一种PACE结构修饰的帽类似物及其应用的制作方法

一种pace结构修饰的帽类似物及其应用
技术领域
1.本发明涉及化学及生物工程技术领域，具体涉及一种pace结构修饰的帽类似物及其应用。


背景技术：

2.真核细胞中，mrna发挥相应的功能，需要具备一些关键的结构,主要有五个部分，分别为5'帽子结构(5'cap)、5'非翻译区(5'utr)、编码抗原的开放阅读框(orf)、3'非翻译区(3'utr)和一个poly(a)尾。其中，帽子结构(cap)发挥了至关重要的作用，它可以提高mrna结构稳定性、增强翻译效率以及降低免疫原性。
3.自体免疫蛋白如rigi和ifit能够识别异常加帽的mrna，降低了外源mrna在细胞内的活性和半衰期，使得mrna在体内难以发挥作用。因此，优化mrna帽结构(加帽)对于提高mrna的生物活性是至关重要的。


技术实现要素：

4.为解决现有帽类似物的免疫原性有待提升的问题，本发明提供一种pace结构修饰的帽类似物，是在帽类似物的三个核糖结构之间的三膦酸酯链段或膦酸酯链段的磷的位置，一个或以上的膦酸酯替换为膦酸基乙酸(盐)结构。本发明的具有pace结构修饰的帽类似物，由于在三膦酸或膦酸上具有取代或未取代的(烷氧)烷基-cooh或其盐，不但提高了ivt产量和加帽效率，而且提高了目标mrna的翻译效率。
5.本发明所述pace结构修饰的帽类似物，是基于现有帽类似物结构中，具备两端的核糖碱基或修饰的核糖碱基，中间的三个核糖结构和连接核糖结构的三膦酸酯链段或膦酸酯链段，本发明是在所述三膦酸酯链段或膦酸酯链段，构建具有1个或以上的pace结构或pace衍生结构，所述pace结构或pace衍生结构符合以下结构通式：
[0006][0007]
所述pace结构的x是-ch2cooh或其盐；
[0008]
所述pace衍生结构的x是-cooh、取代或未取代的烷基-cooh或其盐、取代或未取代的o-烷基-cooh或其盐、取代或未取代的烷基-o-cooh或其盐、取代或未取代的烷基-o-烷基-cooh或其盐；以上所述烷基的碳数不大于7；以上所述取代基是指碳数不大于7的烷基、烯基、炔基、环烷基或环烯基。
[0009]
所述盐是指钠盐、铵盐或与三(羟甲基)氨基甲烷形成的盐。所述三(羟甲基)氨基甲烷与本发明所述pace结构修饰的帽类似物形成的盐以下简称为tris盐。
[0010]
作为优先，所述x为烷基-cooh或其盐，所述烷基的c原子数为1、2、3或4。
[0011]
作为优先，所述x为o-烷基-cooh，所述烷基的c原子数为1、2、3或4。
[0012]
作为优先，所述的pace结构修饰的帽类似物，符合以下结构通式：
[0013][0014]
其中，r1、r2和r3分别独立地为h、oh、烷基或o-烷基；
[0015]
x1、x2、x3和x4中的任意一个、两个或多个为权利要求1所述的x，其余各自独立地为h、oh、nh2、烷基、o-烷基、n-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或卤素；
[0016]
b1和b2分别独立地为天然的、修饰的或非天然的核苷碱基。
[0017]
作为优选，b1和b2分别独立地为腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)、胸腺嘧啶(t)。
[0018]
作为优选，b1和b2分别独立地为腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)。
[0019]
进一步的，所述的pace结构修饰的帽类似物为以下结构的任意一种：
[0020][0021]
作为优先，所述的pace结构修饰的帽类似物为以下结构的任意一种的盐型，所述盐型为下述结构的钠盐、铵盐或三(羟甲基)氨基甲烷形成的盐：
[0022][0023][0024]
本发明所述的pace结构修饰的帽类似物应用，在体外转录反应中将rna加帽，用于线性mrna的体外转录制备；步骤如下：
[0025]
步骤(1)：制备dna模板；
[0026]
步骤(2)：进行体外转录反应，所述反应体系中含有rna聚合酶、核苷三膦酸和所述的pace结构修饰的帽类似物。
[0027]
本发明所述的pace结构修饰的帽类似物的构象更加稳定，不易被核酸酶识别和水解。因此，pace结构的帽类似物具有以下优势：(1)ivt产量以及加帽效率高；(2)目标mrna的翻译效率高。
[0028]
术语解释
[0029]
本发明中的“碱基”、“天然碱基”和“核苷碱基”可以互换使用，包括但不限于腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)、或胸腺嘧啶(t)。
[0030]“修饰的碱基”和“修饰的核苷碱基”可以互换使用，是指天然碱基的一个或两个以上氢被取代而得到的物质，例如包括但不限于7-甲基鸟嘌呤。
[0031]
本发明中的“核糖结构”包括但不限于及其异构体、衍生物等，的任一官能团被取代的结构、及其异构体、衍生物等。
[0032]
本发明中的“三膦酸酯链段”包括但不限于
及其异构体、衍生物、盐等，其中x1、x2、x3中的一个或多个为-cooh、-ch2cooh、取代或未取代的烷基-cooh、取代或未取代的o-cooh、取代或未取代的o-烷基-cooh、取代或未取代的烷基-o-烷基-cooh等。
[0033]
本发明中的“膦酸酯链段”包括但不限于及其异构体、衍生物、盐等，其中x4为-cooh、-ch2cooh、取代或未取代的烷基-cooh、取代或未取代的o-cooh、取代或未取代的o-烷基-cooh、取代或未取代的烷基-o-烷基-cooh等。
具体实施方式：
[0034]
实施例
[0035]
合成部分
[0036]
实施例1：以中间体a和b为原料的pace结构修饰的帽类似物的合成方法
[0037]
