一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物技术与材料领域，具体涉及一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤一直是人类健康与寿命的最大威胁。虽然大部分恶性肿瘤早期可以通过手术切除得到治疗，5年生存率达95％以上。然而患者往往到达晚期才被发现，已错失手术时机，长期生存率和预后急剧下降。因此，对于恶性肿瘤的早期诊断和治疗十分重要。
3.近年来，近红外荧光染料因其背景干扰少、组织穿透深、图像灵敏度高等优良的光物理特性而成为主要的生物成像试剂，如已被美国食品药品监督管理局(fda)批准的吲哚菁绿(icg)和目前研究较多的ir-780、ir-820、ir-808等。然而，不同的化学偶联可能会改变靶向配体结构、荧光成像能力以及治疗潜力。因此申请人在前期研究中通过将ir-808与胆碱进行偶联成功合成了一种新型近红外荧光染料ir817，ir817不仅具有良好的靶向抗肿瘤能力，并且荧光成像效果也很强(sunc,wangj,xiat,sunq,hey,wangh,etal.mitochondrion-targetednirtherapeuticagentsuppressesmelanomabyinducingapoptosisand cellcyclearrestviae2f/cyclin/cdkpathway.pharmaceuticals(basel).2022；15.)。然而，由于ir817具有水溶性差，成像时间短、聚集猝灭效应以及急性毒性(高剂量)等一些问题，我们迫切想要找到新的方法来改进ir817，以便其能在肿瘤诊断治疗领域中有更好的应用前景。
4.白蛋白具有良好生物相容性、无毒性、易于生产以及在体内有良好的稳定性，多年来一直作为一种多功能的药物递送纳米载体被广泛开发。如将白蛋白与小分子染料化合物结合，通过共价偶联和超分子包封的相互作用可以产生动态稳定的染料，同时避免分子染料的聚集，减少了自猝灭问题。值得注意的是，通过将染料限制在白蛋白的疏水口袋中，既显著提高白蛋白-染料探针的亮度，并且在降低毒性的同时也大大提高了染料的溶解性和生物相容性。
5.近年来，基于蛋白质光热疗法的发展也是受到越来越多研究者的关注。光热疗法是通过采用光热剂在激光照射下加热病灶区域进行局部热消融而达到治疗目的，它同时具有高特异性和微创性的优点。理想的光热剂应在近红外窗口具有较强的吸光度，使吸收的光能有效地转化为热而不是荧光发射。因此，将白蛋白与ir817结合制备成一种新的纳米粒并探究其在光热治疗中的疗效是非常有研究意义的。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒及其制备方法和应用，具体的，公开了一种白蛋白与新型近红外染料ir817共价结合成纳米粒后在肿瘤中的成像诊断及光热治疗中的应用。白蛋白-ir817纳米粒使用牛血清白蛋白作为载体，将ir817通过疏水作用力吸附于载体之中，从而形成分散均一、结构稳定的纳米
e2f/cyclin/cdkpathway.pharmaceuticals(basel).2022；15.)，本发明优先采用如下方法：
22.以ir-808与二环己基碳二亚胺为原料，一起溶解在n,n-二甲基甲酰胺中。以二氯甲烷/甲醇作为溶剂，用薄层色谱法检测。反应完成后用二氯甲烷提取。有机相采用减压旋转蒸发浓缩，以二氯甲烷/甲醇为洗脱溶剂，用硅胶柱纯化，减压浓缩后即可收集目标产物ir817。
23.上述技术方案中ir-808与二环己基碳二亚胺的摩尔比列1:4。
24.上述技术方案中二氯甲烷与甲醇的比列为10:1。
25.本发明将新型七甲川花菁类有机小分子衍生物ir817装载到牛血清白蛋白(bsa)上，得到bsa-ir817纳米粒。bsa-ir817极大的提高了ir817在近红外区的吸收光谱以及荧光发射光谱，无论在体内外荧光强度均明显强于ir817，是一种非常良好的生物成像试剂。在用激光808照射含有bsa-ir817的溶液后，其温度最高可上升至52.6℃，这个温度足以杀死肿瘤细胞。因此，bsa-ir817纳米粒也是一种理想的光热试剂。因此，本发明还公开了上述bsa-ir817纳米粒在肿瘤成像与光热治疗中的应用。
26.本发明中，虽然ir817本身已然是一种良好的诊断治疗试剂，但在它兼具花菁类染料优点的同时也不可避免的存在很多缺点，如生物相容性差，体循环时间短、肿瘤蓄积低，聚集猝灭效应以及毒副作用等。因此，为了改善ir817的性质，我们将牛血清白蛋白作为载体合成bsa-ir817纳米粒。牛血清白蛋在提高了ir817溶解性的同时也极大提高其荧光强度，使其在近红外区有很好的吸收和发射峰。这样的性质使得bsa-ir817不仅可以通过活体成像技术实现生物体成像，实时检测肿瘤发生的部位，并且结合激光808照射能有效将光能转换为热能而起到良好光热治疗作用。值得注意的是，牛血清白蛋白的包裹也极大降低了ir817的毒性，使得bsa-ir817生物安全性更高。
