用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒的制作方法

1.本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒。


背景技术：

2.宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，位居女性恶性肿瘤第二位，严重危害女性生命健康。目前宫颈癌的筛查包括宫颈细胞学检测及人类乳头状瘤病毒(hpv)检测。细胞学检测包括巴氏涂片和tct液基细胞压片。tct相较于巴氏涂片更易于发现异常细胞，敏感性较高，但价格相对较高，且诊断水平受医师主观因素影响较大。
3.hpv dna检测相比细胞学检测，能够对高危型和低危型进行分型和定量检测，但是》80％的妇女一生中都会感染hpv，90％以上的感染者体内的病毒在两年内自动清除，hpv dna检测产生大量的假阳性(特异度低)。
4.宫颈上皮内瘤变(cin)是宫颈癌前病变的阶段，随病变程度加重，癌变几率升高。即使对于同一级别癌前病变个体，癌症风险也存在差别。宫颈上皮内病变可分为轻度非典型增生(cin1)、中度非典型增生(cin2)与重度非典型增生及原位癌(cin3/cis)；cin1也称为宫颈低级别病变(lsil),对应的宫颈高级别病变(hsil)包含cin2与cin3/cis；cin的转化性病变(cin2与cin3)反映一种异质性疾病；表观遗传学研究表明宫颈癌发展过程伴随着局部基因甲基化异常，基因甲基化改变可以区分早期和晚期宫颈cin转化病变，可用于宫颈癌筛查诊断和宫颈癌前病变管理。一项使用全基因组甲基化途径的前期研究确定了具有最高联合诊断准确性的三个甲基化组(j am3/ankr d1 8c p、c1 3or f1 8/j am3/ankr d1 8c p和j am3/g fr a1/ankrd18cp)，用于检测宫颈样品中的cin2+；并且敏感性分别被报告为72％、74％和73％，且相应特异性分别为79％、76％和77％。上海捷诺开发的宫颈癌早期检测产品，同时检测6个基因人astn1、dlx1、itga4、rxfp3、sox17、znf671的甲基化情况，能够得到较高的灵敏度和特异性数据，然而检测基因数量的增加必然会大大提高产品的检测难度和成本。对于一个筛查产品，需要面对大量的客户，成本的提升是一个阻碍成品推广的重大影响因素。
5.因此，需要确定新的dna甲基化生物标志物，用于针对宫颈癌的早期检测和易感性全群体筛查明显健康的女性，且用于具有癌前病变的女性的风险评估。同时对靶基因的选择必须做到少而精，经过大量的筛选，找出与宫颈癌相关性最高的目标基因，保证在成本可控的前提下，达到高的准确度。


技术实现要素：

6.为了获得与宫颈癌相关性较高的甲基化生物标志物，保证在成本可控的前提下，实现更加精准和有效的宫颈高级别病变及宫颈癌早期检测，本发明提供了一种用于宫颈癌早期检测的甲基化基因组合、引物和探针、试剂盒及相关方法。
7.本发明将alk和epb的双基因组合作为非疾病诊断目的检测宫颈癌和风险预测的甲基化生物标志物，利用检测alk基因甲基化、epb基因甲基化的特异性引物探针，以重亚硫酸盐转化处理后的宫颈脱落细胞dna为模板，采用实时荧光定量pcr扩增试剂检测alk基因和epb基因甲基化，通过读取荧光检测ct值，对待检样本进行判定，当待检样本判定为阳性，提示有宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险高；反之，当待检样本判定为阴性，表示宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险低。适用于女性宫颈癌的早期检测和辅助诊断。
8.本发明具体技术方案如下：
9.本发明的目的在于提供一种alk和epb的基因组合作为非疾病诊断目的的宫颈癌早期检测和风险预测相关的甲基化生物标志物的用途。
10.红细胞膜蛋白配体4.1样3(epb41l3)epb基因(gene id：23136)是4.1蛋白家族中一个新发现的抑癌基因,具有抑制肿瘤细胞生长的功能。
11.间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，alk)基因(gene id:238)编码一种受体酪氨酸激酶(eceptor tyrosine kinase,rtk)，为跨膜蛋白，属于胰岛素受体超家族，在大脑发育与及特定的神经元中起重要作用。最初在间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma,alcl)发现alk-npm1融合蛋白，目前已在其它肿瘤中包括神经母细胞瘤和非小细胞肺癌，发现该基因出现突变、扩增或者重排，其中染色体重排最为常见，导致alk与其他基因产生融合，包括alk(2号染色体)/eml4(2号染色体)，alk/ranbp2(2号染色体)，alk/atic(2号染色体)，alk/tfg(3号染色体)，alk/npm1(5号染色体)，alk/sqstm1(5号染色体)，alk/kif5b(10号染色体)，alk/cltc(17号染色体)，alk/tpm4(19号染色体)，和alk/msn(x染色体)。
