负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法

1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法。


背景技术：

2.菟丝子来源于旋花科植物南方菟丝子或菟丝子的干燥成熟的种子，首载于汉代《神农本草经》，被列为上品，其性平，味辛、甘，归肝、肾、脾经，具有补肾益精、养肝明目、固精缩尿、安胎止泻等功效，主要化学成分菟丝子黄酮。目前已从菟丝子中分离出多种黄酮类化合物，以槲皮素、山奈酚为主，二者具有较高的抗氧化活性。菟丝子黄酮具有补肝肾、坚筋骨的功效，现代药理研究表明菟丝子黄酮通过介导去卵巢大鼠wnt-catenin信号通路并调节相关因子水平，增加骨密度，改善骨质疏松相关症状。
3.丝素蛋白是一种弱碱性纤维状蛋白，丝素蛋白的高度重复-gly-ala-gly-ala-gly-ser-修饰片段使其具有反平行β-折叠结构。丝素蛋白的高度定向和结晶结构使其在大多数溶剂（水、乙醇、稀酸、稀碱）具有很强的耐受性和稳定性。丝素蛋白由于具有良好的生物降解性、无毒、优异的人体亲和性和生物相容性的性能。目前已制成多种形态应用于可控药物递送、组织工程支架、植入式器件等生物医药领域。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于设计出载药的新型生物材料, 具有促进骨细胞生长、分化和增殖，同时具有药物长效释放和具有生物相容性的特点。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：方法步骤如下：步骤1：制备丝素蛋白溶液；步骤2：制备菟丝子黄酮-丝素蛋白涂层溶液：将菟丝子黄酮粉末溶解在乙醇中得到内层溶液，菟丝子黄酮溶液与丝素蛋白溶液二者质量比10:1均匀混合得到外层溶液；步骤3：首先将脱胶后蓬松的丝素蛋白3d纤维采用浸渍法浸入长效内层溶液中，浸渍1-3次，每次20分钟，且在每次浸渍完成后用去离子水进行冲洗烘干后，进行下一次浸渍；步骤4：功能外层溶液浸渍1次，时间60分钟，然后用去离子水进行冲洗并烘干；完成后得到菟丝子黄酮-丝素蛋白3d纳米纤维支架。
6.进一步，步骤1中丝素蛋白溶液制备方法是将脱胶后丝素蛋白纤维用去离子水冲洗多次，将洗净的丝素蛋白纤维置于烘箱烘干；称取烘干后的丝素蛋白纤维溶于100ml溴化锂溶液中，并在60℃烘箱中溶解4小时，将自然冷却后的蚕丝溶液倒入14000d的透析袋中在去离子水透析5天；最后使用离心机进行两次离心去除杂质，参数为5000rpm，25分钟得到澄清丝素蛋白溶液。
7.进一步，长效内层溶液具体是将菟丝子黄酮粉末溶解于乙醇且超声至完全溶解，
配制成不同浓度菟丝子黄酮溶液，溶液浓度范围为1-10mg/ml，得到长效内层溶液。
8.进一步，功能外层溶液具体是精确称取菟丝子黄酮粉末溶解于乙醇，超声至完全溶解；溶液浓度4mg/ml；使用饱和溴化锂溶液将丝素蛋白纤维溶解至7%（w/v）丝素蛋白溶液，将菟丝子黄酮溶液与丝素蛋白溶液二者质量比为10:1均匀混合得到功能外层溶液。
9.进一步，得到的纤维支架用于促进骨细胞生长分化和增殖以及骨的创伤修复。
10.所述制备方法得到的纤维支架敷料，是内层的菟丝子黄酮溶液涂层和外层的丝素蛋白与菟丝子黄酮混合溶液涂层形成的双涂层伤口敷料。
11.与现有技术相比，本发明具有以下优点：菟丝子黄酮药物丝素蛋白纤维具有促进骨创伤修复，延长药物的释放以及具有很好生物相容性；丝素蛋白载药纤维制备流程，制备工艺简单可控。菟丝子黄酮-丝素蛋白纤维可作为临床治疗骨的创伤修复敷料具有很好应用前景。
