一株能在低温、常温和中高温下降解纤维素的菌株、腐熟剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一株能在低温、常温和中高温下降解纤维素的菌株、腐熟剂及其应用。


背景技术：

2.秸秆是农业生产的副产物，也是一种可再生的绿色生物资源，不仅可以作为农村居民的生活燃料、牲畜饲料和有机肥料，而且能被各种工业制造广泛利用。秸秆是土壤重要的营养来源，秸秆还田可将氮、磷、钾等微量元素归还土壤(潘剑玲等，2013；李秀英等，2005)，供农作物吸收再利用，可以作为农业生产中重要的肥料资源，具有广泛的应用价值。目前，秸秆的处理方式多采用秸秆还田。秸秆还田这种措施能有效改善土壤的理化性状，增加有机质和各种养分含量，减少土壤水分蒸发，提高土壤保水保肥能力，具有明显的增产效果；同时也以可减少化学肥料的投入量并降低成本以及避免秸秆焚烧造成的大气污染，改善和保护农业生态环境。因此，开展农作物秸秆的合理开发和利用，对于生态环境保护和农业增效都具有广范应用前景和重要意义。
3.我国秸秆资源丰富，其中以水稻、玉米和小麦等秸秆为主(陈昱等，2023)；秸秆还田也是我国目前秸秆资源有效利用的方式之一。秸秆还田前需要进行粉碎后再松耕，与土壤充分混合发挥其作用，这种方式一方面工作量大成本高，另一方面也对粮食造成一定的潜在风险，例如玉米秸杆中含有大量的幼虫卵和带病菌体，粉碎过程中很难清除，被埋入土壤后幼虫便很快成长，成为病虫害的一种隐患，此外，没有被分解腐烂完全的带有病菌的秸秆就会危害到农作物的幼苗根系，影响新苗的营养成分吸收；并且秸秆粉碎不达标也会造成秸秆埋入土壤后存在很大的空隙，使得种子出现空置、接触不到土壤等情况。近年来，由于农作物产量大幅提高、秸秆处理难度大以及利用成本高等原因，如何有效综合利用秸秆资源成为需要解决的一大难题。
4.农作物秸秆的化学组成成分包括纤维素、半纤维素、木质素、粗蛋白、脂肪、碳水化合物等易降解的物质，其中纤维素含量约为30-35％，半纤维素含量约为25-30％，木质素含量约为20-25％(安玉民等，2016)，纤维素是作物秸秆的重要组成部分。纤维素在自然界中主要以微纤维组成的结晶形状存在，由于其理化性质稳定，自然条件下难以被分解。秸秆中的纤维素具有不溶性的刚性结构，在自然界中存在的纤维素多半是以这种复杂结构存在，难以降解是导致秸秆资源利用率低的原因之一。
5.微生物预处理可以提高纤维素的降解率，微生物可以产生能够破坏木质素结构的酶，反应条件相对温和，反应效率高，相比其他方法具有成本低、污染小和可重复利用等优点。然而，微生物在低温下不易生长代谢，特别在气候寒冷的地区生长会受到抑制，当菌株处于不适合生长的温度下时，通常无法正常进行腐熟，纤维素类物质难以降解，导致堆肥启动缓慢或者失败。目前国内外的研究多数集中在常温降解纤维素的菌株，对于土壤中低温纤维素降解菌的研究很少。据资料显示，董雪丽等(2022)从腐化秸秆中分离出了一株在10
undae)ky325菌株以及所述菌株的突变菌株。所述“菌株的突变菌株”是指与本发明的seq id no.1所示的gh-1菌株16s rdna同源性≥95％，优选≥99％的同源性的菌株。并且，所述“菌株的突变菌株”具有在低温、常温和中高温的不同温度下降解纤维素的性能。
15.在另一个方面，本发明提供了一种腐熟菌剂，所述腐熟剂含有前述的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或前述水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325的培养物。
16.本发明的菌株可以制备为生物菌剂(例如液体菌剂或固体菌剂)的形式进行使用或运输。鉴于本发明的菌株具有在不同温度条件下降解纤维素的能力，因此其可以快速分解大分子有机物，腐熟有机物料，可以作为有机物料的腐熟剂。特别地，因为该菌株具有耐低温性能，也即在低温环境下具有较好的降解纤维素能力，因此，可用于制备低温腐熟剂，如低温状态下快速启动腐熟的秸秆腐熟剂。
17.进一步地，所述腐熟菌剂中可任选地包含常用的载体，例如固态载体或液态载体，例如草炭土、硅藻土、淀粉、碳酸钙等；或者植物油、矿物油和水等。
18.在一个优选实施方案中，所述腐熟菌剂剂所含水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325的总活菌数为0.2
×
10
8-2
×
10
10
cfu
·
ml-1
或0.2
×
10
8-2
×
10
10
cfu
·
g-1
。
19.现有腐熟生物菌剂产品中枯草芽孢杆菌为主要成分居多，性质比较单一，本发明的腐熟剂兼具多功能(除降解纤维素外，还具有解蛋白、解淀粉以及解脂功能)且适温范围广。
