甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法

1.本发明涉及甘草酸海藻酸锌纳米递送技术领域，特别是涉及一种具有抗抑郁活性的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法。


背景技术：

2.目前全球有超过3.2亿人罹患抑郁症，给社会和家庭带来了沉重的负担。但是只有16％的患者可以达到理想的治疗效果。大部分患者疗效不佳，且副作用大，依从性差。甘草酸具有很强的体外抗抑郁活性，但其溶解性和体内稳定性差，在体内很难有效发挥抗抑郁活性。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，以达到改善甘草酸的体内过程，实现缓释释放和靶向治疗，能够有效发挥抗抑郁活性的目的。
4.本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂，包括海藻酸，海藻酸与二价锌离子之间形成离子键，海藻酸和甘草酸之间形成分子氢键，通过乳化-内部凝胶法可制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。
5.进一步，二价锌离子为氯化锌的二价锌离子。
6.本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤1，按照体积比1000:(6.8～7.2):(2.8～3.2)的比例加入液体石蜡、油酸山梨坦和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，水浴分散油相；
8.步骤2，将浓度为0.5mg/l海藻酸钠溶液滴入步骤1中的油相中，搅拌，使水相与油相充分混匀，得到水相与油相混合液；
9.步骤3，向步骤2中的水相与油相混合液中加入固化剂a，其固化剂a中为含有0.02％～0.03％氯化锌和0.2％～0.4％甘草酸的60％～70％乙醇溶液；滴加完毕后继续搅拌1h，再加入固化剂b，其固化剂b为含有0.18％～0.2％氯化锌的60％～70％乙醇溶液，滴加完毕后继续搅拌1h，得到纳米凝胶；
10.步骤4，将步骤3中的纳米凝胶于1500
×
g条件下离心10min，分离水相得到甘草酸海藻酸锌凝胶悬液；
11.步骤5，将步骤4中的甘草酸海藻酸锌凝胶悬液冷冻干燥保存，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。
12.进一步，步骤1中，体积比1000:7:3的比例加入液体石蜡、油酸山梨坦和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，40℃水浴，500rpm条件下充分分散30min作为油相。
13.进一步，步骤2中，按照体积比海藻酸钠溶液：步骤1中的失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚为100:1的比例滴入0.5mg/l海藻酸钠溶液。
14.进一步，所述步骤2中，将搅拌转速调至1000rpm，按照体积比海藻酸钠溶液：步骤1中的失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚为100:1的比例，使用蠕动泵将0.5mg/l海藻酸钠溶液
按照流速0.75ml/min滴入步骤1中的油相中，滴加完毕后持续搅拌1h，使水相与油相充分混匀，得到水相与油相混合液。
15.进一步，步骤3中，其中按照体积比固化剂a：步骤1中的油酸山梨坦为20:3的比例加入固化剂a，按照体积比固化剂b：步骤1中的油酸山梨坦为20:3的比例加入固化剂b，其中固化剂a控制流速0.25ml/min，搅拌转速1000rpm。
16.进一步，所述步骤4中，将步骤3中的纳米凝胶于1500
×
g条件下离心10min，分离水相得到甘草酸海藻酸锌凝胶悬液。
17.进一步，所述步骤5中，将步骤4中的甘草酸海藻酸锌凝胶悬液置于-80℃冰箱冷冻过夜12h～16后，再快速转移至-30℃冷冻干燥机中冻干，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂粉末，密封储存。
18.进一步，步骤5中，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的平均粒径为60～70nm，pdi为0.18-0.20，zeta电位为-(31-35)mv，具有较窄的单一粒径分布。
19.与现有技术相比较，本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，具有以下优点：
20.1、海藻酸钠是一种天然多糖，由直链键合的β-d-甘露糖醛酸(m)和α-l-古洛糖醛酸(g)组成的无规嵌段共聚物，具有良好的生物相容性，在水溶液中能够与二价锌离子螯合形成凝胶。当在油包水体系中先后滴入海藻酸钠、氯化锌和甘草酸时，海藻酸和锌离子之间形成离子键、海藻酸和甘草酸之间形成分子氢键。在持续高速搅拌作用下，通过乳化-内部凝胶法可制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂，可以改善甘草酸的体内过程，实现缓释释放和靶向治疗。