12.本发明还提供了一种检测宫颈癌相关基因甲基化的物质在宫颈癌早期检测和风险预测中的用途，所述检测宫颈癌相关基因甲基化的物质为检测alk和epb基因甲基化的引物和探针。
13.本发明还提供了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物和探针组合，所述引物和探针用于检测alk和epb的基因组合；所述引物和探针组合包括alk探针p、alk正向引物f、alk反向引物r、epb探针p、epb正向引物f、epb反向引物r；所述alk探针p的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述alk正向引物f的核苷酸序列选自seq id no：2、seq id no：3中的任意一种；所述alk反向引物r的核苷酸序列选自seq id no：4、seq id no：5中的任意一种；所述epb探针p的核苷酸序列如seq id no：6所示；所述epb正向引物f的核苷酸序列如seq id no：7所示；所述epb反向引物r的核苷酸序列选自seq id no：8～seq id no：11中的任意一种。
14.在其中一个实施例中，所述alk正向引物f、反向引物r的核苷酸序列分别如seq id no：2、seq id no：4所示；所述epb正向引物f、反向引物r的核苷酸序列分别如seq id no：7、seq id no：8所示。
15.在其中一个实施例中，所述alk探针p、epb探针p的5’端均连接有荧光报告基团，且所述alk探针p、epb探针p的荧光报告基团互不相同，所述alk探针p、epb探针p的3’端均连接有荧光淬灭基团。
16.在其中一个实施例中，所述荧光报告基团选自fam、joe、vic、hex、rox、cy3或cy5，所述荧光淬灭基团选自bhq、tamra或mgb。
17.本发明还提供了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒，包括上述的引物和探针组合、act正向引物f、act反向引物r和act探针p；所述act正向引物f、act反向引物r和探针p的核苷酸序列分别如seq id no：12～seq id no：14所示。
18.在其中一个实施例中，所述act正向引物f的核苷酸序列为act-f:aggaggtagggagtatatagg；act反向引物r的核苷酸序列为act-r:caaccaataaaacctactcctc；act探针p的核苷酸序列为act-p:accaccacccaacacacaataacaaacaca；其中，act-p 5’端荧光报告基团与alk探针p、epb探针p的荧光报告基团互不相同，3’端连接有荧光淬灭基团。
19.在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括10
×
pcr buffer，taq酶、dntps、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照，阳性对照品为宫颈癌组织dna，阴性对照品为无核酸酶水。
20.本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：1)提取待检样本dna；2)将所述待检样本dna经亚硫酸氢盐转化处理，得到转化后的dna；3)以所述转化后的dna为模板，利用上述引物和探针组合进行pcr扩增反应，得到荧光检测结果；4)利用所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当内参ct＜40，且内参和目标基因差值≥5，则判定样本为宫颈癌甲基化阴性；当内参ct＜40，且内参和目标基因差值＜5，则判定样本为宫颈癌甲基化阳性；当内参ct≥40，则判定样本不合格；alk和epb基因任何一个为阳性，则样本判断阳性；两个基因都为阴性，则样本判断阴性。
21.在其中一个实施例中，所述荧光定量pcr反应的条件为：95℃～96℃变性9min～11min；94℃～96℃变性14s～16s，59℃～61℃退火延伸39s～41s并收集荧光信号，50个循环。
