用于防腐保鲜的益生菌及其组合物的制作方法

1.本发明涉及用于防腐保鲜的益生菌及其组合物，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.食品防腐保鲜的含义是在贮藏过程中保持食品固有的色、香、味、形及其营养成分，为此而应用的化学品称为防腐保鲜剂。研究表明，天然的防腐保鲜剂的毒性远远低于人工合成的防腐保鲜剂(参考文献：李柳冰,刘巧瑜,陈海光等.天然保鲜剂的研究进展[j].广州化工，2018，46(15)：32-34.)。因此，从自然界寻找更多防腐保鲜效果好的天然防腐保鲜剂对保障食品安全十分重要。
[0003]
生物防腐保鲜剂是一种“以菌治菌”的天然防腐保鲜剂。与其他以芸香料、菊科、樟科等食用香料植物，魔芋、高良姜等中草药制剂，以及，荷叶、大蒜茶叶、葡萄色素等提取物为主的天然防腐保鲜剂相比，生物防腐保鲜剂具有能够有效阻隔氧气和微生物、维持水分、护色和抗氧化等优势。目前，被批准使用的生物防腐保鲜剂仅有乳酸乳球菌素和纳他菌素两种。
[0004]
但是，使用乳酸乳球菌素作为生物防腐保鲜剂时，若乳酸链球菌素发生感染，可能会导致红斑以及丘疹等炎症发生，从而可能会对人体产生一定的危害；使用纳他菌素作为生物防腐保鲜剂时，由于人体消化道不易吸收，微生物对纳他霉素不易产生抗性，长期大量摄入，可能会给消化系统增加一些负担。因此，亟需找到防腐保鲜效果好且对人体安全性更高的的生物防腐保鲜剂。


技术实现要素：

[0005]
为解决上述问题，本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)lp-301，所述植物乳杆菌lp-301保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.25279，保藏日期为2022年07月11日。
[0006]
所述植物乳杆菌lp-301来源于四川省蒲江县甘溪镇地区的泡菜样本，该菌株经测序分析，其16s rdna序列如seq id no.1所示，将测序得到的序列在genebank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为植物乳杆菌。
[0007]
本发明还提供了一株副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)prosci-101，所述副干酪乳酪杆菌prosci-101保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.26528，保藏日期为2023年02月08日。
[0008]
所述副干酪乳酪杆菌prosci-101来源于新疆帕米尔高原地区的酸牛乳样本，该菌株经测序分析，其16s rdna序列如seq id no.2所示，将测序得到的序列在genebank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为副干酪乳酪杆菌。
[0009]
本发明还提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含上述植物乳杆菌lp-301的活菌、灭活菌体和/或代谢产物；和/或，上述副干酪乳酪杆菌prosci-101的活
菌、灭活菌体和/或代谢产物。
[0010]
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌组合物的成分包含上述植物乳杆菌lp-301的灭活菌体和代谢产物；和/或，上述副干酪乳酪杆菌prosci-101的灭活菌体和代谢产物。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌组合物为益生菌后生元组合物。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌组合物的制备方法为：将上述植物乳杆菌lp-301和/或上述副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌接种至发酵培养基中进行培养，得到发酵液；将发酵液进行后处理，得到益生菌组合物。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌组合物的制备方法为：将上述植物乳杆菌lp-301和/或上述副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌接种至发酵培养基中，于30～38℃下培养至ph为4.4～4.6，得到发酵液；将发酵液经杀菌灭活后进行干燥，得到益生菌组合物。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌lp-301和/或副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌在发酵培养基中的接种量为1
×
106～5
×
106cfu/g。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，接种时，所述植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌比为1～10：1～10。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液中，植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌总数不低于3.0