27.本发明的有益效果为：
28.1、通过将牛血清白蛋白作为载体解决了近红外荧光染料ir817水溶性差、体内循环时间短，荧光聚集猝灭、毒副作用大等问题，极大地提高了其进一步应用的潜能；
29.2、通过牛血清白蛋白与ir817的共价结合使得其在近红外区具有较强的吸光峰值，激光808照射可以使吸收的光能有效地转化为热能，从而可以作为一种新型理想的光热治疗试剂。
附图说明
30.图1为本发明实施例bsa-ir817、ir817的吸收光谱图；
31.图2为本发明实施例bsa-ir817、ir817的荧光发射光谱图；
32.图3为本发明实施例不同浓度的ir817的荧光强度相对比柱状图；
33.图4为本发明实施例不同浓度的bsa-ir817的荧光强度相对比柱状图；
34.图5为本发明实施例bsa-ir817的粒径扫描电子显微镜(sem)图；
35.图6为bsa与bsa-ir817的粒径分布图；
36.图7为本发明实施例bsa-ir817、ir817的zata电位绝对值对比图；
37.图8为本发明实施例bsa-ir817粒径随时间变化的曲线图。
38.图9为本发明实施例bsa-ir817、ir817的体外荧光强度对比图；
39.图10为本发明实施例bsa-ir817、ir817的细胞摄取能力对比图；
40.图11为本发明实施例bsa-ir817、ir817的肿瘤蓄积成像能力对比图；
41.图12为本发明实施例bsa-ir817、ir817在肿瘤部位的荧光信号相对强度随时间变化的曲线图；
42.图13为本发明实施例bsa-ir817、ir817在体外使用激光808(功率为1w/cm2)照射不同时间后温度变化曲线图；
43.图14为本发明实施例不同浓度bsa-ir817在激光808(功率为1w/cm2)照射后的温度变化曲线图；
44.图15为本发明实施例bsa-ir817、ir817在体内使用激光808(功率为1w/cm2)照射5min后红外热成像对比图；
45.图16为本发明实施例bsa-ir817、ir817在体内使用激光808(功率为1w/cm2)照射不同时间后温度变化曲线图；
46.图17为本发明实施例不同浓度的bsa-ir817对于a375、b16-f10黑色素瘤细胞活性影响的柱状图；
47.图18为本发明实施例不同浓度的bsa-ir817光照后对于a375、b16-f10黑色素瘤细胞活性影响的柱状图；
48.图19为本发明实施例不同处理组小鼠肿瘤实体图；
49.图20为本发明实施例不同处理组小鼠肿瘤生长曲线图；
50.图21为本发明实施例不同处理组小鼠肿瘤重量统计图；
51.图22为本发明实施例不同处理组小鼠体重对比图；
52.图23为本发明实施例不同处理组小鼠存活率对比图；
53.图24为本发明实施例不同浓度的bsa-ir817的溶血率图。
具体实施方式
54.下面结合附图对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
55.实施例1：制备牛血清白蛋白装载近红外荧光染料的bsa-ir817纳米粒。
56.以牛血清白蛋白bsa为载体，通过疏水作用将ir-817吸附到bsa中，形成bsa-ir817。
57.具体包括以下步骤：
58.1、合成一定量的近红外荧光染料ir817，其制备方法如下：
59.将ir-808(764mg,1mm)和二环己基碳二亚胺(824mg,4mm)溶解在n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，在室温下搅拌24h。以二氯甲烷/甲醇的比例为10:1作为溶剂，用薄层色谱法检测。反应完成后，用氯化钠饱和水溶液淬火，洗涤两次，并用二氯甲烷提取。有机相采用减压旋转蒸发浓缩，以二氯甲烷/甲醇为洗脱溶剂，用硅胶柱纯化。减压浓缩后收集目标产物ir817(0.95g,81％)。
60.2、合成bsa-ir817，其制备方法如下：
61.(a)称取10mg的近红外荧光染料ir817溶于425μl二甲亚砜中充分溶解后得到ir817储液，于4℃避光保存。称取198mg的牛血清白蛋白bsa溶于100ml的磷酸盐缓冲溶液中，充分混匀。取50μl之前配制好的ir817储液加到上述100ml白蛋白磷酸盐缓冲溶液中。混
匀后置于恒温水浴振荡器中避光振荡2小时，温度设置为60℃。
62.(b)剪取适量长度的透析袋，用去离子水清洗其内外表面后，将避光振荡加热好的上述混合液转移至透析袋中于去离子水中避光透析24-36小时，期间更换2-3次去离子水。透析完成后先将溶液收集回离心管中进行高速离心(13000rpm，10分钟)，然后取上清液体于冻干杯中(注意液面高度尽量保持在1cm内)置于-20℃过夜。
63.(c)次日将上述冻干杯放置冻干机中冻干40小时得到bsa-ir817冻干粉末。最后将bsa-ir817粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中，混匀得到bsa-ir817储液，4℃避光保存。通过动态光散射、zata电位，紫外吸收、荧光发射等进行基本特性的表征。
