固体发酵基质可以作为功能性原料用于预防血栓疾病的产品中，具有良好的应用前景。
21.生物保藏说明
22.本发明所述的鸡腿菇菌株yy-17，分类学命名：毛头鬼伞coprinus comatus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.40393，保藏日期为2023年3月17日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
23.图1为鸡腿菇粗酶液溶解血纤维蛋白平板试验；其中，1为鸡腿菇粗酶液，2为生理盐水。
24.图2为固体发酵培养基原料的不同比例对鸡腿菇纤溶酶酶活力的影响。
25.图3为固体发酵培养基不同含水量对鸡腿菇纤溶酶酶活力的影响。
26.图4为固体发酵培养基不同ph对鸡腿菇纤溶酶酶活力的影响。
27.图5为无机盐浓度及添加量对鸡腿菇纤溶酶酶活力的影响。
28.图6为种子接种量对鸡腿菇纤溶酶酶活力的影响。
29.图7为发酵时间对鸡腿菇纤溶酶酶活力的影响。
具体实施方式
30.本发明提供了一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法，所述方法包括如下步骤：
31.将活化后的鸡腿菇菌株接种于液体种子培养基中进行摇床培养，得到种子液；取所述种子液接种于鸡腿菇固体发酵培养基中进行固体发酵，所得固体发酵基质即富含鸡腿菇菌丝体和纤溶酶；
32.所述固体发酵培养基包括大米和麸皮，所述大米和麸皮的质量比为3:1-1:3。
33.本发明中，所述鸡腿菇菌株接种于斜面培养基中培养7-12天得到活化后的鸡腿菇菌株；所述斜面培养基优选的包括：20％土豆液100ml、琼脂2.5g、葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g。本发明对所述斜面培养基的ph没有特殊要求，保持自然即可。
本发明中，所述斜面培养的温度优选为24℃。
34.本发明中，所述鸡腿菇菌株优选为鸡腿菇菌株yy-17，于2023年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.40393。本发明中，所述鸡腿菇菌株yy-17由大兴安岭地区采集得到，经生物学鉴定，其分类学命名为毛头鬼伞coprinuscomatus。
35.本发明中，所述液体种子培养基优选的包括：20％土豆液100ml、葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g。本发明对所述液体种子培养基的ph没有特殊要求，保持自然即可。本发明中，所述摇床培养的温度优选为23-25℃，更优选为24℃，转速优选为170-190r/min，更优选为180r/min，时间优选为5-6天。本发明中，所述活化后的鸡腿菇菌株优选的以打孔器打成10mm的菌片后接种于液体种子培养基中。
36.本发明固体发酵培养基包括大米和麸皮，所述大米和麸皮的质量比为3:1-1:3。本发明中，所述大米和麸皮的质量比优选为1:1。本发明中，所述固体发酵培养基的含水量优选为45％-85％，更优选为75％；所述固体发酵培养基的ph优选为4-8，更优选为6-7.5，最优选为6.5-7。本发明中，所述固体发酵培养基优选的还包括无机盐；所述无机盐的浓度优选为0.1％-0.5％，更优选为0.2％；所述无机盐优选的包括kh2po4、(nh4)2so4、nacl、cacl2、feso4、mgso4。本发明中，所述固体发酵培养基中添加的无机盐最优选为0.2％的(nh4)2so4。本发明中，所述固体发酵种子液的接种量优选为15％-30％，更优选为25％；所述固体发酵的时间优选为5-6天。本发明中，所述固体发酵的温度优选为24℃；所述固体发酵优选为静止避光固体发酵。
37.本发明中，将所述固体发酵基质经pbs缓冲液浸提、离心后即得所述纤溶酶。本发明所述固体发酵基质与所述pbs缓冲液的质量体积比优选为1:5；所述浸提的时间优选为4-6h，所述浸提的温度优选为20-25℃。本发明中，所述离心的温度优选为4℃，所述离心的转速优选为4000r/min。
38.本发明还提供了上述方法在制备预防血栓疾病产品中的应用。
39.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
40.下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
41.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.实施例1
43.联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法：
44.(1)将鸡腿菇菌株yy-17接种入斜面培养基(100ml斜面培养基的组成为：20％土豆液100ml、琼脂2.5g、葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g，ph自然)中，在24℃下培养10天，得到活化后的鸡腿菇菌株yy-17；
45.(2)用打孔器在平板上将步骤(1)中活化后的鸡腿菇菌株yy-17打成10mm的菌片，将菌片接种于液体种子培养基(100ml液体种子培养基的组成为：20％土豆液100ml、葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g，ph自然)中，于24℃、180r/min条件下进行摇床培养，培养5天后得到种子液；
46.(3)将大米与麸皮以1:1的质量比混合，添加浓度为0.2％的(nh4)2so4后调整培养基的含水量为75％，初始ph为7，得到固体发酵培养基；
47.(4)将步骤(2)得到的种子液以25％的接种量接种于步骤(3)所得的固体发酵培养基中，在24℃条件下静止避光培养6天，即得富含鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的固体发酵基质。