×
10
10
cfu/g。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，所述干燥为喷雾干燥、冷冻干燥或喷雾冷冻干燥。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，以质量百分比计，所述发酵培养基的成分包含脱脂大豆粉0～100％，脱盐乳清粉0～100％，余量为水。
[0019]
本发明还提供了一种制备上述益生菌组合物的方法，所述方法为：将上述植物乳杆菌lp-301和/或上述副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌接种至发酵培养基中进行培养，得到发酵液；将发酵液进行后处理，得到益生菌组合物。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将上述植物乳杆菌lp-301和/或上述副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌接种至发酵培养基中，于30～38℃下培养至ph为4.4～4.6，得到发酵液；将发酵液经杀菌灭活后进行干燥，得到益生菌组合物。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌lp-301和/或副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌在发酵培养基中的接种量为1
×
106～5
×
106cfu/g。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，接种时，所述植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌比为1～10：1～10。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液中，植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌总数不低于3.0
×
10
10
cfu/g。
[0024]
在本发明的一种实施方式中，所述干燥为喷雾干燥、冷冻干燥或喷雾冷冻干燥。
[0025]
在本发明的一种实施方式中，以质量百分比计，所述发酵培养基的成分包含脱脂大豆粉0～100％，脱盐乳清粉0～100％，余量为水。
[0026]
本发明还提供了上述植物乳杆菌lp-301或上述副干酪乳酪杆菌prosci-101或上述益生菌组合物在制备产品中的应用。
[0027]
在本发明的一种实施方式中，所述产品具有如下任一所示的功能：
[0028]
(a)防腐保鲜；
[0029]
和/或，(b)抑制致病菌和/或腐败菌。
[0030]
在本发明的一种实施方式中，所述防腐保鲜包括防止产品亚硝酸盐和挥发性盐基氮含量过高，防止产品生物胺含量过高，和/或，防止产品腐败和变质。
[0031]
在本发明的一种实施方式中，所述致病菌和腐败菌包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和/或单核细胞增生李斯特菌。
[0032]
本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或日化用品。
[0033]
本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述植物乳杆菌lp-301、上述副干酪乳酪杆菌prosci-101或上述益生菌组合物。
[0034]
在本发明的一种实施方式中，所述产品具有如下任一所示的功能：
[0035]
(a)防腐保鲜；
[0036]
和/或，(b)抑制致病菌和/或腐败菌。
[0037]
在本发明的一种实施方式中，所述防腐保鲜包括防止产品亚硝酸盐和挥发性盐基氮含量过高，防止产品生物胺含量过高，和/或，防止产品腐败和变质。
[0038]
在本发明的一种实施方式中，所述致病菌和腐败菌包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和/或单核细胞增生李斯特菌。
[0039]
本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或日化用品。
[0040]
本发明技术方案，具有如下优点：
[0041]
1、本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)lp-301，所述植物乳杆菌lp-301保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25279。研究表明，所述植物乳杆菌lp-301能够显著抑制荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌等致病菌和腐败菌的生长，能够有效防止鱼肉等蛋白质含量高的食品亚硝酸盐和挥发性盐基氮含量过高，并且，能够有效防止鱼肉等蛋白质含量高的食品生物胺含量过高，可见，所述植物乳杆菌lp-301可以防腐保鲜，在生鲜冷冻食品和预制菜等需延长货架期的食品的制备中极具应用前景。同时，所述植物乳杆菌lp-301属于益生菌，益生菌可对人体产生多种有益作用，如调节肠道功能、维持肠道菌群平衡等，因此，所述植物乳杆菌lp-301用于食品的防腐保鲜时，具有安全性更高的优势。
[0042]