12.本发明以丝素蛋白纤维为载体，制备了丝素蛋白纤维负载菟丝子黄酮的敷料。丝素蛋白纤维负载菟丝子黄酮可能由于菟丝子黄酮溶于乙醇形成带正电荷的粒子，与丝素蛋白分子链上带负电荷的羧基经过静电作用，因此结合更加紧密。丝素蛋白外层可以延缓药物在丝素蛋白纤维支架的释放，使药物释放的速率与不同程度的骨伤口恢复速率进行匹配。
附图说明
13.图1 药物涂层支架。
14.图2丝素蛋白纤维sem形态学图像。
15.图3菟丝子黄酮标准曲线范围。
16.图4浓度梯度测试出波长510nm处的吸光度制得菟丝子黄酮药物释放率。
17.图5菟丝子黄酮对成骨细胞增殖的影响。
18.图6样品在培养过程中细胞生长荧光照片。
19.图7 菟丝子黄酮混合对照品hplc色谱图。
20.图8 涂层菟丝子黄酮hplc色谱图。
具体实施方式
21.下面结合附图对本发明做进一步的说明：本发明提供了一种内层菟丝子黄酮和外层丝素蛋白与菟丝子黄酮涂层的双涂层伤口敷料的制备方法，结构图如图1所示。内层是加大菟丝子黄酮在丝素蛋白纤维的载药量，使药物长效释放。外层采用丝素蛋白为基底的材料，制备成丝素蛋白/菟丝子黄酮，作用是提高丝素蛋白纤维的载药量使药物释放时间延长和提高生物相容性的作用，双重保障下加快了伤口的愈合。这种双涂层材料起到很好的互补协同作用，对于骨的伤口愈合具有很好的治疗效果。
22.如图1所示，负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，步骤如下：步骤1：丝素蛋白负载菟丝子黄酮的纤维的制备：首先将脱胶后丝素蛋白纤维用去离子水冲洗多次，将洗净的丝素蛋白纤维置于烘箱烘干。称取烘干后的丝素蛋白纤维溶于100ml溴化锂（libr,9.3m）溶液中，并在60℃烘箱
中溶解4小时（h）。将自然冷去后的蚕丝溶液倒入14000d的透析袋中在去离子水透析5天。最后使用离心机进行两次离心去除杂质，参数为5000rpm，25分钟得到澄清丝素蛋白溶液，置于4℃冰箱备用。
23.步骤2：菟丝子黄酮溶解在乙醇中得到内层溶液，菟丝子黄酮溶液与丝素蛋白溶液二者质量比10:1均匀混合得到外层溶液。
24.长效内层溶液具体是将菟丝子黄酮粉末溶解于乙醇且超声至完全溶解，配制成不同浓度菟丝子黄酮溶液，溶液浓度范围为4mg/ml，得到长效内层溶液。
25.功能外层溶液具体是精确称取菟丝子黄酮粉末溶解于乙醇，超声至完全溶解；溶液浓度4mg/ml；使用饱和溴化锂溶液将丝素蛋白纤维溶解成7%（w/v）丝素蛋白溶液，将菟丝子黄酮溶液与丝素蛋白溶液二者质量比为10:1均匀混合得到功能外层溶液。
26.步骤3：首先将脱胶后丝素蛋白纤维采用浸渍法浸入内层溶液中，浸渍2次每次20分钟，且在每次浸渍完成后用去离子水进行冲洗烘干后，进行下一次浸渍，外层溶液浸渍1次，时间60分钟，然后用去离子水进行冲洗并烘干，完成后得到菟丝子黄酮-丝素蛋白纤维敷料。
27.将经过以上工艺制备处理后3d纳米纤维支架贴在电镜图上进行喷金90s，用台式显微镜及对其形貌进行观察。
28.如图2可以看出丝素支架在涂层前整体较为光滑，经药物涂层后，可明显看出药物附着，经丝素蛋白溶液涂层使丝素支架表面形成一层光滑而均匀的保护膜，控制药物的释放同时更利于细胞附着在支架上。
29.精密吸取菟丝子黄酮对照品溶液1、2、4、6、8mg分别置10ml容量瓶中，各加入70%乙醇至5ml，分别加5%nano20.3ml，摇匀，放置6min,加入10%al(no3)30.3ml，摇匀后放置6min,加入4%naoh 4ml，加70%乙醇至刻度线，摇匀后放置15min。以相应溶剂为空白，照紫外-可见分光光度法。