将中间体a(2.0mol)悬浮在含有zncl2(20.0mol)的dmf溶液中，冰浴下将中间体b(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应24小时后，用10l的0.25m edta-na2溶液终止反应。将混合物装载到deae sephadex柱上。将产物使用0-1.0m的氯化钠水溶液线性梯度洗脱，纳滤除盐，浓缩得目标产物，反应路线流程，如下方程式：
[0038][0039]
其中，中间体a通过以下步骤得到：
[0040]
(1)称取50.0g鸟苷，溶解在500.0ml的磷酸三甲酯中，反应液冷却至0℃，氮气氛围下缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.)。0℃下搅拌4小时后，加水淬灭反应。用二氯甲烷洗涤两次除去大部分磷酸三甲酯。水相减压浓缩除去残留有机溶剂后用反相制备液相色谱纯化后浓缩得中间体a1。
[0041]
(2)将中间体a1，三苯基膦(2.0eq.)，2,2
’‑
二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在dmf中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4m的高氯酸钠丙酮溶液中，析出固体，抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体a2。
[0042]
(3)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水dmf中后室温搅拌5分钟。将中间体a2分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25m edta-na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体a3。
[0043]
(4)将中间体a3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2m的氢氧化钠调节ph不超过5，hplc检测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体a4。
[0044]
(5)将中间体a4，三苯基膦(2.0eq.)，2,2
’‑
二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在dmf中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4m的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体a。反应路线流程，如下方程式。
[0045][0046]
其中，化合物b通过以下步骤得到：
[0047]
(1)称取200.0g的含pace结构的2’ome-ra亚磷酰胺单体和n
2-异丁酰基-2’,3
’‑
乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0l的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。检测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。检测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。检测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体b1。
[0048]
(2)将中间体b1溶解在乙腈(10v)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-n,n-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中，室温反应1小时。检测反应结束后旋干，在旋瓶中加入甲醇(5v)和dbu(2.5eq.)室温反应4小时后加入浓氨水(5v)，室温反应14小时，检测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体b，反应路线流程，如下方程式：
[0049][0050]
实施例2：以中间体c和d为原料的pace结构修饰的帽类似物的合成方法
[0051]
以中间体c和d为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例2的帽类似物。反应路线流程，如下方程式：
[0052]
[0053]
其中，化合物c通过以下步骤得到：
[0054]
(1)将50g n
2-异丁酰基-2’,3
’‑
乙酰基鸟苷溶解在二氯甲烷(10v)中，加入1.8eq.的中间体c1、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。点板检测n
2-异丁酰基-2’,3
’‑
乙酰基鸟苷消失后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中，室温反应1小时。检测反应结束后分别用10％亚硫酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤反应液，有机相浓缩得到中间体c2。
[0055]
(2)中间体c2溶解在甲醇(5v)中，加入dbu(2.5eq.)室温反应4小时后加入浓氨水(5v)，室温反应14小时，检测反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体c3。
[0056]