2、本发明提供了一株副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)prosci-101，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌prosci-101保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26528。研究表明，所述副干酪乳酪杆菌prosci-101能够显著抑制荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌等致病菌和腐败菌的生长，能够有效防止鱼肉等蛋白质含量高的食品亚硝酸盐和挥发性盐基氮含量过高，并且，能够有效防止鱼肉等蛋白质含量高的食品生物胺含量过高，可见，所述副干酪乳酪杆菌prosci-101可以防腐保鲜，在生鲜冷冻食品和预制菜等需延长货架期的食品的制备中极具应用前景。同时，所述副干酪乳酪杆菌prosci-101属于益生菌，益生菌可对人体产生多种有益作用，如调节肠道功能、
维持肠道菌群平衡等，因此，所述副干酪乳酪杆菌prosci-101用于食品的防腐保鲜时，具有安全性更高的优势。
[0043]
3、本发明提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含植物乳杆菌lp-301的活菌、灭活菌体和/或代谢产物，以及，副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌、灭活菌体和/或代谢产物。研究表明，所述益生菌组合物能够显著抑制荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌等致病菌和腐败菌的生长，能够有效防止鱼肉等蛋白质含量高的食品亚硝酸盐和挥发性盐基氮含量过高，能够有效防止鱼肉等蛋白质含量高的食品生物胺含量过高，并且，能够有效防止面食制品腐败和变质，可见，所述益生菌组合物可以防腐保鲜，在生鲜冷冻食品和预制菜等需延长货架期的食品的制备中极具应用前景。同时，所述益生菌组合物中的植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101均属于益生菌，益生菌可对人体产生多种有益作用，如调节肠道功能、维持肠道菌群平衡等，因此，所述益生菌组合物用于食品的防腐保鲜时，具有安全性更高的优势。
[0044]
生物材料保藏
[0045]
一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)lp-301，分类学命名为lactobacillus plantarum，已于2022年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25279，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0046]
一株副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)prosci-101，分类学命名为lacticaseibacillus paracasei，已于2023年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26528，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
[0047]
图1：实施例1制备的益生菌组合物对面食制品贮藏期间表面组织状态的影响。
具体实施方式
[0048]
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0049]
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0050]
下述实施例中涉及的荧光假单胞菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为atcc13525，铜绿假单胞菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为atcc9027，大肠埃希氏菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为atcc25922，金黄色葡萄球菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为cicc10384，肠炎沙门氏菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为atcc14028，蜡样芽孢杆菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为
atcc11778，单核细胞增生李斯特氏菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为atcc19111；下述实施例中涉及的脱脂大豆粉购自山东景云食品配料有限公司，脱盐乳清粉购自山东景云食品配料有限公司；下述实施例中涉及的kmb固体培养基、乙酰氨基半乳糖培养基、lb培养基、营养肉汁琼脂培养基、tsb培养基和李斯特氏菌显色培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司；下述实施例中涉及的均质使用购自上海迈克孚生物科技公司的mf110eh型号均质机完成，喷雾干燥使用购自浙江钱江伟岸干燥设备公司的lpg-5型号喷雾干燥机完成。
