基于单链DNA金纳米簇的荧光传感法检测维生素B1的方法与流程

基于单链dna金纳米簇的荧光传感法检测维生素b1的方法
技术领域
1.本发明涉及一种维生素b1检测方法，具体涉及一种基于单链dna金纳米簇的荧光传感法检测维生素b1的方法。属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.维生素b1(vitamin b1，vb1)，也称硫胺素，它通过一个亚甲基连接一个氨基嘧啶环和一个噻唑环，两个环上分别含有甲基和羟乙基的侧链。众所周知，vb1在乳制品中是一种必需的水溶性维生素和天然营养物，平均每日摄入量为0.5～1mg。它在生命系统中碳水化合物、氨基酸和脂质的代谢过程中起着至关重要的作用。此外，作为一种生物和药学上重要的化合物，vb1是维持心脏、神经和心血管系统正常功能的必需化合物。缺乏vb1会对人类造成许多有害的影响，最值得注意的是，缺乏vb1会导致脚气病wernicke-korsakoff综合征。因此，临床上vb1主要用于治疗脚气病和各种多发性神经炎。
3.目前，已开发出多种方法来测定vb1，如薄层色谱法、毛细管电泳法(ce)、高效液相色谱法(hplc)、分光光度法和荧光光谱法等。然而，复杂的仪器以及样品预处理常常限制了这些方法的应用，有些方法的测试也表现出了线性范围窄以及易受共存离子干扰的限制。因此，开发一种简便灵敏、低成本、高效率、有选择性的检测vb1的方法仍然很有意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种基于单链dna金纳米簇的荧光传感法检测维生素b1的方法，利用单链a30-ssdna为模板合成的金纳米簇作为荧光探针，基于vb1可以诱导荧光金纳米簇荧光猝灭，构建一种检测vb1的荧光传感方法。
5.为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
6.1、一种荧光探针的制备方法，先将dna溶液、柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液以及超纯水混合均匀，得到混合液，加热孵育，得到荧光金纳米簇溶液，即为所述的荧光探针；其中，所述dna溶液是将单链a30-ssdna溶于超纯水而得，单链a30-ssdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0007]5′‑
aaa aaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaa-3
′
，如seq id no.1所示，hplc纯化。
[0008]
优选的，dna溶液、柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液、超纯水的体积比为5：5：3：37，dna溶液、柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液的浓度分别为2μmol/l、50mmol/l(ph＝6.0)、1mmol/l。
[0009]
优选的，加热孵育的工艺条件为：90℃孵育30分钟。
[0010]
2、一种荧光探针，是通过前述制备方法得到的。
[0011]
3、上述一种荧光探针在维生素b1定量检测中的应用。
[0012]
4、上述一种荧光探针在维生素b1定量检测中的应用。
[0013]
5、基于单链dna金纳米簇的荧光传感法检测维生素b1的方法，向盛有前述荧光探针的离心管中加入vb1溶液，混合孵育，利用荧光分光光度计测定vb1溶液加入前后的荧光强度，进而确定溶液中vb1的含量。
[0014]
优选的，还向离心管中加入ph＝6.5的pb缓冲液(磷酸缓冲液)，vb1溶液、荧光探针、pb缓冲液的体积比为3：1：1，vb1溶液的浓度在0.01到1μmol/l的范围内。
[0015]
优选的，混合孵育的工艺条件为：室温(25℃)孵育10分钟。
[0016]
优选的，金纳米簇的荧光强度降低值与vb1的浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝437.16x+18.034，其中，x为vb1浓度，y为荧光强度降低值，线性回归系数r2为0.9935，检出限为3nmol/l。
[0017]