(3)将中间体c3溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2m的氢氧化钠调节ph不超过5，hplc检测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体c。
[0057][0058]
其中，化合物d通过以下步骤得到：
[0059]
(1)称取200.0g的2’ome-ra亚磷酰胺单体和n
2-异丁酰基-2’,3
’‑
乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0l的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。检测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。检测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。检测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体d1。
[0060]
(2)将中间体d1溶解在乙腈(10v)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-n,n-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中，室温反应1小时。检测反应结束后旋干，在旋瓶中加入甲醇和浓氨水(10v,1:1)，室温反应14小时，检测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体d2。
[0061]
(3)将中间体d2，三苯基膦(2.0eq.)，2,2
’‑
二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在dmf中氮气氛围下室温搅拌15小时。反应结束后将反应液缓慢加入到4m的高氯酸钠丙酮溶液中，析出固体，抽滤后滤饼用丙酮充分洗涤得中间体d3。
[0062]
(4)将磷酸三乙胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水dmf中后室温搅拌5分
钟。将中间体a3分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用10倍体积的0.25m edta-na2溶液终止反应。反应液用离子色谱纯化得到中间体d4。
[0063]
(5)将中间体d4，三苯基膦(2.0eq.)，2,2
’‑
二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在dmf中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4m的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体d。反应路线流程，如下方程式
[0064][0065]
实施例3：以中间体e和f为原料的pace结构修饰的帽类似物的合成方法
[0066]
以中间体e和f为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例3的帽类似物。反应路线流程，如下方程式：
[0067][0068]
其中，化合物e通过以下步骤得到：
[0069]
(1)将中间体a1溶解在20倍体积的纯化水中，反应液冷却至4℃，缓慢滴加硫酸二甲酯(6.0eq.)，过程中用2m的氢氧化钠调节ph不超过5，hplc检测反应，反应结束后用二氯甲烷洗涤后，水相用离子色谱纯化得到中间体e1。
[0070]
(2)将中间体e1，三苯基膦(2.0eq.)，2,2
’‑
二硫二吡啶(2.0eq.)，咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在dmf中氮气氛围下室温搅拌10小时，反应结束后将反应液缓慢加入到4m的高氯酸钠丙酮溶液中析出固体，抽滤，滤饼用丙酮充分洗涤得中间体e。反应路线流程，如下方程式
[0071][0072]
其中，化合物f通过以下步骤得到：将磷酰基乙酸(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)悬浮在无水dmf中后室温搅拌5分钟。将中间体d3分批加入到反应液中，室温搅拌5小时。反应结束后用用10倍体积的0.25m edta-na2溶液终止反应。
[0073]
反应液用离子色谱纯化得到中间体f。
[0074][0075]
实施例4：以中间体a和h为原料的pace结构修饰的帽类似物的合成方法
[0076]
以中间体a和h为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例4的帽类似物。反应路线流程，如下方程式：
[0077][0078]
其中，化合物h通过以下步骤得到：
[0079]
(1)将50g中间体d1溶解在二氯甲烷(10v)中，加入1.8eq.的中间体c1、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。点板检测中间体d1消耗完全后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中，室温反应1小时。检测反应结束后分别用10％亚硫酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤反应液，有机相浓缩得到中间体h1。
[0080]
(2)中间体h1溶解在甲醇(5v)中，加入dbu(2.5eq.)后室温反应4小时，加入浓氨水(5v)室温反应14小时，检测反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体h。