20.在另一个方面，本发明还提供了一种生物有机质降解菌肥，所述生物有机质降解菌肥以前述的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或前述的腐熟剂作为活性成分。
21.本发明的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或腐熟剂可以用于发酵有机肥，形成有机质降解菌肥。在利用本发明的水域微小杆菌ky325或腐熟剂进行腐熟的过程中，能够高效降解利用纤维素等有机质，增加肥料的肥效。
22.在另一个方面，本发明提供了前述的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或前述的腐熟剂在降解纤维素或产纤维素酶中的应用。
23.本发明提供了前述的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或前述的的腐熟剂在降解秸秆中的应用。
24.本发明的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325以及含有其的腐熟剂可用于降解纤维素以及用于降解含纤维素较多的农作物秸秆，提升农作物秸秆等物质中纤维素的利用率，通过微生物降解法处理纤维素具有绿色环保、方法简便、处理成本低等优点。
25.本发明的菌株或腐熟剂适用于在多种场景下降解纤维素或生产纤维素酶，例如包括但不限于降解羧甲基纤维素或生产羧甲基纤维素酶。
26.在一个实施方案中，所述降解秸秆的应用包括使用前述的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或前述的腐熟剂对秸秆进行堆肥发酵。
27.在一个实施方案中，所述降解的温度为3℃～40℃，优选为4℃-35℃。
28.在一个具体实施方案中，水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325以及含有其的腐熟剂可用于在低温下降解秸秆。
29.在一个实施方案中，前述任一项应用包括在低温、中温和/或中高温环境下进行降
解，所述低温环境的温度范围为3℃-20℃；优选地，所述低温环境为4℃-15℃。所述常温环境为20℃-32℃，所述中高温环境为32℃以上，如35℃及以上。
30.特别地，由于本发明的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325在较低温度下具有较强的纤维素降解能力，因此，可适用于低温地区(如寒冷地区)农作物秸秆的降解和促腐，丰富了低温地区秸秆还田的菌种资源类型，特别适用于北方地区温度低时秸秆的处理。
31.在本发明中所述秸秆或农作物秸秆包括单不限于玉米秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆等，对秸秆的降解广谱高效，可用于秸秆原位还田。此外，使用微生物菌剂进行秸秆降解，可以有效的解决秸秆还田和堆肥问题，促进土壤中的养分吸收，增加微生物的多样性，一定程度上能够促进农作物的增产增收。
32.此外，本发明的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或腐熟剂也可以用于降解其他农作物原料，例如豆粕、麦麸、椰子壳等，可用于制备和发酵饲料，提高饲料转化率。
33.在另一个方面，本发明提供了前述水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或前述的腐熟剂在以下一个或多个方面的应用：
34.(a)降解蛋白质；
35.(b)降解脂质；
36.(c)水解淀粉；
37.(d)制备有机肥；
38.(e)降解厨余生活垃圾。
39.本发明的菌株或含有其的腐熟剂由于兼具多种功能，除可用于降解含纤维素的物质外，还可以降解蛋白、水解淀粉以及降解脂类物质，因此，也可以用于降解含有纤维素、油脂、蛋白等难降解有机物的厨余垃圾或生活垃圾，促进厨余垃圾快速腐熟。厨余垃圾中的有机物通过微生物的代谢后，可进一步加工成肥料等产品。在一个实施方案中，将腐熟剂与厨余垃圾混合并进行好氧发酵来降解厨余垃圾。
40.进一步地，本发明的菌株或含有其的腐熟剂促进秸秆原料转化为生物可利用的还原糖，可以高效利用秸秆制备有机肥(如秸秆堆肥)，反应适应的条件范围广，易于制备。
41.在另一个方面，本发明提供了一种降解纤维素的方法，包括将含有纤维素的原料与前述的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)ky325或前述的腐熟剂混合培养，获得含降解产物的产品。
42.在一个实施方案中，所述方法包括在低温和/或常温环境环境下降解含有所述纤维素的原料，所述低温环境的温度范围为3℃-20℃，优选地，所述低温环境为4℃-15℃。