21.2、通过体外实验，开展了体外甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂与巨噬细胞相互作用的研究。并以罗丹明异硫氰酸酯(rbitc)标记海藻酸锌考察经尾静脉注射给药后，甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂是否具有主动肝靶向作用。透射电镜结果显示甘草酸海藻酸锌纳米粒形态圆整，其粒径为60
±
4.65nm，zeta电位为-35.34
±
1.92mv，分散系数(pdi)为0.18
±
0.01，载药量为3.63％，包封率为86.98％。体外释放结果表明甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂能显著延长甘草酸的释放时间。甘草酸海藻酸锌纳米递送系统与巨噬细胞之间存在较好的生物相容性，对细胞形态以及细胞因子白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的分泌无显著性影响，但能抑制脂多糖(lps)诱导的il-6和tnf-α过表达。该甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂对小鼠行为绝望模型具有显著的抗抑郁活性。
22.本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂形态圆整、粒径分布均匀、分散性和稳定性良好，能够改善甘草酸的体内过程，具有免疫逃逸特点，不易被巨噬细胞吞噬清除，实现缓释释放和靶向治疗，且具有较好的抗炎和抗抑郁作用，能够有效发挥抗抑郁活性。因此，本发明具有改善甘草酸的体内过程，实现缓释释放和靶向治疗，能够有效发挥抗抑郁活性的积极效果。
附图说明
23.附图部分公开了本发明具体实施例，其中，
24.图1是本发明的结构示意图；
25.图2是本发明的化学结构示意图。
具体实施方式
26.实施例1
27.如图1-2所示，一种甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂，包括海藻酸，海藻酸与二价锌离子之间形成离子键，海藻酸和甘草酸之间形成分子氢键，通过乳化-内部凝胶法可制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。其中，二价锌离子为氯化锌的二价锌离子。透射电镜结果显示，本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂形态圆整，其粒径为60
±
4.65nm，zeta电位为-35.34
±
1.92mv，分散系数(pdi)为0.18
±
0.01，载药量为3.63％，包封率为86.98％。
28.实施例2
29.一种甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，包括以下步骤：
30.步骤1，按照体积比1000:(6.8～7.2):(2.8～3.2)的比例加入液体石蜡、油酸山梨坦和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，水浴分散油相；
31.步骤2，将浓度为0.5mg/l海藻酸钠溶液滴入步骤1中的油相中，搅拌，使水相与油相充分混匀，得到水相与油相混合液；
32.步骤3，向步骤2中的水相与油相混合液中加入固化剂a，其固化剂a中为含有体积比0.02％～0.03％氯化锌和0.2％～0.4％甘草酸的60％～70％乙醇溶液；滴加完毕后继续搅拌1h，再加入固化剂b，其固化剂b为含有体积比0.18％～0.2％氯化锌的60％～70％乙醇溶液，滴加完毕后继续搅拌1h，得到纳米凝胶；
33.步骤4，将步骤3中的纳米凝胶于1500
×
g条件下离心10min，分离水相得到甘草酸海藻酸锌凝胶悬液；
34.步骤5，将步骤4中的甘草酸海藻酸锌凝胶悬液冷冻干燥保存，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。
35.实施例3
36.一种甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，包括以下步骤：
37.步骤1，体积比1000:7:3的比例加入液体石蜡、油酸山梨坦和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，40℃水浴，500rpm条件下充分分散30min作为油相；
38.步骤2，将搅拌转速调至1000rpm，按照体积比海藻酸钠溶液：步骤1中的失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚为100:1的比例，使用蠕动泵将0.5mg/l海藻酸钠溶液按照流速0.75ml/min滴入步骤1中的油相中，滴加完毕后持续搅拌1h，使水相与油相充分混匀，得到水相与油相混合液；
39.步骤3，向步骤2中的水相与油相混合液中加入固化剂a，其固化剂a中为含有体积比0.02％氯化锌和0.3％甘草酸的60％乙醇溶液；控制流速0.25ml/min，搅拌转速1000rpm，滴加完毕后继续搅拌1h，再加入固化剂b，其固化剂b为含有体积比0.18％氯化锌的60％乙醇溶液，滴加完毕后继续搅拌1h，其中按照体积比固化剂a：步骤1中的油酸山梨坦为20:3的比例加入固化剂a，按照体积比固化剂b：步骤1中的油酸山梨坦为20:3的比例加入固化剂b，得到纳米凝胶；