本发明的有益效果：
[0018]
本发明将单链a30-ssdna为模板的金纳米簇作为荧光探针，免标记、快速、高灵敏度、高特异性定量检测复杂体系中vb1含量。具体来说，以单链a30-ssdna模板合成的金纳米簇作为荧光探针，通过荧光强度变化特异性检测溶液中vb1含量。该方法简单、快速，检测线性范围宽，检出限低，具有较好的检测灵敏度和特异性，在食品、药品等方面具有很好的应用前景。具体如下：
[0019]
(1)合成的金纳米簇具有稳定的光学性质，合成方法简单、快速，成本低，合成材料荧光性能好。
[0020]
(2)利用合成的具有独特光学性能的金纳米簇作为荧光探针，高特异性传感检测vb1的含量，操作简单、快速，可以直接实现对vb1的特异性检测。
[0021]
金纳米簇作为一种新型的功能性纳米颗粒，由于其合成简单、光稳定性好以及在水溶液中具有良好的分散性，使其作为荧光探针在生物传感领域具有广阔的应用前景。本发明采用金纳米簇作为荧光探针，实现对溶液中vb1含量进行免标记、快速定量检测。
[0022]
荧光金属纳米分析方法具有操作简单、速度快、灵敏度高、选择性好等优点，已经引起了研究人员的广泛研究兴趣。
[0023]
(3)利用金纳米簇体系中加入vb1后，金纳米簇的荧光强度下降，该方法可以实现对vb1的定量检测，检测线性范围宽，检出限低。
[0024]
(4)本发明可以方便地对药品样品中的vb1含量进行检测。
附图说明
[0025]
图1是金纳米簇的制备示意图。
[0026]
图2是以单链a30-ssdna为模板合成的金纳米簇的荧光激发光谱和发射光谱图，表明最大激发波长为290nm，最大发射波长为475nm。
[0027]
图3是荧光金纳米簇荧光光谱图。
[0028]
图4是金纳米簇检测vb1反应体系的缓冲溶液不同ph值的优化图，缓冲液的ph值分别为：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。
[0029]
图5是金纳米簇检测vb1反应体系加入vb1不同孵育时间的优化图，孵育时间分别为：5、10、15、20、25min。
[0030]
图6是金纳米簇检测溶液中的vb1的线性图，线性范围0.01～1μmol/l，检出限为3nmol/l；其中，a为不同浓度vb1的发射光谱图，vb1的浓度分别为：0，0.01，0.03，0.05，0.08，0.25，0.4，0.6，0.8，1，2，4，5μmol/l；b为475nm处荧光强度与vb1浓度的校正曲线图。
[0031]
图7是金纳米簇检测溶液中的vb1的特异性分析实验结果图。
具体实施方式
[0032]
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0033]
本发明所用试剂均为分析纯，所用试剂及生产厂家如下：维生素、柠檬酸三钠二水合物、haucl4·
3h2o(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；磷酸缓冲液(pb，phosphate buffer)用于实验的全部过程，实验用水为超纯水(电导率＞18.25mω)。dna序列，a30-ssdna：5
′‑
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3
′
，hplc纯化，上海生工生物工程公司。
[0034]
实施例1
[0035]
如图1所示，以a30-ssdna为模板合成的金纳米簇的制备按照如下步骤进行：
[0036]
(1)50mmol/lph＝6.0柠檬酸钠溶液的配制：将0.1470g柠檬酸三钠二水合物用超纯水溶解，再用超纯水定容至10ml，调节ph至6.0后备用。
[0037]
(2)1mmol/l氯金酸溶液(haucl4)溶液的配制：将0.0039g四氯金酸三水合物用超纯水，再用超纯水定容至10ml，避光保存备用。
[0038]
(3)dna溶液的制备：将1od dna冻干粉用1375μl超纯水溶解成2μmol/l，充分混合均匀后备用。
[0039]
(4)金纳米簇的制备：将100μl dna溶液、100μl柠檬酸钠溶液、60μl氯金酸溶液以及混合，740μl超纯水混合均匀，使该体系溶液总体积为1000μl，然后将混合均匀的溶液置于90℃的恒温水浴锅中孵育30min，即制得荧光金纳米簇溶液，将制备好的荧光金纳米簇溶液置于4℃冰箱中保存备用。在荧光分光光度计上进行荧光激发光谱和发射光谱扫描(图2)，表明最大激发波长为290nm，最大发射波长为475nm。