43.在本发明中，不对纤维素的类型做具体限定，可包括例如羧甲基纤维素钠、半纤维素和/或木质素等。
44.保藏信息：本发明提供的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)，菌株名为ky325，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所；保藏时间为：2023年03月21日，保藏编号gdmcc no.63287。经保藏中心于2023年03月21日检测为存活菌株。
45.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
46.(1)本发明的水域微小杆菌(exiguobacterium undae)菌株ky325是发明人通过大量筛选工作，首次筛选得到的一株在不同温度状态下均具有较强纤维素降解能力的菌株，该菌株的发现为纤维素的降解利用，特别是低温环境下纤维素的降解和利用提供了一种新的菌株资源。
47.(2)本发明获得的菌株ky325适用的温度范围较广，突破了低温的限制，对于低温条件下农业秸秆的降解和腐熟具有较大的优势，可提升堆肥物质的代谢和反应速度，提高秸秆的腐熟效率，具有较高的研究和开发价值，有利于纤维素的生物降解法在冬季或低温环境中的应用和推广。
48.(3)本发明通过的菌株ky325综合性能突出，不但可以高效降解纤维素，还可以降解脂类、淀粉和蛋白质，可用于农作物秸秆肥料化、饲料化，厨余垃圾的处理以及农业环境保护等方面。
附图说明
49.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
50.图1为本发明提供的部分菌株在不同温度下cmc培养基上降解纤维素的能力结果；
51.图2为本发明提供的菌株ky325在显微镜下(油镜100x)的形态；
52.图3为本发明提供的对照菌株92068、ky240、mb338与ky325在不同温度下降解纤维素能力的测定结果；
53.图4为本发明提供的不同菌株在4℃下对秸秆混合物腐熟能力的测定结果；
54.图5为本发明提供的不同菌株在30℃下对秸秆混合物腐熟能力的测定结果；
55.图6为本发明提供的ky325在不同温度下降解蛋白质能力的测定结果；
56.图7为本发明提供的ky325在不同温度下解淀粉能力的测定结果；
57.图8为本发明提供的ky325在不同温度下解脂能力的测定结果。
具体实施方式
58.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
59.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
60.实施例1：降解纤维素的微生物菌株的筛选
61.1、能够在4℃、30℃、35℃降解纤维素的微生物菌株初筛
62.1.1菌种来源
63.从康生元(肇庆)生物科技有限公司稀有微生物资源库(稀有菌株库)筛选。稀有菌株库的菌株采集自全国各地不同省份的土壤，包括沙土、粘土、黑土等多种土样类型，分别
来源于小麦地、牧草地、森林等不同的区域，每个地方采集大约10-15g样品，在采集的土壤上标明来源地(省，县)、采集年和月、土壤的来源(植物，沙土、或其他)。一共采集到来源于全国各地的土样253个，通过对不同的功能筛选土壤样品，构建了稀有微生物资源库，共计1175个菌株。
64.1.2培养基
65.(1)r2a固体培养基：酵母粉0.50g，蛋白胨0.50g，胰蛋白胨0.50g，葡萄糖0.50g，可溶性淀粉0.50g，磷酸氢二钾0.30g，丙酮酸钠0.30g，七水硫酸镁0.05g，琼脂粉15.0g，水1000ml；
66.(2)羧甲基纤维素钠(cmc)固体培养基：磷酸氢二钾1.0g，七水硫酸镁0.25g，酵母粉2.0g，琼脂粉10.0g，羧甲基纤维素钠cmc 2.0g，水1000ml；
67.(3)lb培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000ml；
68.(4)解蛋白质培养基：酵母粉0.50g，蛋白胨0.50g，胰蛋白胨0.50g，葡萄糖0.50g，可溶性淀粉0.50g，磷酸氢二钾0.30g，丙酮酸钠0.30g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，脱脂奶粉5g，水1000ml；
69.(5)解淀粉培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，水1000ml；
70.(6)脂类培养基：酵母粉0.50g，蛋白胨0.50g，胰蛋白胨0.50g，葡萄糖0.50g，可溶性淀粉0.50g，磷酸氢二钾0.30g，丙酮酸钠0.30g，七水硫酸镁0.05g，l-glycerol(l-甘油)10g，琼脂粉15.0g，水1000ml。