40.步骤4，将步骤3中的纳米凝胶于1500
×
g条件下离心10min，分离水相得到甘草酸海藻酸锌凝胶悬液；
41.步骤5，将步骤4中的甘草酸海藻酸锌凝胶悬液置于-80℃冰箱冷冻过夜12h～16后，再快速转移至-30℃冷冻干燥机中冻干，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂粉末，密封储
存。制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的平均粒径为60～70nm，pdi为0.18-0.20，zeta电位为-(31-35)mv，具有较窄的单一粒径分布。
42.本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，甘草酸海藻酸纳米粒在大鼠内脏组织中的分布情况：小鼠尾静脉注射rbitc标记的甘草酸海藻酸纳米粒，注射后1h、2h、4h、8h、12h、24h观察心、肝、脾、肺、肾各脏器的荧光强度，肝脏的荧光强度明显强于其他脏器，证明该纳米粒具有显著肝靶向性。静脉注射后2h肝脏荧光强度最高，达到5.8
×
104。
43.本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，抗抑郁药效学评价：
44.雄性icr小鼠80只，20-25g，随机分为8组
45.(1)空白对照组(control)：灌胃给予生理盐水。
46.(2)阳性对照组(fluo,14mg/kg)：灌胃给予盐酸氟西汀14mg/kg。
47.(3)甘草酸组(gl,6mg/kg)：腹腔注射给予甘草酸6mg/kg。
48.(4)甘草酸组(gl,12mg/kg)：腹腔注射给予甘草酸12mg/kg。
49.(5)甘草酸组(gl,24mg/kg)：腹腔注射给予甘草酸24mg/kg。
50.(6)甘草酸海藻酸锌纳米粒组(gl-alg，6mg/kg)：尾静脉注射给予甘草酸6mg/kg。
51.(7)甘草酸海藻酸锌纳米粒组(gl-alg，12mg/kg)：尾静脉注射给予甘草酸12mg/kg。
52.(8)甘草酸海藻酸锌纳米粒组(gl-alg，24mg/kg)：尾静脉注射给予甘草酸24mg/kg。
53.(1)-(5)组连续给药3天，每天1次；第三天(6)-(8)给药1次，给药后2h进行行为学测试。
54.1、开放场实验
55.将各给药组小鼠在给药2h后，置于50
×
50
×
40cm箱子中央，使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的自主活动行为，分析后4min内小鼠直立次数。
56.2、小鼠强迫游泳实验
57.将各组小鼠于给药后2h进行实验。将其置于高20cm，直径10cm的圆柱形有机玻璃缸中，水温为25
±
1℃，水深15cm，每次操作2只，并且使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的游泳行为，分析后4min内小鼠强迫游泳的累计不动时间(s)。
58.3、小鼠悬尾实验
59.各给药组小鼠于给药2h后进行实验，将小鼠尾尖1cm处黏贴倒置悬挂，每次操作2只，使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的绝望行为，分析后4min内的累计不动时间(s)。
[0060][0061]
实验表明，本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，体外释放结果表明甘草酸海藻酸锌纳米递送系统能显著延长甘草酸的释放时间。甘草酸海藻酸锌纳米递送系统与巨噬细胞之间存在较好的生物相容性，对细胞形态以及细胞因子白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的分泌无显著性影响，但能抑制脂多糖(lps)诱导的il-6和tnf-α过表达，对小鼠行为绝望模型具有显著的抗抑郁活性。甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂形态圆整、粒径分布均匀、分散性和稳定性良好，能够改善甘草酸的体内过程，具有免疫逃逸特点，不易被巨噬细胞吞噬清除，实现缓释释放和靶向治疗，且具有较好的抗炎和抗抑郁作用，能够有效发挥抗抑郁活性。
[0062]
实施例4
[0063]
一种甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0064]
步骤1，于500ml三颈瓶中分别加入150ml液体石蜡，1.05ml油酸山梨坦(司盘80)和0.45ml失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(tween 80)，于40℃水浴，500rpm条件下充分分散30min作为油相；
[0065]
步骤2，将搅拌转速调至1000rpm，使用蠕动泵将45ml浓度为0.5mg/l海藻酸钠溶液缓慢滴入油相中，控制流速0.75ml/min，滴加完毕后持续搅拌1h，使水相与油相充分混匀，得到水相与油相混合液；
