用于可视化检测ONOO

py
+
，探针的结构式为：
8.上述荧光探针的合成路线为：
[0009][0010]
上述荧光探针的制备方法，步骤为：
[0011]
(1)将氢氧化钠水溶液中加入丙酮，在冰水浴下，将盐酸羟胺溶于氢氧化钠水溶液中，反应0.5h～3h，然后冰浴条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯，室温搅拌1h～4h，抽滤后用水洗和石油醚洗，二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，旋干得到化合物1；其中盐酸羟胺、丙酮和对甲基苯磺酰氯按照当量为1：(2～4)：(0.5～1.5)的比例添加；
[0012]
(2)在n2保护下，将氢化钠溶于无水四氢呋喃中，再加入6-甲氧基-1-萘满酮的无水四氢呋喃溶液，然后迅速加入步骤(1)制得的化合物1的无水四氢呋喃溶液，搅拌10min后，再置于30～80℃加热反应10h～14h，用水淬灭后，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到化合物2；其中6-甲氧基-1-萘满酮、化合物1和氢化钠按照当量为1：(1～2)：(2～4)比例添加；
[0013]
(3)步骤(2)制得的化合物2和吡啶-4-甲醛在n2保护下，溶于无水二氯甲烷中，加入三氟乙酸，30～50℃加热搅拌过夜，再加入四氯苯醌搅拌10min～1h，冰浴条件下加入n,n-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，室温搅拌1h～5h，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，旋干，柱层析分离得到化合物3；其中化合物2、吡啶-4-甲醛和四氯苯醌按照当量为1：(0.5～1)：(0.5～1)比例添加；
[0014]
(4)将得到的化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于乙腈中，85℃加热回流反应，加热反应12h～24h，旋干，用甲苯洗，多次重结晶得到荧光探针；其中化合物3和4-溴甲
基苯硼酸频哪醇酯按照当量为1：(1～3)比例添加。
[0015]
上述步骤(1)中，化合物1的结构式如下：
[0016]
上述步骤(2)中化合物2的结构式如下：
[0017]
上述步骤(3)中化合物3的结构式如下：
[0018]
上述的荧光探针在制备可视化专一检测onoo-的试剂中的应用。
[0019]
本发明具有以下有益效果：
[0020]
1、本技术基于氟硼二吡咯甲川(bodipy)染料和苄基苯硼酸酯基团构建专一检测onoo-的近红外荧光探针，该探针在溶液测试中，利用紫外和荧光光谱可判断出探针与onoo-的反应时间，浓度依赖性关系；在通过选择性和抗干扰能力测试中，结果表明探针可专一性检测onoo-，不与其他活性氧化物反应且抗干扰能力强；并且探针的ph稳定性强，细胞毒性小。同时通过荧光成像技术达到对hepg2细胞以及非酒精性脂肪肝和糖尿病小鼠模型中onoo-检测的目的。
[0021]
2、本技术的荧光探针与onoo-反应后可靶向脂滴并具有近红外发射和良好的生物相容性，在细胞和活体中可视化检测非酒精性脂肪肝和糖尿病中onoo-水平，不受其他活性氮和活性氧化物类的干扰；可以检测细胞内外源性onoo-，同时可以检测斑马鱼、非酒精性脂肪肝小鼠和糖尿病小鼠中onoo-的水平波动，检测信号明显，为近红外增强型荧光探针。该检测过程简便、快速、灵敏，检测限为240nm；其在生物监测领域具有良好的应用前景。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]
图1为荧光探针bdp-b-py
+
的核磁氢谱图。
[0024]
图2为荧光探针bdp-b-py
+
的核磁碳谱图。
[0025]
图3为荧光探针bdp-b-py
+
与onoo-作用的紫外吸收变化。
[0026]
图4为荧光探针bdp-b-py
+
与onoo-作用的荧光光谱变化。
[0027]
图5为荧光探针bdp-b-py
+
与onoo-作用的时间响应变化。
[0028]
图6为荧光探针bdp-b-py
+
测定onoo-浓度滴定实验荧光变化。
[0029]
图7为荧光最强发射波长661nm与onoo-的浓度线性拟合图。
[0030]
图8为常见活性氧对探针bdp-b-py
+
检测onoo-的荧光选择性。
[0031]
图9为常见活性氧对探针bdp-b-py
+
检测onoo-的荧光干扰性。
[0032]
图10为荧光探针bdp-b-py
+
和探针加onoo-在不同ph缓冲溶液中最大荧光强度变化图。
[0033]