30.测得菟丝子黄酮最大吸收波长510nm。以菟丝子黄酮浓度（c）为横坐标，吸光度（a）为纵坐标，绘制标准曲线，可得到菟丝子黄酮溶液的标准曲线。如图3所示，菟丝子黄酮标准曲线方程y=0.0542x+0.0004,相关系数r2为0.09948，说明菟丝子黄酮的浓度与吸光度线性关系较好，误差小。
31.将支架样品平均剪成5mg，放入装有磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，pbs）的离心管中，置于37℃烘箱振荡器中振荡，频率为100rad/分钟。在设定的时间点1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、168h将释放液析出200ul,继续进行释放，使用紫外分光光度仪测试吸出释放液的od值，代入上述标准曲线公式进行释放量计算。
32.利用紫外分光光度计测得菟丝子黄酮的标准曲线方程为y=0.0542x+0.0004,经计算得到载药丝素支架的药物释放曲线，如图4所示，菟丝子在不同涂层处理的丝素支架1mg/ml、4mg/ml和7mg/ml在24h内的释放率分别为43.52%、49.47%、45.07%，3个浓度梯度在24h内释放率接近，24-72h释药率分别达到71.42%、74.14%和75.34%，释药速率较快。72h后释药减慢。72h大部分药物已经释放。以上数据说明所制备菟丝子黄酮-丝素蛋白纳米纤维支架可负载小分子药物，并能达到缓慢释放和次第释放的目的。
33.菟丝子黄酮对成骨细胞增殖的影响：取1，3，5天的样品组和对照组，弃旧培养基，pbs冲洗一遍，取新的96孔板，每孔放
入一个样品并加入含有cck-8试剂的培养基100μl，放入细胞培养箱孵育30分钟后，避光条件下使用酶标仪测试96孔板中吸光度。cck-8细胞增值试剂主要成分是一种钠盐，将它溶到培养基后，cck-8与活细胞中的脱氢酶还原成一种黄色甲臜结晶，结晶的生成数量代表了活细胞的数量，可以用来检测活细胞的数量。黄色甲臜溶解在培养基后用酶标仪检测培养基在450nm波长处的吸光度，来确定评估丝素蛋白纤维支架的细胞数量。
34.对于丝素蛋白支架在细胞层面的生物安全性采用cck-8细胞增殖结果情况来进行评估。如图3-6所示，细胞增值率在1、3、5天都达到细胞存活率大于75%可视为细胞无细胞毒性。因此所有样品都可视为细胞无毒性。各组样品随着培养时间的延长细胞增殖率也不断上升，属于细胞增长的对数期，处于快速增殖的状态，3天达到104.8%，5天达到108.6%，具有促进细胞增殖的趋势。因此证明各组材料无细胞毒性。
35.用pbs将接种96孔板细胞清洗三次，分别用4%多聚甲醛固定液固定15min，之后用dapi染色液通透20min，pbs清洗三次，将稀释1000x鬼笔环肽孵育15min，使用倒置荧光显微镜进行捕捉图像。
36.细胞在植入物表面的初始粘附状态对于细胞相容性参数极为重要。细胞荧光染色结果是对成骨细胞（mc-3t3-e1）的持续培育过程中，将样品与细胞共培养使细胞粘附与样品表面，使用dapi和鬼笔环肽进行染色，而后在荧光显微镜进行细胞形态下观察。从而确定材料对于细胞生长状态的影响。如图6所示，大多数细胞呈梭型，表明图中大多数细胞发育正常。sf/tfsc组细胞形态大部分伸展为梭形，证明细胞发育状态良好。同时可见sf/tfsc平均密度明显大于sf组，证明细胞在涂层后的丝素支架有更好的生长环境。研究表明，涂层载药支架表现出优越的成纤维细胞生物安全性，细胞在丝素支架表面生长发育良好，增殖能力强。
37.称取菟丝子黄酮10mg，用色谱甲醇溶解，经0.45μm滤膜过滤，移入50ml容量瓶中，用甲醇定容。同时用甲醇配制含有紫云英苷、金丝桃苷、槲皮素、芦丁、山奈酚、异槲皮苷和异鼠李素，质量浓度分别为0.1006、0.1014、0.1018、0.1006、0.1064、0.1016、0.101mg/ml的混合对照品溶液。