71.1.3筛选可在4℃能够降解纤维素的菌株
72.将稀有菌株库的菌株从-80℃冰箱活化，在r2a固体培养基上划线放置30℃培养箱进行培养24h，从中挑取单个菌落针刺于cmc固体培养基中，以92068(商业菌株枯草芽孢杆菌)作为照，置于4℃下培养，待菌株生长后用碘液熏蒸，测量在4℃下能够降解cmc菌株所产生的透明圈，并记录结果。菌株所产生的透明圈越大，说明降解纤维素的能力越好。
73.解cmc能力＝解cmc圈直径的毫米数+x；
74.(注：x为加权系数，根据菌株解cmc圈的透明程度，相应的为：-1、0、1、2。数字2代表溶解圈全完全透明；数字1代表溶解圈半透明；0代表溶解圈不透明，但在培养基表面具有水解痕迹，基本人眼观察不到溶解圈，但把菌落用水冲洗以后，在接种细菌处有微弱的水解的痕迹；-1代表无任何水解活性。此方法同时应用在测试细菌的解蛋白质能力和解淀粉能力。
75.1.4筛选30℃下能够降解纤维素的菌株
76.挑取1.3中的可在4℃下降解纤维素的微生物菌株，针刺于羧甲基纤维素钠(cmc)培养基中，设置商业菌株枯草芽孢杆菌92068作为对照，置于培养箱30℃培养，待菌株生长后同样用碘液熏蒸，测定解cmc圈的直径，单位mm。
77.1.5筛选35℃下能够降解纤维素的菌株
78.挑取1.3中的可在4℃下降解纤维素的微生物菌株，针刺于羧甲基纤维素钠(cmc)培养基中，设置商业菌株枯草芽孢杆菌92068作为对照，置于培养箱35℃培养，待菌株生长后同样用碘液熏蒸，测定解cmc圈的直径，单位mm。
79.1.6重复验证
80.为避免从稀有菌株库筛选可降解纤维素的菌株存在假阳性，将可同时在4℃、30℃、35℃下强降解cmc的菌株，再次接种于cmc固体培养基，分别在4℃、30℃、35℃下培养，验
证所筛选出的菌株是否同时具有4℃、30℃、35℃下降解cmc功能。
81.1.7结果分析
82.结果如表1和图1所示，表明在30℃下降解纤维素较强的菌株在4℃下降解纤维素的能力相对较弱；在4℃下降解纤维素较好的菌株在35℃降解纤维素的能力相对较弱；在35℃降解纤维素较强的菌株在4℃下降解纤维素的能力相对较弱。
83.综上，此次研究从康生元(肇庆)生物科技有限公司稀有菌株库中共筛选出了能够在4℃低温降解纤维素的菌株，从其中筛选出同时在4℃、30℃和35℃下具有较高纤维素降解能力的菌株ky325。对菌株进行16s rdna测序结果鉴定，并在ncbi上进行搜索同源序列进行同源序列分析对比，结果显示该菌株与exiguobacterium undae具有100％的高度同源性，最终确定菌株ky325是exiguobacterium undae。
84.表1.部分菌株在不同温度下羧甲基纤维素钠(cmc)培养基降解纤维素的能力结果
[0085][0086][0087]
实施例2：菌株16s rdna的测定过程及菌株生理形态分析
[0088]
2.1ky325菌株16s rdna的测定
[0089]
2.1.1ctab法提取细菌dna
[0090]
1、接种一单菌落于5ml r2a中，30℃培养过夜；
[0091]
2、取1ml种子培养液接入100ml r2a液体中，37℃、220r/min培养16小时；
[0092]
3、5000r/min离心10分钟，弃去上清；
[0093]
4、加入10ml te离心洗涤后，用10ml te溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；
[0094]
5、取3.5ml菌悬液，加入184μl 10％sds，混匀，加入37μl 10mg/ml蛋白酶k，混匀，37℃温育1小时；
[0095]
6、加入740μl 5mol/l nacl，再加入512μl ctab/nacl，混匀，65℃温育10分钟；
[0096]
7、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
[0097]
8、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
[0098]
9、加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集dna沉淀，用70％乙醇离心洗涤dna沉淀；
[0099]
10、用1ml te溶解dna，加入终浓度为20μg/ml rnasea，4℃保存。
[0100]
2.1.2扩增与测序
[0101]
采用16s rdna通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3'，seq id no.2)和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3'，seq id no.3)进行16s rdna的pcr扩增。