[0040]
实施例2
[0041]
1、以a30-ssdna为模板合成的金纳米簇的制备参照实施例1；
[0042]
2、以金纳米簇作为荧光探针检测溶液中的vb1的可行性分析，其特征在于按照如下步骤进行：
[0043]
(1)vb1母液配置：将0.0033g维生素b1用超纯水溶解，再用超纯水定容至10ml，配制成1mmol/l的vb1母液备用。
[0044]
(2)取100μl荧光金纳米簇溶液利用荧光分光光度计测定其荧光强度，在激发波长为290nm的激发下进行发射光谱扫描，该探针在475nm处表现出较强发射。
[0045]
(3)向离心管中加入20μl荧光金纳米簇溶液、60μl 1μmol/l的vb1溶液和20μlpb缓冲液(ph＝6.5)，混合均匀后，在室温条件下反应10min，利用荧光分光光度计测定其荧光强度，此时的荧光强度明显降低，可以利用荧光发射光谱强度的降低值证明金纳米簇作为荧光探针检测vb1的可行性(图3)。
[0046]
实施例3
[0047]
1、以a30-ssdna为模板合成的金纳米簇的制备参照实施例1；
[0048]
2、以金纳米簇作为荧光探针检测vb1的反应体系中缓冲溶液ph值的优化，其特征在于按照如下步骤进行：
[0049]
(1)向离心管中加入20μl不同ph值的pb缓冲液(ph 6.0～8.0)、20μl荧光金纳米簇和60μl超纯水加入到100μl的反应体系中混合均匀，在室温条件下反应10min后，分别用荧
光分光光度计测定其荧光强度。实验结果表明(图4蓝色曲线)，在溶液ph为6.0至8.0的范围内，金纳米簇的荧光强度没有明显变化。
[0050]
(2)向离心管中加入20μl不同ph值的pb缓冲液(ph 6.0～8.0)、20μl荧光金纳米簇和60μl 1μmol/l的vb1样品加入到100μl的反应体系中混合均匀，在室温条件下反应10min后，分别用荧光分光光度计测定其荧光强度。实验结果表明(图4红色曲线)，荧光响应在ph 6.5时达到最低，这是由于vb1在碱性环境中不稳定，在ph》7时会分解。因此，选择ph＝6.5作为最佳缓冲溶液ph值。
[0051]
实施例4
[0052]
1、以a30-ssdna为模板合成的金纳米簇的制备参照实施例1；
[0053]
2、以金纳米簇作为荧光探针检测vb1的反应体系中vb1孵育时间的优化，其特征在于按照如下步骤进行：
[0054]
(1)向离心管中加入20μl荧光金纳米簇、20μl pb缓冲液(ph 6.5)和60μl超纯水加入到100μl的反应体系中混合均匀，在室温条件下反应5、10、15、20、25min后，分别用荧光分光光度计测定其荧光强度。实验结果表明(图5蓝色曲线)，时间对金纳米簇的荧光强度影响不大。
[0055]
(2)向离心管中加入20μl荧光金纳米簇、20μl pb缓冲液(ph 6.5)和60μl 1μmol/l的vb1样品加入到100μl的反应体系中混合均匀，在室温条件下反应5、10、15、20、25min后，分别用荧光分光光度计测定其荧光强度。实验结果表明(图5红色曲线)，金纳米簇荧光强度在孵育10min后基本不再变化，表明vb1诱导的金纳米簇荧光淬灭过程在10min内已完成，因此选10min为最佳孵育时间。
[0056]
实施例5
[0057]
1、以a30-ssdna为模板合成的金纳米簇的制备参照实施例1；
[0058]
2、以金纳米簇作为荧光探针检测溶液中的vb1的含量分析，其特征在于按照如下步骤进行：
[0059]
向离心管中加入60μl不同浓度的vb1样品、20μl荧光金纳米簇和20μl pb缓冲液(ph＝6.5)加入到100μl的反应体系中混合均匀，在室温条件下反应10min后，分别用荧光分光光度计测定其荧光强度。实验结果表明(图6，其中，a为不同浓度vb1的发射光谱图，b为475nm处荧光强度与vb1浓度的校正曲线图)，在vb1浓度为0.01～1μmol/l的线性范围内，金纳米簇的荧光强度降低值与vb1的浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝437.16x+18.034，线性回归系数r2为0.9935，检出限为3nmol/l。