48.实施例2
49.联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法：
50.(1)将鸡腿菇菌株yy-17接种入斜面培养基(100ml斜面培养基的组成为：20％土豆液100ml、琼脂2.5g、葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g，ph自然)中，在24℃下培养7天，得到活化后的鸡腿菇菌株yy-17；
51.(2)用打孔器在平板上将步骤(1)中活化后的鸡腿菇菌株yy-17打成10mm的菌片，将菌片接种于液体种子培养基(100ml液体种子培养基的组成为：20％土豆液100ml、葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g，ph自然)中，于24℃、180r/min条件下进行摇床培养，培养6天后得到种子液；
52.(3)将大米与麸皮以3:1的质量比混合，添加浓度为0.2％的(nh4)2so4后调整培养基的含水量为55％，初始ph为7，得到固体发酵培养基；
53.(4)将步骤(2)得到的种子液以20％的接种量接种于步骤(3)所得的固体发酵培养基中，在24℃条件下静止避光培养5天，即得富含鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的固体发酵基质。
54.实施例3
55.联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法：
56.(1)将鸡腿菇菌株yy-17接种入斜面培养基(100ml斜面培养基的组成为：20％土豆液100ml、琼脂2.5g、葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g，ph自然)中，在24℃下培养12天，得到活化后的鸡腿菇菌株yy-17；
57.(2)用打孔器在平板上将步骤(1)中活化后的鸡腿菇菌株yy-17打成10mm的菌片，将菌片接种于液体种子培养基(100ml液体种子培养基的组成为：20％土豆液100ml、葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g，ph自然)中，于24℃、180r/min条件下进行摇床培养，培养5天后得到种子液；
58.(3)将大米与麸皮以1:3的质量比混合，添加浓度为0.2％的(nh4)2so4后调整培养基的含水量为65％，初始ph为7，得到固体发酵培养基；
59.(4)将步骤(2)得到的种子液以30％的接种量接种于步骤(3)所得的固体发酵培养基中，在24℃条件下静止避光培养6天，即得富含鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的固体发酵基质。
60.实施例4
61.纤溶酶活的测定方法
62.(1)将实施例1中富含鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的固体发酵基质与pbs缓冲液以1：5的质量体积比进行混合，在25℃下浸提4h后进行离心，温度为4℃，转速为4000r/min，离心后去其沉淀留上清液，得到鸡腿菇粗酶液。
63.(2)血纤维蛋白平板的配置：
64.①
纤维蛋白原溶液(100ml)
65.称量0.82468g的巴比妥钠定容到100ml，浓度为0.04mol/l；将定容好的溶液ph调到7.8，再向溶液中加入0.4g的牛血纤维蛋原并使之溶解后，10000r/min，离心10min；放置到45℃水浴锅中5min；
66.②
凝血酶溶液
67.将0.5g的琼脂糖溶于100ml的生理盐水中，放置到45℃水浴锅中25min后加入200u的凝血酶；
68.③
将配置好的
①
和
②
各取5ml快速倒入平板中混合，冷却30min后，将凝固好的平板放入冰箱中保存备用。
69.(3)尿激酶标准曲线的测定
70.将尿激酶稀释成30、25、20、15、10、5、1u；在不同浓度中各取10μl的尿激酶标准品点在血纤维蛋白平板上，各三个平行，放置到培养箱中，温度37℃，放置6h；量取溶圈的直径，取三个平行的平均值，所得曲线方程为y＝0.1219
×e(4.6981
×
x)
，r2＝0.978；其中，x代表溶圈直径，y代表酶活力(u/ml)；
71.(4)待测样品纤溶酶活力的测定
72.取步骤(1)粗酶液10μl点在配置好的纤溶酶平板中，放入37℃培养箱中6h后读取直径，做三个平行，取平均值，将平均值带入尿激酶标准曲线中，经计算得出纤溶酶酶活力达到1859.13u/g。同时以生理盐水作为对照组进行相同试验，得到测定结果如图1。
73.可以看出，本发明所述的鸡腿菇纤溶酶可以溶解血纤维蛋白平板产生透明圈，而生理盐水则无法溶解血纤维蛋白，表明本发明所述的鸡腿菇纤溶酶可以实现溶栓的作用。
74.实施例5
75.联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶方法的影响因素
76.固体发酵培养具体步骤：
77.将称量好的大米和麸皮放入250ml的三角瓶中，加水浸泡后滤干水分，再加入定量的水分，放入灭菌锅中，温度为121℃，灭菌30min后得到固体培养基，将其放无菌室冷却。
78.取按照实施例1步骤(1)-(2)得到的鸡腿菇菌种子液，接种入已冷却好的固体培养基中后，将培养基放入培养箱中24℃，静止避光培养。
79.1)大米和麸皮质量比的测定
80.按照上述固体发酵培养具体步骤，将大米和麸皮分别以6:1、3:1、1:1、1:3、1:6的质量比添加到250ml的三角瓶中，在含水量为75％，无机盐为0.2％(nh4)2so4，ph为7，接种量为25％的条件下培养6天，测最终浸提液中酶活力，各做三平行，取平均值，确定大米和麸皮的质量比，得到结果如图2。