[0102]
pcr反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将pcr产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序(北京美亿美生物技术有限公司)，根据获得的16s rdna序列(seq id no.1)在genbank中blast搜索同源序列并进行同源序列分析对比，建立系统发育树。
[0103]
菌株ky325的16s rdna序列如下：
[0104]
tgcggttacctcaccggcttcgggtgttgcaaactctcgtggtgt
[0105]
gacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcagtatgc
[0106]
tgacctgcgattactagcgattccgacttcatgcaggcgagttgcag
[0107]
cctgcaatccgaactgggaacggctttctgggattggctccacctcg
[0108]
cggtctcgctgccctttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagccca
[0109]
actcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggt
[0110]
ttgtcaccggcagtctccctagagtgcccaactaaatgctggcaact
[0111]
aaggataggggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacg
[0112]
acacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcacccttgtccccga
[0113]
agggaaaacttgatctctcaagcggtcaaggggatgtcaagagttg
[0114]
gtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgctt
[0115]
gtgcgggtccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtact
[0116]
ccccaggcggagtgcttaatgcgttagcttcagcactgaggggcgga
[0117]
aaccccccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagg
[0118]
gtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagtt
[0119]
acagaccaaagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctcta
[0120]
cgcatttcaccgctacacatggaattccactcttctcttctgtactca
[0121]
agccttccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttca
[0122]
catcagacttaaaaggccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattc
[0123]
cggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtag
[0124]
ttagccgtggctttctcgcaaggtaccgtcatagcatgagcattacct
[0125]
ctcatacctgttcttcccttacaacagagttttacgatccgaaaacct
[0126]
tcatcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaa
[0127]
gattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcc
[0128]
cagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctatgcatcgtcgccttg
[0129]
gtgggccattaccccaccaactagctaatgcaccgcaaggccatccc
[0130]
aaggtgacgccggagcgcctttcatcatcagaccatgcggtctgaag