[0051]
下述实施例中涉及的发酵培养基的制备方法如下：
[0052]
发酵培养基的成分由脱脂大豆粉4wt％、脱盐乳清粉15wt％和余量水组成；将发酵培养基的各成分按比例混合后，58℃化料(即于150rpm下搅拌)15min，得到料液；将料液在58℃下，于一级压力19mpa、二级压力5.0mpa下均质一次，得到均质后的料液；将均质后的料液于93℃杀菌30min，得到杀菌后的料液；将杀菌后的料液冷却至35℃，得到发酵培养基。
[0053]
实验例1：植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的获取具体步骤如下：
[0054]
分别以来源于四川省浦江县甘溪镇地区的泡菜和来源于新疆帕米尔高原地区的酸牛乳为样本，吸取0.5ml样本添加至5ml的mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h进行富集，得到富集后的样品；吸取0.5ml富集后的样品添加至4.5ml无菌生理盐水中获得10-1
稀释液，重复此操作，使用10-1
稀释液依次稀释得到10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
稀释液；吸取100μl梯度稀释液分别涂布于mrs固体培养基上，37℃厌氧培养48h，得到菌落；选择mrs固体培养基上具有植物乳杆菌典型特征的菌落(菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色)和具有副干酪乳酪杆菌典型特征的菌落(菌落0.5～1.5mm、乳黄色、圆形隆起、边缘整齐、有光泽、无透明圈)，用接种环挑取菌落在mrs固体培养基上进行划线，37℃厌氧培养48h，得到纯化的单菌落；挑取纯化的单菌落分别接种至5ml的mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到菌液；将各菌液所对应的各菌株编号后，参照教科书《微生物学》(沈萍，陈向东主编)进行革兰氏染色、菌种鉴定、生理生化实验和基因组鉴定分析，选取具有植物乳杆菌和副干酪乳酪杆菌典型特征的菌株，得到菌株lp-301和菌株prosci-101(菌株lp-301和菌株prosci-101均为杆状革兰氏阳性细菌)；
[0055]
其中，菌株lp-301通过乳酸菌通用引物27f(seq id no.3)/1492r(seq id no.4)扩增所得的16s rdna序列如seq id no.1所示；将菌株lp-301的16s rdna在ncbi的blastn程序进行核酸序列比对，结果显示此菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)lp-301；将植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)lp-301保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25279。
[0056]
菌株prosci-101通过乳酸菌通用引物27f(seq id no.3)/1492r(seq id no.4)扩增所得的16s rdna序列如seq id no.2所示；将菌株prosci-101的16s rdna在ncbi的blastn程序进行核酸序列比对，结果显示此菌株为副干酪乳酪杆菌，命名为副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)prosci-101；将副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)prosci-101保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26528。
[0057]
实施例1：一种益生菌组合物
[0058]
本实施例提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含植物乳杆菌
lp-301的灭活菌体和代谢产物，以及，副干酪乳酪杆菌prosci-101的灭活菌体和代谢产物；所述益生菌组合物的制备方法如下：
[0059]
发酵：将植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌按照6
×
106cfu/g的接种量接种至发酵培养基中，于35℃下培养至ph为4.5，得到发酵液；接种时，植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌比为1：1；
[0060]
后处理：将发酵液于一级压力19mpa、二级压力5.0mpa下均质一次，得到均质后的发酵液；将均质后的发酵液于85℃杀菌灭活15min，得到杀菌灭活后的发酵液；将杀菌灭活后的发酵液经喷雾干燥，得到益生菌组合物。
[0061]
实施例2：一种益生菌组合物
[0062]
本实施例提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含植物乳杆菌lp-301的灭活菌体和代谢产物；所述益生菌组合物的制备方法如下：
[0063]
发酵：将植物乳杆菌lp-301的活菌按照6
×
106cfu/g的接种量接种至发酵培养基中，于35℃下培养至ph为4.5，得到发酵液；
[0064]