64.图1和图2为上述bsa-ir817、ir817以相同浓度(10μm)分别溶解在pbs中以及ir817直接与bsa溶液混合的吸收和荧光发射光谱图。如图1和图2所示，bsa-ir817、ir817吸收发射峰值均在近红外波长范围内，但由于ir-817本身水溶性差以及聚集猝灭等原因，其荧光强度明显低于bsa-ir817。并且只是将ir817与bsa简单混合并不能显著提高其性质，还需要进一步制备成纳米粒后才能完全凸显其优势所在。总之bsa与ir-817制备成纳米粒后极大提高了ir-817的光学吸收和荧光发射，有助于其在成像诊断和光热治疗中的进一步应用。
65.实施例2：bsa-ir817有效改善了ir-817聚集猝灭效应
66.分别将不同浓度的bsa-ir817或ir817溶解于h2o中进行荧光发射光谱的检测，将0.31μmbsa-ir817的最大峰值所对应的荧光强度设定为“1”，其他浓度的荧光强度则为其相对比值，如图3和图4所示。从图3和图4中可以发现，当ir-817的浓度在5μm以下时，荧光强度随浓度增大而增大，但当浓度超过5μm，荧光则出现明显的降低，这是由于高浓度的ir-817在水中会发生聚集猝灭作用。而相对于bsa-ir817，不仅荧光强度强于ir-817，并且在高浓度下，其荧光依然在增加，结果表明bsa作为载体有效改善了ir-817荧光聚集猝灭效应。
67.实施例3：bsa-ir817纳米粒基本特性的表征
68.图5为bsa-ir817的粒径扫描电子显微镜(sem)图，图6为bsa与bsa-ir817的粒径分布图，从图5和图6中可以看出bsa与ir817结合可以形成均一分散的纳米粒，且粒径为120-220纳米，这样大小的纳米粒在肿瘤组织中可以产生较好的高渗透长滞留(epr)效应，利于纳米粒在肿瘤组织中发挥作用。zata电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量，其绝对值(正或负)越高，则表明体系越稳定。从图7和图8中可以看出，与bsa(-8.77
±
1.28mv)和ir-817(1.485
±
0.05mv)相比，bsa@ir-817的zata电位绝对值(-20.95
±
2.15mv)最大。并且连续监测12天bsa-ir817的粒径大小，发现并没有明显的变化。因此，以上结果表明bsa-ir817纳米粒非常稳定，利于在体内进一步研究。
69.实施例4：bsa-ir817与ir817在体内外的荧光对比
70.首先将10μmbsa-ir817和ir817于ep管内在近红外成像系统下拍摄近红外荧光图片，如图9所示，bsa-ir817的荧光强度明显强于ir817，为其6倍左右。接着，将bsa-ir817和ir817与b16-f10黑色素瘤细胞共同孵育不同时间(0.5，1，2，4，8，16小时)后，在倒置荧光显微镜下观察细胞摄取能力。如图10所示，bsa-ir817进入细胞约4小时后开始发出荧光，且在8小时荧光最强，强于ir817。虽然ir-817能够快速进入细胞，但在4小时后荧光开始明显下降，而bsa-ir817在16小时荧光仍无明显变化。结果表明，bsa-ir817同时提高了ir817在细胞中的荧光强度和荧光稳定性。最后在小鼠体内观察对比bsa-ir817和ir817的肿瘤蓄积成像能力。将bsa-ir817和ir817(5mg/kg)通过尾静脉注射到皮下接种b16-f10黑色素瘤的
ir817的两组小鼠体重与对照组无明显差异(如图22所示)，说明bsa-ir817生物安全性极高，极大减弱了ir-817的毒副作用。从记录18天的生长曲线中也发现，除了bsa-ir817+laser组小鼠仍然存活，其余组小鼠均在逐步死亡(如图23所示)。
79.实施例8：溶血实验评估bsa-ir817的生物相容性
80.取小鼠静脉血于抗凝管中，配制不同浓度bsa-ir817于ep管中，同时以pbs作为阴性对照，h2o为阳性对照。分别向其中加入20μl小鼠新鲜静脉血，混匀，静置24小时后，于离心机中以2000rpm离心5分钟后，取出ep管拍照。若离心后上清液体为红色则说明发生了溶血现象。最后吸取上清液体于96孔板中在酶标仪下检测542纳米处的吸光度。溶血率计算公式：
81.溶血率(％)＝[od(样本)-od(pbs组)]/[od(h2o)-od(pbs组)]
[0082]
如图24所示，bsa-ir817几乎不会导致溶血，说明了bsa-ir817具有较高的生物安全性。
[0083]
综上所述，本发明公开了一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒及其制备方法和应用，具体的，公开了一种白蛋白与新型近红外染料ir817共价结合成纳米粒后在肿瘤中的成像诊断及光热治疗中的应用。白蛋白-ir817纳米粒使用牛血清白蛋白作为载体，将ir817通过疏水作用力吸附于载体之中，从而形成分散均一、结构稳定的纳米粒，其粒径为120-220纳米。本发明不仅克服了ir817水溶性差，荧光聚集猝灭以及毒副作用等缺点，并且提高了其在近红外区的吸收光谱以及荧光发射光谱，在可见光范围内具有更强的荧光。同时，本发明在降低ir817毒性的同时结合激光808照射可以有效地将荧光转换为热能用于光热治疗。因此，这种白蛋白-ir817纳米粒在成像诊断和光热治疗中有极大的应用和推广潜力。