22.本发明还提供了一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的系统，包含以下模块：1)dna提取模块，用以获得待检样本dna；2)dna转化模块，用以将所述待检样本dna经亚硫酸氢盐转化处理，得到转化后的dna；3)核酸扩增模块，用于以所述转化后的dna为模板，利用上述引物和探针组合进行pcr扩增反应，得到荧光检测结果；4)数据分析模块，用以利用所述荧光检测结果进行数据分析，对待检样本进行判定。
23.在其中一个实施例中，所述待检样本选自人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、尿液、宫颈组织、血浆、血清和血细胞中的一种或多种。
24.相对于现有技术，本发明的有益效果：
25.本发明选用了两个宫颈癌高度相关的alk基因和epb基因作为甲基化生物标志物，较少的基因组合，使研发和生产检测成本较低，并且同时能达到较高的检测率和良好的特异性。
26.按照目前的行业标准，cin2及以上级别的病变作为阳性病例，本发明的灵敏度为92.5﹪，特异性为94.3﹪。特别的，针对cin3病变级别的样本，灵敏度为100﹪，特异性为94.3﹪。适用于女性宫颈癌的早期检测和辅助诊断。
附图说明
27.图1为靶基因1阳性样本扩增曲线及结果判断示意图，其中，纵坐标表示荧光强度值，横坐标表示荧光定量pcr扩增的循环数；
28.图2为靶基因2阳性样本扩增曲线及结果判断示意图，其中，纵坐标表示荧光强度值，横坐标表示荧光定量pcr扩增的循环数；
29.图3为阴性样本扩增曲线及结果判断示意图，其中，纵坐标表示荧光强度值，横坐标表示荧光定量pcr扩增的循环数。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
31.本发明使用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
32.pcr仪器为linegene9600。
33.实施例一：宫颈癌细胞脱落样品dna提取及亚硫酸氢盐转化。
34.1.样本提取
35.样本保存于细胞保存液中，存于4度。使用上海力敏dna提取试剂盒(货号d3396-02)，按照试剂盒细胞提取步骤进行提取。
36.2.亚硫酸氢盐转化
37.将提取的dna样本按照以下步骤转化：
38.(1)取pcr管，加入20ul dna，100ul配制好的亚硫酸盐转化液，20ul
39.100mm的对苯二酚，98度10分钟，64度2.5小时。
40.(2)孵育好的dna转移至1.5ml ep管，加入250微升的dna结合液，混匀，转移至dna纯化柱中，13000转/分离心2分钟，弃废液后，再次13000转/分离心3分钟，弃废液。
41.(3)加500微升70％乙醇洗涤液，13000转/分离心2分钟，弃废液后13000转/分离心一分钟。
42.(4)加入300微升脱硫液，室温放置30分钟，13000转/分离心2分钟，弃废液。
43.(5)加500微升70％乙醇洗涤液，13000转/分离心2分钟，弃废液。
44.(6)加500微升70％乙醇洗涤液，13000转/分离心2分钟，弃废液。
45.13000转/分，离心3分钟。
46.(7)将纯化柱放入新1.5ml离心管，加入100微升1mm tris-edta，50℃孵育5min，13000转/分离心2分钟，得到样品。
47.实施例二：宫颈癌样本甲基化目标基因的荧光定量pcr扩增检测
48.1)按照如下表格配制10x buffer：
49.[0050][0051]
2)按照如下表格配制pcr反应体系：
[0052]
试剂体积(ul)pcr反应buffer5taq酶0.5dntp(10mm)1内参act探针0.5内参act引物1目标基因探针1目标基因引物2模板5无核酸酶水34总体积50
[0053]
3)pcr反应程序
[0054][0055]
4)检测结果判定
[0056]
判定方法：计算内参和目标基因ct差值，如果内参ct＜40，且内参和目标基因差值≥5，判断待检样本为阴性；若内参ct＜40，且内参和目标基因差值＜5，判断待检样本为阳性；若内参ct≥40，则样本不合格。alk和epb基因任何一个为阳性，判断待检样本为阳性；两个基因都为阴性，判断待检样本为阴性。
[0057]
实施例三：甲基化位点的选择、引物探针的设计筛选
[0058]
收集医院不同病理分期样本：其中，宫颈高级别病变(hsil)样本66例，宫颈低级别病变(lsil)样本83例。
[0059]
宫颈脱落细胞样品收集操作如下：
[0060]