图11为荧光探针bdp-b-py
+
检测onoo-的细胞毒性。
[0034]
图12为荧光探针bdp-b-py
+
的亚细胞定位能力。
[0035]
图13为荧光探针bdp-b-py
+
检测hepg2细胞外源性onoo-的选择性细胞成像图。
[0036]
图14为荧光探针bdp-b-py
+
检测hepg2细胞外源性onoo-的浓度梯度细胞成像图。
[0037]
图15为荧光探针bdp-b-py
+
检测hepg2细胞内源性onoo-的细胞成像图。
[0038]
图16为荧光探针bdp-b-py
+
检测细胞糖尿病模型中onoo-的细胞成像图。
[0039]
图17为荧光探针bdp-b-py
+
检测onoo-的活体内安全性实验。
[0040]
图18为荧光探针bdp-b-py
+
检测斑马鱼中内外源性onoo-的活体成像
[0041]
图19为荧光探针bdp-b-py
+
可视化成像非酒精性脂肪肝小鼠模型中onoo-水平变化。
[0042]
图20为荧光探针bdp-b-py
+
成像非酒精性脂肪肝小鼠模型的主要器官。
[0043]
图21为非酒精性脂肪肝小鼠模型的肝组织切片图像。
[0044]
图22为荧光探针bdp-b-py
+
可视化成像糖尿病小鼠模型中onoo-水平变化。
具体实施方式
[0045]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0046]
实施例1
[0047]
本实施例的荧光探针的制备步骤如下：
[0048]
(1)化合物1的制备
[0049][0050]
将氢氧化钠水溶液中加入丙酮，在冰水浴下，将盐酸羟胺溶于氢氧化钠水溶液中，反应1h，然后冰浴条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯，盐酸羟胺、丙酮和对甲基苯磺酰氯按照当量为1：2.7：0.9比例溶于氢氧化钠水溶液中，室温搅拌2h，抽滤后用水洗和石油醚洗，二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，旋干得到化合物1；
[0051]
(2)化合物2的制备
[0052][0053]
在n2保护下，将氢化钠溶于无水四氢呋喃中，再加入6-甲氧基-1-萘满酮的无水四氢呋喃溶液，然后迅速加入步骤(1)制得的化合物1的无水四氢呋喃溶液，6-甲氧基-1-萘满酮、化合物1、和氢化钠按照当量为1：1.2：3比例溶于无水四氢呋喃中，搅拌10min后，再置于50℃加热反应12h，用水淬灭后，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到化合物2；
[0054]
(3)化合物3的制备
[0055][0056]
在n2保护下，将步骤(2)制得的化合物2和吡啶-4-甲醛溶于无水二氯甲烷中，加入三氟乙酸，30℃加热搅拌过夜，再加入四氯苯醌搅拌30min，化合物2、吡啶-4-甲醛和四氯苯醌按照当量为1：1：1比例溶于无水二氯甲烷中，冰浴条件下加入n,n-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，室温搅拌2h，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，旋干，柱层析分离得到化合物3；
[0057]
(4)探针bdp-b-py
+
的制备
[0058][0059]
将步骤(3)制得的化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯按照当量为1：2比例溶于乙腈中，85℃加热回流反应，加热反应24h，旋干，用甲苯洗，五次重结晶得到荧光探针bdp-b-py
+
。
[0060]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.42(d,j＝6.0hz,2h),8.58(d,j＝9.0hz,2h),8.54(d,j＝6.0hz,2h),7.77(d,j＝7.5hz,2h),7.50(d,j＝7.5hz,2h),7.04
–
6.97(m,4h),6.04(s,2h),3.86(s,6h),2.85(s,4h),2.54(s,4h),1.33(s,6h),1.31(s,12h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ161.25,153.26,150.70,146.61,144.05,137.98,135.66,134.79,132.43,131.41,131.14,130.09,128.27,120.57,114.71,113.12,84.42,55.90,30.33,25.15,20.19,13.05.