81.2)含水量的测定方法
82.按照上述固体发酵培养具体步骤，将大米和麸皮以1:1的质量比添加入250ml的三角瓶中，分别加入25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％的水分，在无机盐为0.2％(nh4)2so4，ph为7，接种量为25％的条件下培养6天，测最终浸提液中酶活力，各做三平行，取平均值，确定最适宜的培养基的含水量，得到结果如图3。
83.3)合适初始ph的测定方法
84.按照上述固体发酵培养具体步骤，将大米和麸皮以1:1的质量比添加入250ml的三角瓶中，在含水量为75％，无机盐为0.2％(nh4)2so4，接种量为25％的条件下培养6天，调节培养基的初始ph分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，测最终浸提液中酶活力，各做三平行，并取平均值，确定适宜的ph量，得到结果如图4。
85.4)合适无机盐添加量的测定
86.按照上述固体发酵培养具体步骤，将大米和麸皮以1:1的质量比添加入250ml的三
角瓶中，在含水量为75％，ph为7，接种量为25％的条件下培养6天，选取kh2po4、mgso4、nacl、cacl2、feso4、(nh4)2so4六种无机盐，每种浓度都设为0.1％～0.5％，测得最终浸提液中纤溶酶活力，各做三平行取平均值，确定适宜无机盐的种类及浓度，得到结果如图5。
87.5)合适接种量的测定方法
88.按照上述固体发酵培养具体步骤，将大米和麸皮以1:1的质量比添加入250ml的三角瓶中，在含水量为75％，ph为7，无机盐为0.2％(nh4)2so4的条件下培养6天，调节菌株接种量分别为5％、10％、15％、20％、25％、30％，测最终浸提液中酶活力，各做三个平行，取平均值，确定适宜的接种量，得到结果如图6。
89.6)合适发酵时间的测定方法
90.按照上述固体发酵培养具体步骤，将大米和麸皮以1:1的质量比添加入250ml的三角瓶中，在含水量为75％，ph为7，无机盐为0.2％(nh4)2so4，接种量为25％的条件下分别培养1-9天，测最终浸提液中酶活力，各做三个平行取平均值，确定适宜的发酵时间，得到结果如图7。
91.可以看出，本发明提供了一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法，以鸡腿菇菌株yy-17作为发酵菌种，以大米和麸皮为培养基，经种子培养液制备和固体发酵步骤，制备得到的固体发酵基质中富含鸡腿菇菌株yy-17菌丝体和纤溶酶，其中纤溶酶活力达到1859.13
±
1.2u/g。本发明所述方法菌种及原料安全可靠，培制时间短，易于实现；制备的固体发酵基质可以作为功能性原料用于预防血栓疾病的产品中，具有良好的应用前景。
92.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将活化后的鸡腿菇菌株接种于液体种子培养基中进行摇床培养，得到种子液；取所述种子液接种于鸡腿菇固体发酵培养基中进行固体发酵，所得固体发酵基质即富含鸡腿菇菌丝体和纤溶酶；所述固体发酵培养基包括大米和麸皮，所述大米和麸皮的质量比为3:1-1:3。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鸡腿菇菌株接种于斜面培养基中培养7-12天得到活化后的鸡腿菇菌株；所述斜面培养基包括：20％土豆液100ml、琼脂2.5g、葡萄糖1g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述鸡腿菇菌株为鸡腿菇菌株yy-17，于2023年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.40393。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体种子培养基包括：20％土豆液100ml、葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述摇床培养的温度为23-25℃，转速为170-190r/min，时间为5-6天。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体发酵培养基的含水量为45％-85％，所述固体发酵培养基的ph为4-8。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体发酵培养基还包括无机盐；所述无机盐的浓度为0.1％-0.5％；所述无机盐包括kh2po4、(nh4)2so4、nacl、cacl2、feso4、mgso4。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体发酵种子液的接种量为15％-30％；所述固体发酵的时间为5-6天。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述固体发酵基质经pbs缓冲液浸提、离心后即得所述纤溶酶。10.权利要求1-9任意一项所述方法在制备预防血栓疾病产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种联产鸡腿菇菌丝体和纤溶酶的方法及其应用，涉及生物工程技术领域。本发明以鸡腿菇菌株YY-17作为发酵菌种，以大米和麸皮为培养基，经种子培养液制备和固体发酵步骤，制备得到的固体发酵基质中富含鸡腿菇菌株YY-17菌丝体和纤溶酶，其中纤溶酶活力达到1859.13


技术研发人员：刘晓兰 郑喜群 李冠龙 孙美佳
受保护的技术使用者：齐齐哈尔大学
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/8/9