医护人员先以窥阴器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。将宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转5圈以获得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部放入装有丽拓细胞保存液的样本管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，将刷头留在样本管中，旋紧管盖，做好样本标识，保存于4度。
[0061]
样本扩增测序：
[0062]
(1)按照实施例一完成样本的提取、转化；
[0063]
(2)在alk和epb基因启动子序列2000bp待测序列设计普通扩增引物对样本进行扩增。扩增产物进行一代sanger测序；
[0064]
(3)根据测序结果选择甲基化待测序列如下，序列中各个cg位点甲基化率如下表1所示：
[0065]
epb序列：
[0066][0067]
alk序列：
[0068][0069][0070]
表1为所选序列中甲基化率
[0071]
[0072]
[0073]
[0074][0075]
(4)分析hsil样本和lsil样本在所测序列中的每个cg位点的甲基化情况，对宫颈癌样本特异性甲基化位点设计引物探针，每个引物探针组合包含6-8个特异性甲基化cg位点；引物探针的核酸序列如下表2所示：
[0076]
表2为设计的引物探针及其核酸序列
[0077]
[0078]
[0079][0080]
使用上述探针引物按照实施例一和实施例二对20个正常样本和20个宫颈癌样本
完成提取，转化，检测，参照实施例2进行结果分析，筛选出最优探针引物组合，如下表3所示：
[0081]
表3为筛选的最优探针引物组合
[0082]
[0083][0084]
实施例四：医院临床病人样本检测
[0085]
收集医院不同病例分期样本：其中，正常样本18例，cin1 17例，cin2 31例，cin3 22例。宫颈脱落细胞样品收集操作如下：医护人员先以窥阴器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。将宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转5圈以获得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部放入装有丽拓细胞保存液的样本管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，将刷头留在样本管中，旋紧管盖，做好样本标识，保存于4度。
[0086]
样本检测：
[0087]
按照实施例一和实施例二完成样本的提取，转化和检测，参照实施例二进行结果分析，探针引物选用实施例三筛选的表2所示的最优组合。
[0088]
检测结果如下表4：其中，“+“为检测阳性；
”‑“
为检测阴性。
[0089]
表4为检测结果
[0090]
[0091]
[0092]
[0093][0094]
根据上述结果，统计分析如下表5所示：
[0095]
表5为统计分析结果
[0096][0097]
其中，cin1-(35例)包含正常(18)例和cin1(17例)，cin2+(53例)包含cin2(31例)和cin3(22例)。
[0098]
分析结论：由于cin1级别病变有较高的概率自愈，目前宫颈癌筛查样本的标准为cin2及以上病变作为阳性病例，从上述结果可得本发明单个探针引物组合检测的特异性在91％-97％之间，灵敏度在75％-85％之间。
[0099]
为进一步提高检测效率，通过对上述引物探针组合进行组合，期望以多重联检的
方式提高试剂盒的检测效果，共有如下表五中8个组合结果如表6所示，其中最优联检方案为组合(1和3)、组合(2和3)。
[0100]
表6为联合检测结果
[0101][0102]
针对最优联检方案组合(1和3)对检测结果进行统计分析，结果如下表7所示：
[0103]
表7为统计分析结果
[0104][0105]
分析结论：由于cin1级别病变有较高的概率自愈，目前宫颈癌筛查样本的标准为cin2及以上病变作为阳性病例，故该发明的灵敏度为92.5﹪，特异性为94.3﹪。特别的，针对cin3病变级别的样本，灵敏度为100﹪，特异性为94.3﹪。
[0106]
当待检样本判定为阳性，提示有宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险高；反之，当待检样本判定为阴性，表示宫颈高级别病变和/或进展宫颈癌风险低。适用于女性宫颈癌
的早期检测和辅助诊断。

技术特征：