[0061]
实施例2
[0062]
本实施例的探针的制备步骤如下：
[0063]
(1)化合物1的制备
[0064]
将氢氧化钠水溶液中加入丙酮，在冰水浴下，将盐酸羟胺溶于氢氧化钠水溶液中，反应0.5h，然后冰浴条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯，盐酸羟胺、丙酮和对甲基苯磺酰氯按照当量为1：2：0.5比例溶于氢氧化钠水溶液中，室温搅拌1h，抽滤后用水洗和石油醚洗，二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，旋干得到化合物1；
[0065]
(2)化合物2的制备
[0066]
在n2保护下，将氢化钠溶于无水四氢呋喃中，再加入6-甲氧基-1-萘满酮的无水四氢呋喃溶液，然后迅速加入步骤(1)制得的化合物1的无水四氢呋喃溶液，6-甲氧基-1-萘满酮、化合物1、和氢化钠按照当量为1：1：2比例溶于无水四氢呋喃中，搅拌10min后，再置于30℃加热反应10h，用水淬灭后，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到化合物2；
[0067]
(3)化合物3的制备
[0068]
在n2保护下，将步骤(2)制得的化合物2和吡啶-4-甲醛溶于无水二氯甲烷中，加入三氟乙酸，40℃加热搅拌过夜，再加入四氯苯醌搅拌10min，化合物2、吡啶-4-甲醛和四氯苯醌按照当量为1：0.5：0.5比例溶于无水二氯甲烷中，冰浴条件下加入n,n-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，室温搅拌1h，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，旋干，柱层析分离得到化合物3；
[0069]
(4)探针bdp-b-py
+
的制备
[0070]
将步骤(3)制得的化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯按照当量为1：1比例溶于乙腈中，85℃加热回流反应，加热反应12h，旋干，用甲苯洗，重结晶得到荧光探针bdp-b-py
+
。
[0071]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.42(d,j＝6.0hz,2h),8.58(d,j＝9.0hz,2h),8.54(d,j＝6.0hz,2h),7.77(d,j＝7.5hz,2h),7.50(d,j＝7.5hz,2h),7.04
–
6.97(m,4h),6.04(s,2h),3.86(s,6h),2.85(s,4h),2.54(s,4h),1.33(s,6h),1.31(s,12h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ161.25,153.26,150.70,146.61,144.05,137.98,135.66,134.79,132.43,131.41,131.14,130.09,128.27,120.57,114.71,113.12,84.42,55.90,30.33,25.15,20.19,13.05.
[0072]
实施例3
[0073]
本技术的荧光探针的制备步骤如下：
[0074]
(1)化合物1的制备
[0075]
将氢氧化钠水溶液中加入丙酮，在冰水浴下，将盐酸羟胺溶于氢氧化钠水溶液中，反应3h，然后冰浴条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯，盐酸羟胺、丙酮和对甲基苯磺酰氯按照当量为1：4：1.5比例溶于氢氧化钠水溶液中，室温搅拌4h，抽滤后用水洗和石油醚洗，二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，旋干得到化合物1；
[0076]
(2)化合物2的制备
[0077]
在n2保护下，将氢化钠溶于无水四氢呋喃中，再加入6-甲氧基-1-萘满酮的无水四氢呋喃溶液，然后迅速加入步骤(1)制得的化合物1的无水四氢呋喃溶液，6-甲氧基-1-萘满酮、化合物1、和氢化钠按照当量为1：2：4比例溶于无水四氢呋喃中，搅拌10min后，再置于80℃加热反应14h，用水淬灭后，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到化合物2；
[0078]
(3)化合物3的制备
[0079]
在n2保护下，将步骤(2)制得的化合物2和吡啶-4-甲醛溶于无水二氯甲烷中，加入三氟乙酸，50℃加热搅拌过夜，再加入四氯苯醌搅拌1h，化合物2、吡啶-4-甲醛和四氯苯醌按照当量为1：0.8：0.8比例溶于无水二氯甲烷中，冰浴条件下加入n,n-二异丙基乙胺和三
氟化硼乙醚，室温搅拌5h，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，旋干，柱层析分离得到化合物3；
[0080]
(4)探针bdp-b-py
+
的制备
[0081]
将步骤(3)制得的化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯按照当量为1：3比例溶于乙腈中，85℃加热回流反应，加热反应18h，旋干，用甲苯洗，五次重结晶得到荧光探针bdp-b-py
+
。
[0082]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.42(d,j＝6.0hz,2h),8.58(d,j＝9.0hz,2h),8.54(d,j＝6.0hz,2h),7.77(d,j＝7.5hz,2h),7.50(d,j＝7.5hz,2h),7.04
–
6.97(m,4h),6.04(s,2h),3.86(s,6h),2.85(s,4h),2.54(s,4h),1.33(s,6h),1.31(s,12h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ161.25,153.26,150.70,146.61,144.05,137.98,135.66,134.79,132.43,131.41,131.14,130.09,128.27,120.57,114.71,113.12,84.42,55.90,30.33,25.15,20.19,13.05.