后处理：将发酵液于一级压力19mpa、二级压力5.0mpa下均质一次，得到均质后的发酵液；将均质后的发酵液于85℃杀菌灭活15min，得到杀菌灭活后的发酵液；将杀菌灭活后的发酵液经喷雾干燥，得到益生菌组合物。
[0065]
实施例3：一种益生菌组合物
[0066]
本实施例提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含副干酪乳酪杆菌prosci-101的灭活菌体和代谢产物；所述益生菌组合物的制备方法如下：
[0067]
发酵：将副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌按照6
×
106cfu/g的接种量接种至发酵培养基中，于35℃下培养至ph为4.5，得到发酵液；
[0068]
后处理：将发酵液于一级压力19mpa、二级压力5.0mpa下均质一次，得到均质后的发酵液；将均质后的发酵液于85℃杀菌灭活15min，得到杀菌灭活后的发酵液；将杀菌灭活后的发酵液经喷雾干燥，得到益生菌组合物。
[0069]
实施例4：一种益生菌组合物
[0070]
本实施例提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含副干酪乳酪杆菌prosci-101的灭活菌体和代谢产物，以及，植物乳杆菌lp-301的灭活菌体和代谢产物；所述益生菌组合物的制备方法如下：
[0071]
发酵：将副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌按照6
×
106cfu/g的接种量接种至发酵培养基中，于35℃下培养至ph为4.5，得到发酵液；接种时，植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌比为10：1；
[0072]
后处理：将发酵液于一级压力19mpa、二级压力5.0mpa下均质一次，得到均质后的发酵液；将均质后的发酵液于85℃杀菌灭活15min，得到杀菌灭活后的发酵液；将杀菌灭活后的发酵液经喷雾干燥，得到益生菌组合物。
[0073]
实施例5：一种益生菌组合物
[0074]
本实施例提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含副干酪乳酪杆菌prosci-101的灭活菌体和代谢产物，以及，植物乳杆菌lp-301的灭活菌体和代谢产物；所述益生菌组合物的制备方法如下：
[0075]
发酵：将副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌按照6
×
106cfu/g的接种量接种至发
酵培养基中，于35℃下培养至ph为4.5，得到发酵液；接种时，植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101的活菌比为1：10；
[0076]
后处理：将发酵液于一级压力19mpa、二级压力5.0mpa下均质一次，得到均质后的发酵液；将均质后的发酵液于85℃杀菌灭活15min，得到杀菌灭活后的发酵液；将杀菌灭活后的发酵液经喷雾干燥，得到益生菌组合物。
[0077]
实验例1：益生菌组合物对不同菌的抑菌效果验证
[0078]
1实验方法
[0079]
利用牛津杯发进行抑菌实验。将实施例1～5制备的益生菌组合物分别用无菌水复溶至干物质含量为10％并用naoh调节ph至中性(ph＝7.0)，得到益生菌组合物稀释液1～5。实验过程为：将灭菌后的素琼脂(含15g/l琼脂的水)倒入一次性平板，静置30min等待凝固，得到刚倒的平板；将灭过菌的牛津杯放置在刚倒的平板上后，将荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌的菌液按照1％(v/v)的接种量分别接种于15ml kmb固体培养基、乙酰氨基半乳糖培养基、lb培养基、营养肉汁琼脂培养基、tsb培养基和李斯特氏菌显色培养基中，混匀后倒入刚倒的平板，使混合物均匀覆盖平板表面无气泡，静置30min等待凝固后用镊子将牛津杯取出，分别吸取100μl益生菌组合物稀释液1～3添加至牛津杯造成的圆孔中，将平板放置于三气培养箱中37℃静置培养48h，测量抑菌圈(mm)的大小，测量结果见表1。
[0080]
2实验结果
[0081]
如表1所示，实施例1～5制备的益生菌组合物对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌均具有抑菌活性，此结果表明表明实施例1～5制备的益生菌组合物可有效抑制致病菌和腐败菌的生长；对比实施例1～5制备的益生菌组合物的抑菌圈大小可知，实施例1和实施例4～5中使用植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101双菌复配制备的益生菌组合物在抑制致病菌和腐败菌生长的效果上较实施例2～3中使用植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101单菌制备的益生菌组合物更佳，表明植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101双菌复配能够进一步提高其抑菌活性。
[0082]
表1益生菌组合物对不同菌的抑菌效果
[0083]
[0084]
[0085][0086]
实验例2：益生菌组合物对食品的防腐保鲜效果
[0087]
1实验方法
[0088]
采用实施例1～3制备的益生菌组合物。实验分为三组处理组与一组对照组，其中，三组处理组分别为按占市售预制菜鱼香肉丝总质量1
‰