[0081][0082]
实施例5：以中间体a和i为原料的pace结构修饰的帽类似物的合成方法
[0083]
以中间体a和i为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例5的帽类似物。反应路线流程，如下方程式：
[0084][0085]
其中，化合物i通过以下步骤得到：
[0086]
(1)将30g中间体b1溶解在二氯甲烷(10v)中，加入1.8eq.的中间体c1、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。点板检测中间体b1消耗完全后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中，室温反应1小时。检测反应结束后分别用10％亚硫酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤反应液，有机相浓缩得到中间体i1。
[0087]
(2)中间体i1溶解在甲醇(5v)中，加入dbu(2.5eq.)室温反应4小时后加入浓氨水(5v)，室温反应14小时，检测反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体i。
[0088][0089]
实施例6：以中间体a和j为原料的pace结构修饰的帽类似物的合成方法
[0090]
以中间体a和j为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到实施例6的帽类似物。反应路线流程，如下方程式：
[0091][0092]
其中，化合物j通过以下步骤得到：
[0093]
(3)称取150.0g的含pace衍生结构的2’ome-ra亚磷酰胺单体和n
2-异丁酰基-2’,3
’‑
乙酰基鸟苷(1.0eq.)于单口瓶中，用2.0l的二氯甲烷溶解。氮气鼓吹下加入四氮唑(2.1eq.)，25℃反应3小时。检测反应结束后，将70％的叔丁基过氧化氢水溶液滴加到反应液中，25℃反应1小时。检测反应结束后，向反应液滴加三氯乙酸(4.0eq.)的二氯甲烷溶液，室温反应1小时。检测反应结束后，反应液分别用10％亚硫酸钠水溶液，10％碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤后，有机相浓缩后用柱层析纯化得到中间体j1。
[0094]
(4)将中间体j1溶解在乙腈(10v)中，加入1.8eq.的双(2-氰乙基)-n,n-二异丙基亚磷酰胺、1.8eq.的四氮唑后氮气氛围下室温搅拌2小时。反应结束后将70％的叔丁基过氧化氢水溶液(1.2eq.)滴加到反应液中，室温反应1小时。检测反应结束后旋干，在旋瓶中加
入甲醇(5v)和dbu(2.5eq.)室温反应4小时后加入浓氨水(5v)，室温反应14小时，检测反应，反应结束后旋干。粗品用离子色谱纯化后浓缩得到中间体j，反应路线流程，如下方程式：
[0095][0096]
对比例1以中间体a和d2为原料的帽类似物的合成方法
[0097]
以中间体a和d2为原料，参考实施例1目标产物的合成方法得到对比例1的帽类似物。反应路线流程，如下方程式：
[0098][0099]
生物活性检测
[0100]
1、mrna体外转录产量及加帽效率的测定
[0101]
利用pace结构修饰的帽类似物进行mrna的体外合成：线性内切酶酶切质粒；抽提线性化dna模板；体外转录合成mrna。分别使用实施例1-6及对比例1的帽类似物作为帽结构。
[0102]
反应体系如表1：
[0103]
表1体外转录反应体系
[0104]
体系用量t7 rna聚合酶50u10x buffer2μl100mm atp1μl100mm gtp1μl100mm ctp1μl100mm n1-me-putp1μl100mm帽类似物1μl无机焦磷酸酶0.05u核酸酶抑制剂20u无菌无酶水补足至20μl模板1μg
[0105]
备注：在实验过程中，首先计算好体系所需物料体积，然后进行加样。首先在体系中加入无菌无酶水，随后依次加入10x buffer、ntps、帽类似物，混匀后轻轻离心，随后加入核酸酶抑制剂、无机焦磷酸酶、t7 rna聚合酶、线性化dna模板，充分混匀后轻轻离心，37℃
孵育2小时后加入dnase i 1u，37℃继续孵育30分钟去除dna模板，使用磁珠纯化方法纯化mrna。无菌无酶水溶解纯化后的mrna，使用nanodrop one仪检测mrna产量。
[0106]
液相色谱质谱法(lc-ms)被用来检测不同起始帽类似物的mrna的ivt加帽率；首先需要设计一段与转录产物mrna起始碱基匹配的具有标记的dna探针，通常的标记为biotin标记，将链霉亲和素标记的磁珠清洗后与合成的dna探针、mrna及10
×
rnase h reaction buffer室温室温孵育30分钟，边孵育边缓慢混匀，随后加入20ul rnase h(5u/ul)孵育37℃3h，每半个小时混匀一次。孵育结束后对磁珠进行清洗，清洗完成后的磁珠加入100μl加热到80℃的75％甲醇，混合物在加热板上加热到80℃，保持3分钟，然后放置磁力架上吸取上清，使用蒸发离心机在室温下干燥45分钟至10μl。然后将样品重新悬浮在50μl的100μm edta/1％ meoh中，即可用于lc-ms分析，确定转录反应中rna的加帽情况。由于加帽与非加帽的碱基在分子量上有明显区别，利用分子质量差别即可判定不同帽类似物起始的mrna转录的加帽率。
[0107]
由表2可知，实施例1-6pace结构修饰的帽类似物均能转录为相应的目标mrna，且实施例1-6的pace结构修饰的帽类似物的产量和加帽率显著优于对比例1。
[0108]