[0060]
实施例6
[0061]
1、以a30-ssdna为模板合成的金纳米簇的制备参照实施例1；
[0062]
2、vb1溶液的配置参照实施例2；
[0063]
3、以金纳米簇作为荧光探针检测溶液中的vb1的特异性分析，其特征在于按照如下步骤进行：
[0064]
(1)维生素b3、维生素b6、维生素b
12
和维生素c溶液配制：
[0065]
(2)向离心管中加入60μl用于特异性分析的维生素b3等溶液、20μl荧光金纳米簇和20μl pb缓冲液(ph＝6.5)混合均匀，在室温条件下反应10min后，利用荧光分光光度计测定其荧光强度，此时加入vb1的荧光强度明显降低，加入其他化合物的荧光强度与空白对照
相比没有明显变化，证明金纳米簇作为荧光探针检测vb1的特异性很好(图7)。
[0066]
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
[0067]

技术特征：
1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，先将dna溶液、柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液以及超纯水混合均匀，得到混合液，加热孵育，得到荧光金纳米簇溶液，即为所述的荧光探针；其中，所述dna溶液是将单链a30-ssdna溶于超纯水而得，单链a30-ssdna的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，dna溶液、柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液、超纯水的体积比为5：5：3：37，dna溶液、柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液的浓度分别为2μmol/l、50mmol/l、1mmol/l。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，加热孵育的工艺条件为：90℃孵育30分钟。4.一种荧光探针，其特征在于，是通过权利要求1～3中任一项所述制备方法得到的。5.权利要求4所述一种荧光探针在维生素b1定量检测中的应用。6.基于单链dna金纳米簇的荧光传感法检测维生素b1的方法，其特征在于，向盛有权利要求4所述荧光探针的离心管中加入vb1溶液，混合孵育，利用荧光分光光度计测定vb1溶液加入前后的荧光强度，进而确定溶液中vb1的含量。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还向离心管中加入ph＝6.5的pb缓冲液，vb1溶液、荧光探针、pb缓冲液的体积比为3：1：1，vb1溶液的浓度在0.01到1μmol/l的范围内。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，混合孵育的工艺条件为：室温孵育10分钟。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，金纳米簇的荧光强度降低值与vb1的浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝437.16x+18.034，其中，x为vb1浓度，y为荧光强度降低值，线性回归系数r2为0.9935，检出限为3nmol/l。

技术总结
本发明公开了基于单链DNA金纳米簇的荧光传感法检测维生素B1的方法，将单链A30-ssDNA为模板的金纳米簇作为荧光探针，免标记、快速、高灵敏度、高特异性定量检测复杂体系中VB1含量。具体来说，以单链A30-ssDNA模板合成的金纳米簇作为荧光探针，通过荧光强度变化特异性检测溶液中VB1含量。该方法简单、快速，检测线性范围宽，检出限低，具有较好的检测灵敏度和特异性，在食品、药品等方面具有很好的应用前景。药品等方面具有很好的应用前景。药品等方面具有很好的应用前景。


技术研发人员：易姿 周金沙 邱志鹏 钟菲菲 汪辉 杨丽霞 曾希珂 黄小贝
受保护的技术使用者：长沙市食品药品检验所
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/9