[0131]
aactattcggtattagctccgatttctcggagttatcccaatccttgg
[0132]
ggcaggttccttacgtgttactcacccgtccgccgctcattcccttca
[0133]
cttccctccgaagagttc(seq id no.1)。
[0134]
2.1.3ky325菌株16s rdna测序结果
[0135]
通过对ky325菌株序列的测定结果与ncbi数据库的对比显示，ky325菌株与exiguobacterium undae具有100％高度同源性。
[0136]
2.2菌株形态观察
[0137]
2.2.1菌株形态观察
[0138]
将筛选的菌株接种到r2a平板上，30℃培养2d，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征及有无芽孢等。
[0139]
2.2.2菌株形态观察结果
[0140]
如图2所示，在r2a培养基上培养生长2天后菌落形态呈圆形，直径大约为2-3mm，菌落颜色为橙色，橙色的色素不会扩散到培养基中，微凸起，大小完整，有光泽，经显微镜测量菌体直径约为2.4-7.1μm。
[0141]
实施例3：菌株ky325、商业菌株92068、专利菌株mb338以及低温专利菌株ky240在不同温度下降解纤维素活性比较
[0142]
3.1菌株ky325、92068、mb338以及ky240在不同温度下降解纤维素测定
[0143]
为验证ky325在不同温度下具有强降解纤维素的能力，设置枯草芽孢杆菌92068(市面上常用于腐熟菌剂产品的主要成分)、专利菌株mb338(申请号202010310043.5，保藏编号cgmcc no.19489；mb338菌株是先前开并申报专利的多功能菌株，与ky325是同一个种属，在30℃下也具有较好的降解纤维素能力)、低温专利菌株ky240(申请号cn201911394095.9，保藏编号为cgmcc no.18751；pseudomonasgraminis假单胞，4℃低温降解纤维素的专利菌株)作为对照菌株。
[0144]
将ky325菌株与以上对照菌株接于r2a固体培养基上划线，置30℃培养箱培养24h，从中挑取单个菌落针刺于3个相同的cmc固体培养基中，。分别置于4℃、30℃、35℃下培养，待菌株生长后用碘液熏蒸，测量水解圈结果，产生的透明圈越大，说明降解纤维素的能力越强。
[0145]
解cmc能力＝解cmc圈直径的毫米数+x；(x为加权系数，根据菌株解cmc圈的透明程度，相应的为-1、0、1、2)。
[0146]
3.1.1菌株ky325在不同温度下降解纤维素能力的测定结果
[0147]
表2.不同温度下cmc培养基上菌株降解纤维素的能力
[0148][0149]
由表2和图3的结果表明，与枯草芽孢杆菌92068、低温纤维素降解菌ky240和菌株mb338相比，本发明菌株ky325在4℃下降解纤维素的能力明显要更强，说明ky325菌株在低温下具有强降解纤维素的能力。
[0150]
同时本发明ky325菌株在30℃下降解纤维素能力明显强于枯草芽孢杆菌92068和低温纤维素降解菌ky240；在35℃下，ky325降解纤维素的能力明显高于枯草芽孢杆菌92068和菌株mb338，而低温纤维素降解菌ky240则在35℃没有降解纤维素能力。
[0151]
综上，本发明ky325菌株在4℃、30℃和35℃的不同温度下的综合性能突出。在4℃、30℃和35℃下ky325菌株均强于枯草芽孢杆菌92068和低温纤维素降解菌ky240。此外，虽然mb338菌株与本发明ky325菌株是同一种属，但在不同温度下降解纤维素的能力存在差异；在4℃和35℃时，ky325菌株的降解纤维素能力均强于mb338菌株降解纤维素的能力。虽然在30℃下ky325菌株的降解纤维素的能力较mb338菌株弱，但是ky325菌株的降解纤维素能力受低温和中高温影响影响较小，适用范围更广，性能更稳定。
[0152]
实施例4：菌株ky325与商业菌株92068、低温专利菌株ky240对秸秆腐熟试验
[0153]
4.1ky325菌液与92068菌液、ky240菌液在4℃和30℃下对秸秆混合物腐熟能力的测定
[0154]
以玉米秸秆和小麦秸秆为实验原料，分别称取1g玉米秸秆和1g小麦秸秆混合均匀放于同一支50ml离心管，共8份，加入等量r2a液体使秸秆湿润。随后分别加入ky325菌液、92068菌液、ky240菌液各1ml，震荡均匀，分别放于4℃和30℃进行腐熟，按照腐熟的程度可适量的浇灌等量的菌液，每周观察其腐熟情况。设置以水为空白对照，92068菌液和ky240菌液为对照。
[0155]
4.2菌株ky325在4℃和30℃下对秸秆混合物腐熟能力的测定结果
[0156]