1.alk和epb的基因组合作为非疾病诊断目的的宫颈癌早期检测和风险预测相关的甲基化生物标志物的用途。2.一种检测宫颈癌相关基因甲基化的物质在宫颈癌早期检测和风险预测中的用途，其特征在于：所述检测宫颈癌相关基因甲基化的物质为检测alk和epb基因甲基化的引物和探针。3.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针用于检测alk和epb的基因组合；所述引物和探针组合包括alk探针p、alk正向引物f、alk反向引物r、epb探针p、epb正向引物f、epb反向引物r；所述alk探针p的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述alk正向引物f的核苷酸序列选自seq id no：2、seq id no：3中的任意一种；所述alk反向引物r的核苷酸序列选自seq id no：4、seq id no：5中的任意一种；所述epb探针p的核苷酸序列如seq id no：6所示；所述epb正向引物f的核苷酸序列如seq id no：7所示；所述epb反向引物r的核苷酸序列选自seq id no：8～seq id no：11中的任意一种。4.根据权利要求3所述的引物和探针组合，其特征在于，所述alk正向引物f、反向引物r的核苷酸序列分别如seq id no：2、seq id no：4所示；所述epb正向引物f、反向引物r的核苷酸序列分别如seq id no：7、seq id no：8所示。5.根据权利要求3所述的引物和探针组合，其特征在于，所述alk探针p、epb探针p的5’端均连接有荧光报告基团，且所述alk探针p、epb探针p的荧光报告基团互不相同，所述alk探针p、epb探针p的3’端均连接有荧光淬灭基团。6.根据权利要求5所述的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自fam、joe、vic、hex、rox、cy3或cy5，所述荧光淬灭基团选自bhq、tamra或mgb。7.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3～6任一所述的引物和探针组合、act正向引物f、act反向引物r和act探针p；所述act正向引物f、act反向引物r和探针p的核苷酸序列分别如seq id no：12～seq id no：14所示。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10
×
pcr buffer，taq酶、dntps、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。9.一种如权利要求7或8任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待检样本dna；2)将所述待检样本dna经亚硫酸氢盐转化处理，得到转化后的dna；3)以所述转化后的dna为模板，利用如权利要求3～6任一所述的引物和探针组合进行pcr扩增反应，得到荧光检测结果；4)利用所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当内参ct＜40，且内参和目标基因差值≥5，则判定样本为宫颈癌甲基化阴性；当内参ct＜40，且内参和目标基因差值＜5，则判定样本为宫颈癌甲基化阳性；当内参ct≥40，则判定样本不合格；alk和epb基因任何一个为阳性，则样本判断阳性；两个基因都为阴性，则样本判断阴性。10.一种用于宫颈癌相关基因甲基化检测的系统，其特征在于，包含以下模块：1)dna提取模块，用以获得待检样本dna；2)dna转化模块，用以将所述待检样本dna经亚硫酸氢盐转化处理，得到转化后的dna；3)核酸扩增模块，用于以所述转化后的dna为模板，利用如权利要求3～6任一所述的引物和探针组合进行qpcr扩增反应，得到荧光检测结果；4)数据分析模块，用以利用所述荧光检测结果进行数据分析，对待检样本进行判定。
11.根据权利要求9或10任一所述的试剂盒的使用方法或系统，其特征在于，所述待检样本选自人宫颈脱落细胞、阴道分泌物、尿液、宫颈组织、血浆、血清和血细胞中的一种或多种。

技术总结
本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测和风险评估的生物标志物基因组合，包括ALK基因和EPB基因，同时公开了检测上述宫颈癌样本基因甲基化的引物和探针组合及试剂盒。本发明利用较少的基因组合，使研发和生产检测成本较低，同时能达到较高的检测率和良好的特异性。针对CIN2及以上级别的病变样本，本发明的灵敏度为92.5﹪，特异性为94.3﹪。特别的，针对CIN3病变级别的样本，灵敏度为100﹪，特异性为94.3﹪。适用于女性宫颈癌的早期检测和辅助诊断。断。断。


技术研发人员：雍学安
受保护的技术使用者：湖南省丽拓生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/9