的添加量添加有实施例1～3制备的益生菌组合物的市售预制菜鱼香肉丝(净含量360g，4℃下保质期为7天)，对照组为正常生产不添加益生菌组合物的市售预制菜鱼香肉丝。实验过程为：将不同组的预制菜鱼香肉丝在室温(25℃)条件下放置0、1、3、5、7天后，按《食品安全国家标准：食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定(gb 5009.33-2016)》规定方法测定亚硝酸盐含量(国家强制性标准中规定乳制品中亚硝酸盐含量不得高于0.2mg/kg；国家规定肉制品中亚硝酸盐的残留量不得超过0.03g/kg)，按照国标《gb 5009.288-2016食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》规定方法测挥发性盐基氮定含量(根据国家标准规定，鲜海水鱼的tvbn值在15mg/100g以内为一级鲜度，而在30mg/100g以上时，就无法再进行货架销售；gb2707-2005鲜(冻)畜肉卫生标准≤20mg/100g、gb9959.1-2001鲜、冻片猪肉≤15mg/100g；gbt 9959.2-2008分割鲜冻猪瘦肉≤15mg/100g)，检测结果见表2。
[0089]
2实验结果
[0090]
由表2可知，三组处理组中预制菜鱼香肉丝中的亚硝酸盐含量和tvbn含量在3d、5d、7d时均显著低于对照组，表明实施例1～3制备的益生菌组合物可减缓亚硝酸盐含量和tvbn含量的生成速率，保鲜防腐效果较好；同时，对比三组处理组中预制菜鱼香肉丝中的亚硝酸盐含量和tvbn含量可知，实施例1中使用植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101双菌复配制备的益生菌组合物在减缓亚硝酸盐含量和tvbn含量生成速率的效果上较实施例2～3中使用植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101单菌制备的益生菌组合物更佳，表明植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101双菌复配能够进一步提高其防腐保鲜作用。
[0091]
表2益生菌组合物对肉禽食品中亚硝酸盐含量和tvbn含量的影响
[0092][0093]
实验例3：益生菌组合物对食品的防腐保鲜效果
[0094]
1实验方法
[0095]
采用实施例1～3制备的益生菌组合物。实验分为三组处理组与一组对照组，其中，三组处理组分别为按占市售预制菜鱼香肉丝总质量1
‰
的添加量添加有实施例1～3制备的益生菌组合物的市售预制菜清蒸鲈鱼(净含量500g，4℃下保质期为15天)，对照组为正常生产不添加益生菌组合物的市售预制菜清蒸鲈鱼。实验过程为：将不同组的预制菜清蒸鲈鱼在室温(25℃)条件下放置0、5、10、15天后，按《gb5009.208-2016食品安全国家标准》规定方法测定生物胺含量，检测结果见表3。
[0096]
2实验结果
[0097]
由表3可知，处理组中预制菜清蒸鲈鱼在贮藏10d、15d时尸胺及腐胺含量均小于对照组，且差异显著，组胺含量在5d、10d、15d时后生元组显著低于对照组，且差异显著，表明实施例1～3制备的益生菌组合物可显著降低货架期中食品生物胺含量，保鲜防腐效果较好；同时，对比三组处理组中预制菜清蒸鲈鱼中的生物胺含量可知，实施例1中使用植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101双菌复配制备的益生菌组合物在降低货架期中食品生物胺含量的效果上较实施例2～3中使用植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101单菌制备的益生菌组合物更佳，表明植物乳杆菌lp-301和副干酪乳酪杆菌prosci-101双菌复配能够进一步提高其防腐保鲜作用。
[0098]
表3益生菌组合物对肉禽食品中生物胺含量的影响
[0099][0100]
实验例4：益生菌组合物对食品的防腐保鲜效果
[0101]
1实验方法
[0102]
采用实施例1制备的复合益生菌后生元组合物。实验分为处理组与对照组，其中，处理组为按占面包粉总质量1
‰
的添加量添加有实施例1制备的益生菌组合物的面包，对照组为正常生产不添加益生菌组合物的面包。实验过程为：采用gb/t14611-2008《粮油检验小麦粉面包烘焙品质试验直接发酵法》制备面包，面包制作流程：称样(面包粉1000g)
→
和面(20min)
→
发酵和三次揉压(90min)
→
成型
→
醒发(55min)
→
烘烤(210℃，20min)
→
样品冷却(1h)
→
真空袋封装(室温箱内放置)
→
切片
→
测定，处理组的生元组合物在和面步骤加入；烘焙完成后，将不同组的面包在室温(25℃)条件下放置0、1、3、5、7、12、15天后，观察面包，检测面包的硬度和水分，并于放置15天后，根据按照gb4789.15-2016规定方法测定霉菌酵母菌落数，检测结果见图1和表4～5；
[0103]
其中，观察面包的标准为：形态是否完整、丰满、无黑斑或焦斑；表面色泽是否色泽均匀；组织是否细腻、有弹性、气孔均匀、纹理清晰，呈海绵状，切片后不断裂；滋味与口感是否具有发酵和烘烤后的面包香味、松软适口、无异味；正常视力是否有可见杂质；
[0104]