38.得出色谱图，如图7、图8。
39.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：方法步骤如下：步骤1：制备丝素蛋白溶液；步骤2：制备菟丝子黄酮-丝素蛋白涂层溶液：将菟丝子黄酮粉末溶解在乙醇中得到内层溶液，菟丝子黄酮溶液与丝素蛋白溶液二者质量比10:1均匀混合得到外层溶液；步骤3：首先将脱胶后蓬松的丝素蛋白3d纤维采用浸渍法浸入内层溶液中，浸渍1-3次，每次20分钟，且在每次浸渍完成后用去离子水进行冲洗烘干后，进行下一次浸渍；步骤4：将步骤3样品浸入外层溶液中浸渍1次，时间60分钟，然后用去离子水进行冲洗并烘干；完成后得到菟丝子黄酮-丝素蛋白3d纳米纤维支架。2.根据权利要求1所述的负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤1中丝素蛋白溶液制备方法是将脱胶后丝素蛋白纤维用去离子水冲洗多次，将洗净的丝素蛋白纤维置于烘箱烘干；称取烘干后的丝素蛋白纤维溶于100ml溴化锂溶液中，并在60℃烘箱中溶解4小时，将自然冷却后的蚕丝溶液倒入14000d的透析袋中在去离子水透析5天；最后使用离心机进行两次离心去除杂质，参数为5000rpm，25分钟得到澄清丝素蛋白溶液。3.根据权利要求1所述的负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：长效内层溶液具体是将菟丝子黄酮粉末溶解于乙醇且超声至完全溶解，配制成不同浓度的菟丝子黄酮溶液，溶液浓度范围为1-10mg/ml，得到长效内层溶液。4.根据权利要求1所述的负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：功能外层溶液具体是称取菟丝子黄酮粉末溶解于乙醇，超声至完全溶解；溶液浓度4mg/ml；使用饱和溴化锂溶液将丝素蛋白纤维溶解成7%（w/v）丝素蛋白溶液，将菟丝子黄酮溶液与丝素蛋白溶液二者质量比为10:1均匀混合，得到功能外层溶液。5.根据权利要求1所述的负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：得到的纤维支架用于促进骨细胞生长分化和增殖以及骨的创伤修复。6.根据权利要求1所述的负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，其特征在于：所述制备方法得到的纤维支架敷料，是内层的菟丝子黄酮溶液涂层和外层的丝素蛋白与菟丝子黄酮混合溶液涂层形成的双涂层伤口敷料。

技术总结
本发明公开了负载菟丝子黄酮药物的丝素蛋白纤维支架的制备方法，将菟丝子黄酮粉末溶解在乙醇中得到内层溶液，菟丝子黄酮溶液与丝素蛋白溶液二者质量比为10:1均匀混合得到外层溶液。首先将脱胶后蓬松的丝素蛋白3D纤维采用浸渍法浸入内层液中，浸渍1-3次，每次20分钟，且在每次浸渍完成后用去离子水进行冲洗烘干后，进行下一次浸渍。内层涂层完毕烘干后，再进行外层的丝素蛋白药物混合溶液浸渍，浸渍1次，60分钟，然后用去离子水进行冲洗并烘干，得到菟丝子黄酮-丝素蛋白3D纳米纤维支架。本发明菟丝子黄酮-丝素蛋白纳米纤维支架可以促进骨细胞生长分化和增殖以及骨的创伤修复。骨细胞生长分化和增殖以及骨的创伤修复。骨细胞生长分化和增殖以及骨的创伤修复。


技术研发人员：秦昆明 徐华 郭溶 许富荣 高珣 沈金阳 董自波
受保护的技术使用者：江苏海洋大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/9