如图4可以看出，ky325菌株在4℃低温下混合秸秆腐熟与低温腐熟菌株ky240、枯草芽孢杆菌92068相比较，菌株ky325腐熟的混合秸秆更加的细腻且湿润，说明ky325菌株所
腐熟的速度明显比它们要快，降解纤维素要强。
[0157]
由图5可以看出，菌株ky325在30℃下腐熟的混合秸秆所呈现出来的颜色明显比枯草芽孢杆菌92068和低温腐熟菌株ky240腐熟的要黑，相比之下，菌株ky325腐熟的混合秸秆明显比枯草芽孢杆菌92068和低温腐熟菌株ky240所腐熟的更加湿润且细腻。说明常温30℃下ky325菌株的腐熟能力和速度比枯草芽孢杆菌92068和低温腐熟菌株ky240要强要快。
[0158]
实施例5：菌株ky325的多功能测定
[0159]
上述实验结果表明，菌株ky325具有低温生长的功能，且同时能在4℃、30℃以及35℃下具有强降解纤维素的能力，也能在低温4℃与常温30℃下快速腐熟。可将其制作成腐熟菌剂应用于现实生活中帮助含有纤维类的物质加快腐熟分解。ky325菌株要是作为耐受温度范围较广腐熟菌剂产品的主要成分，可探索更广泛的应用场景。例如对厨余生活垃圾降解腐熟。城市生活垃圾中有机物的主要成分包括淀粉类、食物纤维类、蛋白质以及脂肪类等物质。如能腐熟秸秆的同时又能降解腐熟厨余垃圾等中的某些成分，使得腐熟菌剂应用范围广且多样化。因此，为扩大该商品的应用场景，对菌株ky325展开探索是否对淀粉、蛋白质和脂类具有降解作用。
[0160]
5.1ky325菌株解蛋白质的能力测定
[0161]
5.1.1ky325在4℃、30℃、35℃下解蛋白质能力测定
[0162]
将ky325菌株接于r2a固体培养基上划线，置30℃培养箱培养24h，从中挑取单个菌落针刺于3个相同的蛋白质固体培养基中，设置枯草芽孢杆菌92068、低温专利菌株ky240作为对照。分别置于4℃、30℃、35℃下培养，以测量透明抑制圈的直径来判断降解蛋白质的能力。
[0163]
解蛋白质能力＝解蛋白质圈直径的毫米数+x；
[0164]
x为加权系数，根据菌株解蛋白质圈的透明程度，相应的为-1、0、1、2。
[0165]
5.1.2ky325在4℃、30℃、35℃下解蛋白质能力测定结果
[0166]
ky325菌株与低温腐熟菌株ky240、枯草芽孢杆菌92068在不同温度下解蛋白质的能力如表3和图6所示。
[0167]
表3.ky325在4℃、30℃、35℃下解蛋白质能力测定结果
[0168][0169][0170]
由表3和图6的结果表明，菌株ky325在4℃、30℃和35℃下降解蛋白质的能力明显比枯草芽孢杆菌92068要强；低温降解纤维素菌株ky240在4℃、30℃和35℃均没有降解蛋白质的能力。
[0171]
5.2ky325菌株解淀粉功能测定
[0172]
5.2.1ky325在4℃、30℃、35℃下解淀粉能力测定
[0173]
将ky325菌株接于r2a固体培养基上划线，置30℃培养箱培养24h，从中挑取单个菌落针刺于3个相同的解淀粉固体培养基中，设置枯草芽孢杆菌92068、低温专利菌株ky240作为对照。分别置于4℃、30℃、35℃下培养，以测量透明抑制圈的直径来判断解淀粉的能力。
[0174]
解淀粉能力＝解淀粉圈直径的毫米数+x；x为加权系数，根据菌株解淀粉圈的透明程度，相应的为-1、0、1、2。
[0175]
5.2.2ky325在4℃、30℃、35℃下解淀粉能力测定结果
[0176]
ky325菌株与低温腐熟菌株ky240、枯草芽孢杆菌92068在不同温度下解淀粉的能力如表4和图7所示。
[0177]
表4.ky325在4℃、30℃、35℃下解淀粉能力测定结果
[0178][0179]
由表4和图7表明，菌株ky325在4℃下解淀粉能力明显比枯草芽孢杆菌92068、低温降解纤维素菌株ky240要强；在30℃和35℃下，菌株ky325解淀粉能力均高于枯草芽孢杆菌92068，而低温降解纤维素菌株ky240均没有降解淀粉的能力。
[0180]
5.3ky325菌株降解脂类能力测定
[0181]
5.3.1ky325在4℃、30℃、35℃下降解脂类能力测定
[0182]
将ky325菌株接于r2a固体培养基上划线，置30℃培养箱培养24h，从中挑取单个菌落针刺于3个相同的解脂培养基中，设置枯草芽孢杆菌92068作为对照。分别置于4℃、30℃、35℃下培养，以降解圈的大小、透明度来判断解脂的能力。
[0183]
5.3.2ky325在4℃、30℃、35℃下降解脂类能力测定结果
[0184]
ky325菌株与芽孢杆菌92068在不同温度下解脂的能力如图8所示。
[0185]
由图8可以看出，菌株ky325在低温4℃、常温30℃、中高温35℃下均能产生透明降解圈，具有解脂的能力，菌株枯草芽孢杆菌92068在不同温度下均没有降解脂的能力，说明菌株ky325降解脂的能力优于商业菌株枯草芽孢杆菌92068。