[0066]
步骤3，使用蠕动泵向步骤2中的水相与油相混合液中加入7ml固化剂a，其固化剂a为0.02％氯化锌和0.3％甘草酸的60％乙醇溶液；控制流速0.25ml/min，搅拌转速1000rpm，滴加完毕后继续搅拌1h，再加入7ml固化剂b，其固化剂b为0.18％氯化锌的60％乙醇溶液，滴加完毕后继续搅拌1h，得到纳米凝胶；
[0067]
步骤4，将步骤3中的纳米凝胶倒入50ml离心管中称重，于1500
×
g条件下离心10min，分离水相得到甘草酸海藻酸锌凝胶悬液；
[0068]
步骤5，将步骤4中的甘草酸海藻酸锌凝胶悬液-80℃冷冻12h后，再-30℃干燥保存，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。其制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的平均粒径为60～70nm，pdi为0.18-0.20，zeta电位为-(31-35)mv，具有较窄的单一粒径分布。
[0069]
本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，甘草酸海藻酸纳米粒在大鼠内脏组织中的分布情况：小鼠尾静脉注射rbitc标记的甘草酸海藻酸纳米粒，注射后1h、2h、4h、8h、12h、24h观察心、肝、脾、肺、肾各脏器的荧光强度，肝脏的荧光强度明显强于其他脏器，证明该纳米粒具有显著肝靶向性。静脉注射后2h肝脏荧光强度最高，达到5.8
×
104。
[0070]
本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，抗抑郁药效学评价：
[0071]
雄性icr小鼠80只，20-25g，随机分为8组
[0072]
(1)空白对照组(control)：灌胃给予生理盐水。
[0073]
(2)阳性对照组(fluo,14mg/kg)：灌胃给予盐酸氟西汀14mg/kg。
[0074]
(3)甘草酸组(gl,6mg/kg)：腹腔注射给予甘草酸6mg/kg。
[0075]
(4)甘草酸组(gl,12mg/kg)：腹腔注射给予甘草酸12mg/kg。
[0076]
(5)甘草酸组(gl,24mg/kg)：腹腔注射给予甘草酸24mg/kg。
[0077]
(6)甘草酸海藻酸锌纳米粒组(gl-alg，6mg/kg)：尾静脉注射给予甘草酸6mg/kg。
[0078]
(7)甘草酸海藻酸锌纳米粒组(gl-alg，12mg/kg)：尾静脉注射给予甘草酸12mg/kg。
[0079]
(8)甘草酸海藻酸锌纳米粒组(gl-alg，24mg/kg)：尾静脉注射给予甘草酸24mg/kg。
[0080]
(1)-(5)组连续给药3天，每天1次；第三天(6)-(8)给药1次，给药后2h进行行为学测试。
[0081]
1、开放场实验
[0082]
将各给药组小鼠在给药2h后，置于50
×
50
×
40cm箱子中央，使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的自主活动行为，分析后4min内小鼠直立次数。
[0083]
2、小鼠强迫游泳实验
[0084]
将各组小鼠于给药后2h进行实验。将其置于高20cm，直径10cm的圆柱形有机玻璃缸中，水温为25
±
1℃，水深15cm，每次操作2只，并且使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的游泳行为，分析后4min内小鼠强迫游泳的累计不动时间(s)。
[0085]
3、小鼠悬尾实验
[0086]
各给药组小鼠于给药2h后进行实验，将小鼠尾尖1cm处黏贴倒置悬挂，每次操作2只，使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的绝望行为，分析后4min内的累计不动时间(s)。
[0087][0088]
实验表明，本发明所提供的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，体外释放结果表明甘草酸海藻酸锌纳米递送系统能显著延长甘草酸的释放时间。甘草酸海藻酸锌纳米递送系统与巨噬细胞之间存在较好的生物相容性，对细胞形态以及细胞因子白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的分泌无显著性影响，但能抑制脂多糖(lps)诱导的il-6和tnf-α过表达，对小鼠行为绝望模型具有显著的抗抑郁活性。甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂形态圆整、粒径分布均匀、分散性和稳定性良好，能够改善甘草酸的体内过程，具有免疫逃逸特点，不易被巨噬细胞吞噬清除，实现缓释释放和靶向治疗，且具有较好的抗炎和抗抑郁作用，能够有效发挥抗抑郁活性。

技术特征：