表2 mrna的体外转录产量以及加帽率
[0109]
编号产量(μg)加帽率(％)实施例110898.3实施例210797.5实施例311098.2实施例49697.8实施例510295.0实施例610495.7对比例19893.5
[0110]
2、mrna的翻译效率的检测
[0111]
以egfp编码序列为dna模板，利用实施例1-6及对比例1的帽类似物为起始进行体外转录，体外转录合成的mrna转染293t细胞。
[0112]
293t细胞以(0.5-1)
×
105个细胞进行铺板(24孔板)，推荐使用在50代以内的细胞进行转染实验。要求在转染前24小时对细胞再次传代，在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。转染时细胞密度一般60-80％为佳，每孔转染2μgmrna，转染试剂选用lipofectamine messengermax transfection reagent(invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37℃，co2培养箱中，转染4-6小时后，更换为新鲜的完全培养基。在37℃的co2培养箱箱中孵育24小时以后，荧光显微镜观察gfp的荧光强度。
[0113]
结果见表3，实施例1-6经体外转录合成的mrna在细胞内翻译成蛋白质的效率明显高于对比例1，同时均未引起明显的细胞死亡。上述试验数据表明本技术中的pace结构修饰的帽类似物可高效应用于体外转录mrna和细胞内蛋白表达。
[0114]
表3细胞内mrna的翻译表达效率
[0115]

技术特征：
1.一种pace结构修饰的帽类似物，所述帽类似物的结构具备两端的核苷碱基或修饰的核苷碱基，中间的三个核糖结构和连接核糖结构的三膦酸酯链段或膦酸酯链段，其特征在于，所述三膦酸酯链段或膦酸酯链段具有1个或以上的pace结构或pace衍生结构，所述pace结构或pace衍生结构符合以下结构通式：所述pace结构的x是-ch2cooh或其盐；所述pace衍生结构的x是-cooh、取代或未取代的烷基-cooh或其盐、取代或未取代的o-烷基-cooh或其盐、取代或未取代的烷基-o-cooh或其盐、取代或未取代的烷基-o-烷基-cooh或其盐；以上所述烷基的碳数不大于7；以上所述取代基是指碳数不大于7的烷基、烯基、炔基、环烷基或环烯基。2.根据权利要求1所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，所述盐是指钠盐、铵盐或与三(羟甲基)氨基甲烷形成的盐。3.根据权利要求1或2所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，所述x为烷基-cooh或其盐，所述烷基的c原子数为1、2、3或4。4.根据权利要求1或2所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，所述x为o-烷基-cooh，所述烷基的c原子数为1、2、3或4。5.根据权利要求1-4任一所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，其符合以下结构通式：其中，r1、r2和r3分别独立地为h、oh、烷基或o-烷基；x1、x2、x3和x4中的任意一个、两个或多个为权利要求1所述的x，其余各自独立地为h、oh、nh2、烷基、o-烷基、n-烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或卤素；b1和b2分别独立地为天然的、修饰的或非天然的核苷碱基。6.根据权利要求5任一所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，b1和b2分别独立地为腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)、胸腺嘧啶(t)。7.根据权利要求6所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，b1和b2分别独立地为腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)。8.根据权利要求1-7任一所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，其为以下结构的任意一种：
9.根据权利要求1-7任一所述的pace结构修饰的帽类似物，其特征在于，其为以下结构的任意一种的盐型，所述盐型为下述结构的钠盐、铵盐或三(羟甲基)氨基甲烷形成的盐：10.权利要求1-9中的任一项所述的pace结构修饰的帽类似物应用，其特征在于，在体
外转录反应中将rna加帽，用于线性mrna的体外转录制备。11.根据权利要求10所述应用，其特征在于，应用步骤如下：步骤(1)：制备dna模板；步骤(2)：进行体外转录反应，所述反应体系中含有rna聚合酶、核苷三膦酸和所述的pace结构修饰的帽类似物。

技术总结
本发明公开了一种PACE结构修饰的帽类似物，所述PACE结构修饰的帽类似物，是基于现有帽类似物结构中，具备两端的核糖碱基或修饰的核糖碱基，中间的三个核糖结构和连接核糖结构的三膦酸酯链段或膦酸酯链段，在所述三膦酸酯链段或膦酸酯链段，构建具有1个或以上的PACE结构或PACE衍生结构，即是在三膦酸或膦酸上具有取代或未取代的（烷氧）烷基-COOH或其盐，不但提高了IVT产量和加帽效率，而且提高了目标mRNA的翻译效率。mRNA的翻译效率。


技术研发人员：黄磊 赵万年 沈奇 肖潇
受保护的技术使用者：江苏申基生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/8/9