[0083]
实施例4
[0084]
本技术的荧光探针的制备步骤如下：
[0085]
(1)化合物1的制备
[0086]
将氢氧化钠水溶液中加入丙酮，在冰水浴下，将盐酸羟胺溶于氢氧化钠水溶液中，反应3h，然后冰浴条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯，盐酸羟胺、丙酮和对甲基苯磺酰氯按照当量为1：3：1比例溶于氢氧化钠水溶液中，室温搅拌2h，抽滤后用水洗和石油醚洗，二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，旋干得到化合物1；
[0087]
(2)化合物2的制备
[0088]
在n2保护下，将氢化钠溶于无水四氢呋喃中，再加入6-甲氧基-1-萘满酮的无水四氢呋喃溶液，然后迅速加入步骤(1)制得的化合物1的无水四氢呋喃溶液，6-甲氧基-1-萘满酮、化合物1、和氢化钠按照当量为1：1.5：3比例溶于无水四氢呋喃中，搅拌10min后，再置于55℃加热反应12h，用水淬灭后，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到化合物2；
[0089]
(3)化合物3的制备
[0090]
在n2保护下，将步骤(2)制得的化合物2和吡啶-4-甲醛溶于无水二氯甲烷中，加入三氟乙酸，35℃加热搅拌过夜，再加入四氯苯醌搅拌1h，化合物2、吡啶-4-甲醛和四氯苯醌按照当量为1：0.7：0.9比例溶于无水二氯甲烷中，冰浴条件下加入n,n-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，室温搅拌4h，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，旋干，柱层析分离得到化合物3；
[0091]
(4)探针bdp-b-py
+
的制备
[0092]
将步骤(3)制得的化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯按照当量为1：2.5比例溶于乙腈中，85℃加热回流反应，加热反应20h，旋干，用甲苯洗，三次重结晶得到荧光探针bdp-b-py
+
。
[0093]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.42(d,j＝6.0hz,2h),8.58(d,j＝9.0hz,2h),8.54(d,j＝6.0hz,2h),7.77(d,j＝7.5hz,2h),7.50(d,j＝7.5hz,2h),7.04
–
6.97(m,4h),6.04(s,2h),3.86(s,6h),2.85(s,4h),2.54(s,4h),1.33(s,6h),1.31(s,12h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ161.25,153.26,150.70,146.61,144.05,137.98,135.66,134.79,132.43,131.41,131.14,130.09,128.27,120.57,114.71,113.12,84.42,55.90,30.33,25.15,20.19,13.05.
[0094]
实施例5
[0095]
本技术的荧光探针的制备步骤如下：
[0096]
(1)化合物1的制备
[0097]
将氢氧化钠水溶液中加入丙酮，在冰水浴下，将盐酸羟胺溶于氢氧化钠水溶液中，反应3h，然后冰浴条件下缓慢加入对甲基苯磺酰氯，盐酸羟胺、丙酮和对甲基苯磺酰氯按照当量为1：2.5：0.8比例溶于氢氧化钠水溶液中，室温搅拌2h，抽滤后用水洗和石油醚洗，二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，旋干得到化合物1；
[0098]
(2)化合物2的制备
[0099]
在n2保护下，将氢化钠溶于无水四氢呋喃中，再加入6-甲氧基-1-萘满酮的无水四氢呋喃溶液，然后迅速加入步骤(1)制得的化合物1的无水四氢呋喃溶液，6-甲氧基-1-萘满酮、化合物1、和氢化钠按照当量为1：1.2：2.5比例溶于无水四氢呋喃中，搅拌10min后，再置于70℃加热反应12h，用水淬灭后，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，柱层析分离得到化合物2；
[0100]
(3)化合物3的制备
[0101]
在n2保护下，将步骤(2)制得的化合物2和吡啶-4-甲醛溶于无水二氯甲烷中，加入三氟乙酸，35℃加热搅拌过夜，再加入四氯苯醌搅拌1h，化合物2、吡啶-4-甲醛和四氯苯醌按照当量为1：0.9：0.7比例溶于无水二氯甲烷中，冰浴条件下加入n,n-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，室温搅拌2h，二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，旋干，柱层析分离得到化合物3；
[0102]
(4)探针bdp-b-py
+
的制备
[0103]
将步骤(3)制得的化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯按照当量为1：1.5比例溶于乙腈中，85℃加热回流反应，加热反应15h，旋干，用甲苯洗，三次重结晶得到荧光探针bdp-b-py
+
。
[0104]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.42(d,j＝6.0hz,2h),8.58(d,j＝9.0hz,2h),8.54(d,j＝6.0hz,2h),7.77(d,j＝7.5hz,2h),7.50(d,j＝7.5hz,2h),7.04
–
6.97(m,4h),6.04(s,2h),3.86(s,6h),2.85(s,4h),2.54(s,4h),1.33(s,6h),1.31(s,12h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ161.25,153.26,150.70,146.61,144.05,137.98,135.66,134.79,132.43,131.41,131.14,130.09,128.27,120.57,114.71,113.12,84.42,55.90,30.33,25.15,20.19,13.05.