1.一种甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂，其特征是，包括海藻酸和甘草酸，所述海藻酸与二价锌离子之间形成离子键，海藻酸和甘草酸之间形成分子氢键，通过乳化-内部凝胶法可制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。2.根据权利要求1所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂，其特征是，所述二价锌离子为氯化锌的二价锌离子。3.一种甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：步骤1，按照体积比1000:(6.8～7.2):(2.8～3.2)的比例加入液体石蜡、油酸山梨坦和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，水浴分散油相；步骤2，将浓度为0.5mg/l海藻酸钠溶液滴入步骤1中的油相中，搅拌，使水相与油相充分混匀，得到水相与油相混合液；步骤3，向步骤2中的水相与油相混合液中加入固化剂a，其固化剂a中为含有0.02％～0.03％氯化锌和0.2％～0.4％甘草酸的60％～70％乙醇溶液；滴加完毕后继续搅拌1h，再加入固化剂b，其固化剂b为含有0.18％～0.2％氯化锌的60％～70％乙醇溶液，滴加完毕后继续搅拌1h，得到纳米凝胶；步骤4，将步骤3中的纳米凝胶离心，分离水相得到甘草酸海藻酸锌凝胶悬液；步骤5，将步骤4中的甘草酸海藻酸锌凝胶悬液冷冻干燥保存，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。4.根据权利要求3所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，所述步骤1中，体积比1000:7:3的比例加入液体石蜡、油酸山梨坦和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，40℃水浴，500rpm条件下充分分散30min作为油相。5.根据权利要求3所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，所述步骤2中，按照体积比海藻酸钠溶液：步骤1中的失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚为100:1的比例滴入0.5mg/l海藻酸钠溶液。6.根据权利要求3所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，所述步骤2中，将搅拌转速调至1000rpm，按照体积比海藻酸钠溶液：步骤1中的失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚为100:1的比例，使用蠕动泵将0.5mg/l海藻酸钠溶液按照流速0.75ml/min滴入步骤1中的油相中，滴加完毕后持续搅拌1h，使水相与油相充分混匀，得到水相与油相混合液。7.根据权利要求3所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，所述步骤3中，其中按照体积比固化剂a：步骤1中的油酸山梨坦为20:3的比例加入固化剂a；按照体积比固化剂b：步骤1中的油酸山梨坦为20:3的比例加入固化剂b，其中固化剂a控制流速0.25ml/min，搅拌转速1000rpm。8.根据权利要求3所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，所述步骤4中，将步骤3中的纳米凝胶于1500
×
g条件下离心10min，分离水相得到甘草酸海藻酸锌凝胶悬液。9.根据权利要求3所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，所述步骤5中，将步骤4中的甘草酸海藻酸锌凝胶悬液置于-80℃冰箱冷冻过夜12h～16后，再快速转移至-30℃冷冻干燥机中冻干，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂粉末，密封储存。10.根据权利要求3所述的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的制备方法，其特征是，所述步
骤5中，制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂的平均粒径为60～70nm，pdi为0.18-0.20，zeta电位为-(31-35)mv，具有单一粒径分布。

技术总结
甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其制备方法，涉及甘草酸海藻酸锌纳米递送技术领域，特别是涉及一种具有抗抑郁活性的甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂及其加工方法。包括海藻酸，海藻酸与二价锌离子之间形成离子键，海藻酸和甘草酸之间形成分子氢键，通过乳化-内部凝胶法可制得甘草酸海藻酸锌纳米粒制剂。本发明具有改善甘草酸的体内过程，实现缓释释放和靶向治疗，能够有效发挥抗抑郁活性的积极效果。够有效发挥抗抑郁活性的积极效果。够有效发挥抗抑郁活性的积极效果。


技术研发人员：高丽娜 周晓坤 赵毅瑾 孙振航 孙珊珊 杨倩
受保护的技术使用者：济宁医学院
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/9