[0084]
至此，本领域技术人员认识到，虽然本文已详尽展示和描述了本发明的实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导符合本发明原理的许多其他变形或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变形或修改。

技术特征：
1.一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒，其特征在于，所述纳米粒包括牛血清白蛋白和近红外荧光染料ir817，其中，牛血清白蛋白作为近红外荧光染料ir817的载体，ir817通过疏水作用力吸附于牛血清白蛋白载体之中，形成所述白蛋白-近红外荧光染料纳米粒；所述牛血清白蛋白与ir817的摩尔比为1-3：1；所述牛血清白蛋白的分子量为60-70kda；所述ir817的分子量是1176.9da；所述白蛋白-ir817纳米粒的粒径为120-220纳米；所述ir817的结构式为：2.一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤s1：将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中得到牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液，将ir817粉末溶于二甲亚砜溶液得到ir817的储液；步骤s2：将步骤s1中制备的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液与ir817储液振荡混匀后，移至透析袋中透析，离心取上清液，放置于冻干杯中过夜；步骤s3：步骤s2中得到的混合物次日置于冻干机中冻干即得到白蛋白-ir817纳米粒冻干粉。3.如权利要求1所述的一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒制备方法，其特征在于，所述步骤s1中牛血清白蛋白与ir817的摩尔比为1-3：1。4.如权利要求1所述的一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒制备方法，其特征在于，所述步骤s2中牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液溶液与ir817溶液振荡混匀后在60℃水浴恒温振荡器中避光振荡2-4小时。5.如权利要求1所述的一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒制备方法，其特征在于，所述步骤s2中透析袋截留分子量为2.0kmwco，透析液为去离子水，透析时间为24-36小时。6.如权利要求1所述的一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒制备方法，其特征在于，所述步骤s2中放置于冻干杯中-20℃过夜。7.如权利要求1所述的一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒制备方法，其特征在于，所述步骤s3中置于冻干机中冻干20-40小时即得到白蛋白-ir817纳米粒冻干粉。8.如权利要求2-7中任意一项制备方法制备的白蛋白-近红外荧光染料纳米粒在制备用于肿瘤成像诊断和/或肿瘤光热治疗的药物中的应用。9.如权利要求8所述的一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。

技术总结
本发明公开了一种白蛋白-近红外荧光染料纳米粒及其制备方法和应用，具体的，公开了一种白蛋白与新型近红外染料IR817共价结合成纳米粒后在肿瘤中的成像诊断及光热治疗中的应用。白蛋白-IR817纳米粒使用牛血清白蛋白作为载体，将IR817通过疏水作用力吸附于载体之中，从而形成分散均一、结构稳定的纳米粒，其粒径为120-220纳米。本发明不仅克服了IR817水溶性差，荧光聚集猝灭以及毒副作用等缺点，并且提高了其在近红外区的吸收以及荧光发射峰值，在可见光范围内具有更强的荧光。同时，本发明在降低IR817毒性的同时结合激光808照射可以有效地将光能转换为热能用于光热治疗。因此，这种白蛋白-IR817纳米粒在成像诊断和光热治疗中有极大的应用和推广潜力。中有极大的应用和推广潜力。中有极大的应用和推广潜力。


技术研发人员：刘利 孙长侦 王佳女 熊霞 何渊民
受保护的技术使用者：西南医科大学附属医院
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/9