[0105]
实施效果例
[0106]
以实施例1制备的荧光探针进行性能测试：
[0107]
(1)溶液中检测onoo-的荧光探针bdp-b-py
+
的反应时间测试
[0108]
用二甲基亚砜(dmso)配制1mm bdp-b-py
+
的荧光探针储备液；探针bdp-b-py
+
(10μm)与onoo-(100μm)在溶液体系为pbs缓冲液(10mm，ph 7.4，50％ch3cn)中进行反应，如图5所示，从时间动力学曲线观察bdp-b-py
+
在30s内与onoo-快速响应，并在1min内达到最大荧光值，反应曲线达到平台；同时，探针在紫外吸收和荧光光谱图中反应前后发生了蓝移和显著荧光增强(见图3和图4所示)。
[0109]
(2)溶液中检测onoo-的荧光探针bdp-b-py
+
的浓度滴定测试以及浓度线性关系
[0110]
在浓度滴定实验中，发现随着onoo-的浓度逐渐增加，661nm处的荧光峰也逐渐增强，其荧光强度在onoo-浓度至100μm时达到最大(见图6所示)。
[0111]
以onoo-浓度为横坐标，探针bdp-b-py
+
在661nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行线性拟合，得到该探针的线性回归方程为：y＝0.395x+1.832，线性相关系数r2＝0.995
并计算出检测限为240nm(见图7所示)。
[0112]
(3)溶液中检测onoo-的荧光探针bdp-b-py
+
的选择性和抗干扰性实验
[0113]
在不同的荧光比色皿中，分别加入4ml pbs缓冲液(10mm，ph 7.4，50％ ch3cn)和40μl荧光探针储备液，如图8所示，当探针bdp-b-py
+
分别加入上述选择的活性氮以及活性氧化物分析物种(100μm)后(0:free,1:onoo-,2:ocl-,3:h2o2,4:
˙
oh,5:
˙ot
bu,6:tbhp,7:1o2,8:no,9:no
2-,10:hcy,11:gsh,12:cys,13:hs-,14:so
42-,15:so
32-,16:ca
2+
,17:mg
2+
,18:cu
2+
)，探针bdp-b-py
+
可以对onoo-进行专一性识别，与onoo-反应后在661nm处出现明亮的红色荧光，而跟其它种类分析物反应后没有荧光出现，所以，探针可以实现专一性响应onoo-。当bdp-b-py
+
(10μm)在分别加入上述分析物(0:free,1:ocl-,2:h2o2,3:
˙
oh,4:
˙ot
bu,5:tbhp,6:1o2,7:no,8:no
2-,9:hcy,10:gsh,11:cys,12:hs-,13:so
42-,14:so
32-,15:ca
2+
,16:mg
2+
,17:cu
2+
)后再加入100μm onoo-反应2min后，可以看出onoo-在与各种分析物共存情况下，bdp-b-py
+
在复杂的溶液体系内依然能够专一性检测到onoo-，且荧光程度较强。实验结果证明，bdp-b-py
+
能够在响应onoo-时不受其它物质的干扰(见图9所示)。
[0114]
(4)ph值的响应性实验
[0115]
将探针bdp-b-py
+
溶于二甲基亚砜中得到1mm探针母液，配置ph为6.0、6.4、6.8、7.2、7.4、7.6、8.0的溶液，对探针以及探针和onoo-反应后荧光强度的变化进行了研究。结果如图10所示，探针荧光强度在ph值为6.0-8.0的溶液中基本保持不变；在加入onoo-后，在不同ph值条件下，其位于661nm处荧光强度保持稳定。实验证明探针bdp-b-py
+
能够适应生物体内的ph环境，且具有良好的稳定性。
[0116]
(5)探针bdp-b-py
+
的细胞毒性实验
[0117]
利用探针bdp-b-py
+
对hepg2细胞的cck-8细胞毒性实验，结果如图11所示，hepg2细胞用含有不同浓度的探针(2,5,10,10,20,30μm)培养液孵育24h后，计算细胞的存活百分比。结果表明，低浓度下细胞存活率可高达90％，探针几乎没有细胞毒性。
[0118]
(6)bdp-b-py
+
在hepg2细胞中脂滴的共定位细胞成像
[0119]
由于bdp-b-py
+
是无荧光的，探针与onoo-发生自消除反应，释放出的近红外荧光染料bdp-tme会在细胞中积累。因此，使用染料bdp-tme进行脂滴的共定位细胞成像，在hepg2细胞中同时孵育染料bdp-tme(10μm)和商售的脂滴共定位染料bodipy