硬度测试方法：采用自制面包切片器配合面包刀进行面包切片，每个面包样品先切除一端的两片12.5mm的面包片，然后切出3片25mm厚的面包片作为测试样品，面包片样品依次放置在质构测试仪的测试平台上，并使面包片样品中部与st-z16全自动质构仪探头中心对准即可进行质构测试；测试条件设定：测试模式：压缩模式；触发力：5g；测试前速度：60mm/min；测试速度：100mm/min；测试后速度：120mm/min；目标模式：形变50％。
[0105]
水分测试方法：使用卤素水分仪，用镊子将面包撕成碎片，取4g左右面包碎均匀铺在样品盘上，设置好合适的温度后盖下上盖，按下“start”键开始测试；蜂鸣两声后，仪器自动停机，测试结束。
[0106]
2实验结果
[0107]
由图1可知，烘烤完成后，处理组中面包体积较大，形态完整、无焦斑；表面色泽均匀；组织有弹性、纹理清晰，切片后不断裂；酸感适中，无杂味，发酵味及香气浓郁，麦香味浓郁。处理组的面包与对照组的面包组织状态及口感无明显差别。说明添加益生菌组合物不影响面包烘焙的组织状态及口感。于25℃放置7d、12d时，添加了益生菌组合物面包表面无霉变斑点，表明实施例1制备的益生菌组合物具有防止食品腐败的作用。
[0108]
由表4可知，烘焙完成时及25℃放置1d、3d、5d、7d时，添加了益生菌组合物的面包硬度低于对照组，水分含量高于对照组，表明实施例1制备的益生菌组合物可提供更松软的质构特性以及更高的保水能力，为面包在货架期内品质稳定提供支持。
[0109]
由表5可知，面包于25℃放置15d时，对照组的霉菌及酵母菌落数均高于后生元组，表明实施例1制备的益生菌组合物可有效减缓食品腐败速率，使食品延长货架期。
[0110]
表4益生菌组合物对面食制品贮藏期间面包硬度和水分的影响
[0111][0112]
表5不同组面包的菌落数量
[0113]
组别霉菌(cfu/g)酵母菌(cfu/g)对照组1032
±
86a875
±
78b处理组450
±
46b625
±
30c[0114]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，其特征在于，所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25279。2.一株副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26528。3.一种益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物的成分包含权利要求1所述植物乳杆菌的活菌、灭活菌体和/或代谢产物；和/或，权利要求2所述副干酪乳酪杆菌的活菌、灭活菌体和/或代谢产物。4.如权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物的成分包含权利要求1所述植物乳杆菌的灭活菌体和代谢产物；和/或，权利要求2所述副干酪乳酪杆菌的灭活菌体和代谢产物。5.如权利要求3或4所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物的制备方法为：将权利要求1所述植物乳杆菌和/或权利要求2所述副干酪乳酪杆菌的活菌接种至发酵培养基中进行培养，得到发酵液；将发酵液进行后处理，得到益生菌组合物。6.如权利要求3～5任一项所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物的制备方法为：将权利要求1所述植物乳杆菌和/或权利要求2所述副干酪乳酪杆菌的活菌接种至发酵培养基中，于30～38℃下培养至ph为4.4～4.6，得到发酵液；将发酵液经杀菌灭活后进行干燥，得到益生菌组合物。7.如权利要求5或6所述的益生菌组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌和/或副干酪乳酪杆菌的活菌在发酵培养基中的接种量为1
×
106～5
×
106cfu/g。8.一种制备权利要求3～7任一项所述的益生菌组合物的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述植物乳杆菌和/或权利要求2所述副干酪乳酪杆菌的活菌接种至发酵培养基中进行培养，得到发酵液；将发酵液进行后处理，得到益生菌组合物。9.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的副干酪乳酪杆菌或权利要求3～7任一项所述的益生菌组合物在制备产品中的应用。10.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述的植物乳杆菌、权利要求2所述的副干酪乳酪杆菌或权利要求3～7任一项所述的益生菌组合物。

技术总结
本发明涉及用于防腐保鲜的益生菌及其组合物，属于生物技术领域。本发明提供了植物乳杆菌LP-301(保藏编号为CGMCC No.25279)和副干酪乳酪杆菌ProSci-101(保藏编号为CGMCC No.26528)。植物乳杆菌LP-301和副干酪乳酪杆菌ProSci-101能抑制荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和单核细胞增生李斯特菌等致病菌和腐败菌的生长，能防止鱼肉等蛋白质含量高的食品亚硝酸盐和挥发性盐基氮含量过高，并且，能防止鱼肉等蛋白质含量高的食品生物胺含量过高，可见，植物乳杆菌LP-301和副干酪乳酪杆菌ProSci-101可防腐保鲜。101可防腐保鲜。101可防腐保鲜。


技术研发人员：包维臣 刘晓军 张建军
受保护的技术使用者：北京科拓恒通生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/9