[0186]
综上，本发明通过筛选康生元(肇庆)生物科技有限公司的稀有微生物菌株资源库，从中挑选出一株可在低温4℃下具有强降解纤维素、适温性范围广，且同时能在4℃、30℃和35℃具有强降解纤维素能力的菌株ky325。经过16s rdna测序结果鉴定，在ncbi上进行搜索同源序列并进行同源序列分析对比，结果显示该菌株与exiguobacterium undae具有100％的高度同源性。经过大量的实验研究表明，ky325与商业菌株枯草芽孢杆菌92068和低
温降解纤维素菌株ky240和多功能菌株mb338相比，ky325在4℃、30℃和35℃下具有强降解纤维素的能力。同时，ky325在4℃、30℃和35℃下也具有解淀粉、解蛋白质和解脂的能力，与商业菌株枯草芽孢杆菌92068、低温降解纤维素菌株ky240相比其作用明显更胜一筹。在兼具有多功能应用的前提下，可以为日后扩大应用场景提供实质性的理论依据。由此可见，ky325菌株能在4℃、30℃和35℃具有强降解纤维素的能力，能加快秸秆腐熟的速度，促进堆肥，以及还具有解淀粉、解蛋白质和解脂的功能，应用范围广泛且效果明显。
[0187]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一株能在低温、常温和中高温下降解纤维素的菌株，其特征在于，所述菌株为水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmccno.63287。2.一种腐熟剂，其特征在于，所述腐熟剂含有权利要求1所述的水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325或所述水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325的培养物。3.一种生物有机质降解菌肥，其特征在于，所述生物有机质降解菌肥以权利要求1所述的水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325或权利要求2所述的腐熟剂作为活性成分。4.权利要求1所述的水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325或权利要求2所述的腐熟剂在降解纤维素或产纤维素酶中的应用。5.权利要求1所述的水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325或权利要求2所述的腐熟剂在降解秸秆中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括使用权利要求1所述的水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325或权利要求2所述的腐熟剂对秸秆进行堆肥发酵。7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用包括在低温、常温和/或中高温环境下进行降解；所述低温的温度范围为3℃-20℃。8.权利要求1所述的水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325或权利要求2所述的腐熟剂在以下一个或多个方面的应用：(a)降解蛋白质；(b)降解脂质；(c)水解淀粉；(d)制备有机肥；(e)降解厨余生活垃圾。9.一种降解纤维素的方法，其特征在于，包括将含有纤维素的原料与权利要求1所述的水域微小杆菌(exiguobacteriumundae)ky325或权利要求2所述的腐熟剂混合培养，获得含降解产物的产品。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括在低温、常温和/或中高温环境下降解含有所述纤维素的原料；所述低温的温度范围为3℃-20℃。

技术总结
本发明提供了一株能在低温、常温和中高温下降解纤维素的菌株、腐熟剂及其应用，涉及微生物及其应用技术领域。该菌株为水域微小杆菌(Exiguobacteriumundae)KY325，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCCNo.63287。菌株KY325是从自行采集并构建的菌株资源库中分离和筛选得到，该菌株在低温、常温和中高温下均具有较强的降解纤维素的能力，能加快秸秆腐熟的速度以及促进堆肥；并且该菌株还兼具解蛋白、解淀粉和解脂的功能，综合性能突出，具有广泛的应用前景和重要的应用价值。用价值。用价值。


技术研发人员：康耀卫 黎炜铃 黄燕菲
受保护的技术使用者：康生元（肇庆）生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/9