tm 493/503(20μm)30分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像。结果如图12所示，在两个荧光通道中都能清晰观察到脂滴(lds)。实验结果表明bdp-tme的红色荧光和bodipy
tm 493/503的绿色荧光之间有很好的重叠，皮尔逊共定位系数(pcc)为0.88。由此说明染料bdp-b-py可以靶向细胞中的脂滴。
[0120]
(7)检测onoo-的荧光探针对hepg2细胞外源性onoo-的选择性细胞成像
[0121]
检测onoo-的荧光探针bdp-b-py
+
在小鼠肝癌细胞(hepg2细胞)中外源性onoo-的选择性荧光共聚焦成像。结果如图13所示，(a)为探针bdp-b-py
+
(10μm)和hepg2细胞单独孵育30分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次，再加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；(b)、(c)和(d)为hepg2细胞预先加入sin-1、h2o2、hclo(300μm)孵育1小时后，用pbs缓冲液洗涤三次，再加入探针bdp-b-py
+
(10μm)孵育30分钟，然后加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像。通过共聚焦红色通道观察，检测外源性onoo-的荧光探针在hepg2细胞中产生明亮的红
色荧光；对照组实验中，hepg2细胞与其他活性氧共同孵育，由成像实验结果可以观察红色通道荧光响应微弱。由此说明探针可以对细胞外源性onoo-选择性成像。
[0122]
(8)检测onoo-的荧光探针对hepg2细胞外源性onoo-的浓度梯度细胞成像
[0123]
检测onoo-的荧光探针bdp-b-py
+
在hepg2细胞中外源性onoo-的浓度梯度荧光共聚焦成像。结果如图14a所示，(a)为探针bdp-b-py
+
(10μm)和hepg2细胞单独孵育30分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次，再加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；(b)、(c)和(d)为hepg2细胞预先加入不同浓度的sin-1(100μm、300μm、500μm)孵育1小时后，用pbs缓冲液洗涤三次，再加入探针bdp-b-py
+
(10μm)孵育30分钟，然后加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；图14b是荧光成像红色通道的荧光强度柱形图。通过共聚焦红色通道观察，检测外源性onoo-的荧光探针在hepg2细胞中随着sin-1浓度的增加，荧光强度逐渐增加；对照组实验中，hepg2细胞只与bdp-b-py
+
共同孵育，由成像实验结果可以观察红色通道荧光响应微弱。由此说明探针可以检测细胞外源性onoo-的浓度梯度的变化。
[0124]
(9)检测onoo-的荧光探针对hepg2细胞内源性onoo-的细胞成像
[0125]
检测onoo-的荧光探针bdp-b-py
+
在hepg2细胞内源性onoo-的倒置荧光细胞成像。结果如图15a所示，(a)为探针bdp-b-py
+
(10μm)和hepg2细胞单独孵育30分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次，再加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；(b)、(c)、(d)和(e)为hepg2细胞先用脂多糖(lps)和γ-干扰素(ifn-γ)(lps和ifn-γ联用可刺激小鼠单核巨噬细胞产生内源性的onoo-)孵育4小时，再用佛波酯(pma)孵育30分钟，然后(c)、(d)和(e)组细胞分别用n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac，抗氧化剂)、氨基胍(ag,一氧化氮合成酶抑制剂)和2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(tempo，一种超氧自由基清除剂)，用pbs缓冲液洗涤三次，bdp-b-py
+
(10μm)再与细胞共孵育30分钟，再加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；图15b是荧光成像红色通道的荧光强度柱形图。通过共聚焦红色通道观察，检测onoo-的荧光探针在hepg2细胞中产生明亮的红色荧光；对照组实验中，加入nac、ag和tempo使细胞与bdp-b-py
+
共同孵育，由成像实验结果可以观察红色通道荧光响应微弱。由此说明探针可以检测细胞内源性onoo-。该结果也表明，本发明的荧光探针具有检测hepg2细胞内onoo-的良好应用前景。
[0126]
(10)检测onoo-的荧光探针对细胞糖尿病模型中onoo-的细胞成像
[0127]
荧光探针bdp-b-py
+
在hepg2细胞糖尿病模型中onoo-的倒置荧光成像。结果如图16a所示，(a)为探针bdp-b-py
+
(10μm)和hepg2细胞单独孵育30分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次，再加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；(b)、(c)和(d)为hepg2细胞预先加入不同浓度的glucose(1mm、4mm、6mm)孵育3小时后，用pbs缓冲液洗涤三次，再加入探针bdp-b-py
+
(10μm)孵育30分钟，然后加入hoechst 33342(10μl)共孵育10分钟后，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；图16b是荧光成像红色通道的荧光强度柱形图。通过共聚焦红色通道观察，检测糖尿病细胞模型中onoo-的水平在hepg2细胞中随着glucose浓度的增加，荧光强度逐渐增加；对照组实验中，hepg2细胞只与bdp-b-py
+
共同孵育，由成像实验结果可以观察红色通道荧光响应微弱。由此说明探针可以检测糖尿病细胞模型中onoo-的水平变化。
[0128]
(11)检测onoo-的荧光探针的活体内安全性实验
[0129]
利用探针bdp-b-py
+
对昆明小鼠的安全性实验，结果如图17所示，昆明小鼠分为两组，一组小鼠分别尾静脉注射探针bdp-b-py
+
(0.1mg/kg，100μl)持续15天，记录小鼠体重；另一组小鼠分别尾静脉注射生理盐水(100μl)持续15天，记录小鼠体重。结果表明小鼠体重平稳，说明探针bdp-b-py
+
对小鼠体内毒性非常低，可安全用于体内成像。
[0130]
(12)检测onoo-的荧光探针检测斑马鱼中内外源性onoo-的活体成像
[0131]
荧光探针bdp-b-py
+
在斑马鱼中onoo-的荧光共聚焦成像，如图18所示，(a)为斑马鱼与探针bdp-b-py
+
(10μm)共孵育30分钟，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像；(b)为斑马鱼先用sin-1(500μm)孵育1小时，再与探针bdp-b-py
+
(10μm)共孵育30分钟；(c)和(d)为斑马鱼先用lps(1μg/ml)和pma(1μg/ml)孵育1小时，(d)再加入尿酸(ua)(onoo-清除剂，500μm)孵育1小时，用pbs缓冲液洗涤三次，再与探针bdp-b-py
+
(10μm)共孵育30分钟，用pbs缓冲液洗涤三次后显微镜下荧光成像。通过共聚焦红色通道观察，探针bdp-b-py
+
检测斑马鱼内外源性onoo-的水平；对照组实验中，加入尿酸斑马鱼与探针bdp-b-py
+
共同孵育，由成像实验结果可以观察红色通道荧光响应微弱。由此说明探针bdp-b-py
+
可以检测斑马鱼内/外源性onoo-的产生。
[0132]
(13)检测onoo-的荧光探针可视化成像非酒精性脂肪肝小鼠模型中onoo-水平变化
[0133]
nafld的形成过程与lds的积累和氧化应激的密切相关。通过探针检测细胞内onoo-水平的波动和lds的积累可以更准确地诊断nafld的早期过程。首先，将6周龄的昆明小鼠喂食高脂饮食(hfd)2-12周，以建立nafld小鼠模型。在高脂喂养的第2、4、6、8、10、12周尾静脉注射探针bdp-b-py
+
(0.1mg/kg，100μl)，分别进行不同时间(15min、30min、45min、60min)的荧光成像，然后解剖模型小鼠的主要器官进行荧光成像。如图19和20所示，根据nafld小鼠模型60min的荧光成像表明小鼠肝脏中荧光信号随喂食hfd周数增加逐渐增强，并且随着时间延长，荧光强度相比于对照组增强。在解剖的小鼠器官荧光成像图中同样显示出小鼠肝脏中逐渐增加的荧光信号，并且在组织切片的h&e染色和油红o染色中，观察到明显的脂肪变性和lds增加(见图21所示)。结果表明，探针bdp-b-py
+
可以检测nafld小鼠模型中onoo-水平变化。
[0134]
(14)检测onoo-的荧光探针可视化成像糖尿病小鼠模型中onoo-水平变化
[0135]
糖尿病形成过程中活性氧水平升高，高糖可刺激nadph氧化酶产生大量的活性氧，通过建立ⅰ型和ⅱ型糖尿病小鼠模型，进一步探索探针bdp-b-py
+
检测糖尿病小鼠中onoo-水平变化。首先，将c57小鼠禁食12h后，腹腔注射stz(200mg/kg)，5天后测血糖，血糖高于11.1mmol/l，成功建立ⅰ型糖尿病小鼠模型；ⅱ型糖尿病小鼠模型建立需要c57小鼠喂食高脂饲料4周后，禁食12h，腹腔注射stz(50mg/kg)一周时间，测定血糖高于11.1mmol/l即模型成功。分别对空白对照组小鼠以及ⅰ型和ⅱ型糖尿病小鼠尾静脉注射探针bdp-b-py
+
(0.1mg/kg，100μl)，分别进行不同时间(15min、30min、45min、60min)的荧光成像，如图22所示，根据30min的荧光成像结果表明糖尿病组小鼠的荧光信号高于对照组，探针bdp-b-py
+
可以检测到糖尿病小鼠模型中onoo-水平变化。
[0136]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.用于可视化检测onoo
‒
的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：。2.权利要求1所述的用于可视化检测onoo
‒
的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）向氢氧化钠溶液中加入丙酮，在冰水浴下，再加入盐酸羟胺反应后，再缓慢加入对甲基苯磺酰氯，室温搅拌至反应完全，抽滤后用水洗和石油醚洗，再经二氯甲烷萃取、干燥、旋干得到化合物1；（2）在n2保护下，将氢化钠溶于无水四氢呋喃中，再加入6-甲氧基-1-萘满酮的无水四氢呋喃溶液，然后迅速加入步骤（1）制得的化合物1的无水四氢呋喃溶液，搅拌后，进行加热反应，反应结束用水淬灭，经二氯甲烷萃取、干燥、浓缩、柱层析分离得到化合物2；（3）在n2保护下，将步骤（2）制得的化合物2和吡啶-4-甲醛溶于无水二氯甲烷中，加入三氟乙酸，加热搅拌过夜，再加入四氯苯醌搅拌后，于冰浴条件下加入n,n-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚，室温搅拌反应后，经二氯甲烷萃取、干燥、浓缩、旋干、柱层析分离得到化合物3；（4）将步骤（3）制得的化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于乙腈中，加热回流反应后，旋干、用甲苯洗、重结晶得到荧光探针记为bdp-b-py
+
。3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中盐酸羟胺、丙酮和对甲基苯磺酰氯的反应按照当量比1：（2～4）：（0.5～1.5）添加。4.根据权利要求3所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述化合物1的结构式为。5.根据权利要求2-4任一项所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中6-甲氧基-1-萘满酮、化合物1和氢化钠按照当量比1：（1～2）：（2～4）添加。
6.根据权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述化合物2的结构式为。7.根据权利要求6所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中化合物2、吡啶-4-甲醛和四氯苯醌按照当量比1：（0.5～1）：（0.5～1）添加。8.根据权利要求7所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述化合物3的结构式为。9.根据权利要求6-8任一项所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中化合物3和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯按照当量比为1：（1～3）添加。10.权利要求1所述的荧光探针在制备可视化专一检测onoo
‒
的试剂中的应用。

技术总结
本发明属于荧光探针领域，涉及非酒精性脂肪肝和糖尿病的检测试剂，特别是指用于可视化检测ONOO


技术研发人员：张健 赵伟利 鲁小艳 王楠楠 张博 范冠文
受保护的技术使用者：河南大学
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/9