重组大肠杆菌及其构建方法和生产2

重组大肠杆菌及其构建方法和生产2
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岩藻糖基乳糖的方法
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一种重组大肠杆菌、一种大肠杆菌的构建方法、所述方法构建得到的重组大肠杆菌、所述重组大肠杆菌在生产2
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岩藻糖基乳糖及其衍生品中的应用、以及一种生产2
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岩藻糖基乳糖的方法。


背景技术：

2.人乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是一种复合低聚糖，在母乳中以游离形式存在，是母乳中第三大固体成分，具有显著的生物活性，能够有效地提升母乳的营养价值，其中，2
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岩藻糖基乳糖(2
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fucosyllactose，2
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fl)作为母乳中分泌最丰富的人乳寡糖，约占总hmos的30％。
3.目前商业化2
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岩藻糖基乳糖(2
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fl)的生产主要包括化学法合成、酶催化法合成和微生物发酵法三种方式。化学合成法在生产效率和产品纯度上都表现出色，但是它的生产流程繁复，反应条件苛刻，产物收率偏低，l-岩藻糖价格不菲，并且经常需要使用有毒有害的试剂，这些都限制了它的广泛应用。酶合成法具有反应条件温和、反应成分相对简单以及易于纯化等优点，但酶法存在底物成本高以及产物的得率不高等问题，目前尚处于实验室规模。近年来，利用系统生物学、代谢工程和途径工程等技术手段构建微生物基因工程菌生产2
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岩藻糖基乳糖的研究持续受到关注。相比于化学法和酶法，微生物法具有更快的增殖速度，更容易扩大培养，而且能够使用低成本碳源。因此，它已经成为2
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fl绿色合成的首选方式。
4.目前研究较多的是以大肠杆菌作为底盘细胞，其具有代谢产出鸟嘌呤5'-二磷酸-β-l-岩藻糖(5'-diphospho-β-l-fucose，gdp-l-fucose)的2条完整通路(从头合成途径和补救途径)，通过构建代谢合成途径中的关键酶基因，以重组质粒方式进行过量表达，表达外源α-1,2-岩藻糖基转移酶，发酵生产2'-fl。
5.利用微生物代谢途径合成2
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岩藻糖基乳糖的研究集中于合成途径的构建、代谢竞争途径的基因敲除等方面。li等将2
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fl分为gdp-l-岩藻糖合成模块、乳糖岩藻糖基化模块、辅因子再生模块，通过不同的质粒组合来平衡合成途径，获得了22.3g/l的2
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fl。采用模块化代谢工程策略，将合成途径划分为多个模块，对每个模块进行精细的调控，可以有效地解决代谢流平衡问题。现有技术受限于gdp-l-岩藻糖的胞内合成路径产量过低，导致岩藻糖基化人乳寡糖的产量过低，达不到工业化生产的需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种生产2
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岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，该菌株的2
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岩藻糖基乳糖生产水平有显著提高，本发明还提供了重组大肠杆菌的构建方法以及生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，采用本发明所述的重组大肠杆菌生产2
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岩藻糖基乳糖能够在培养90h后生产40.05g/l的2
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fl。
7.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌
含有过表达的甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc；
8.所述重组大肠杆菌中还敲除了udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr。
9.优选地，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌bl21(de3)。
10.优选地，所述重组大肠杆菌中还敲除了d-果糖-6-磷酸醛缩酶b基因fsab、gdp-甘露糖甘露糖基水解酶nudd和d-乳酸脱氢酶基因ldha中的至少一种。
11.本发明第二方面提供一种重组大肠杆菌的构建方法，该方法包括：以大肠杆菌为宿主，向其中导入过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc的质粒，并敲除所述宿主中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr，构建得到所述重组大肠杆菌。
12.本发明第三方面提供如上所述的方法构建得到的重组大肠杆菌。
13.本发明第四方面提供如上所述的重组大肠杆菌在生产2
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岩藻糖基乳糖及其衍生品中的应用。
14.本发明第五方面提供一种生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，该方法包括：利用如上所述的重组大肠杆菌进行培养和诱导发酵生产2
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岩藻糖基乳糖；
15.其中，所述诱导发酵在碳源、底物和诱导剂的存在下进行。
16.本发明通过在大肠杆菌中外源表达futc，组合调控manc、manb、gmd、wcag等酶的相关基因的过表达，并敲除大肠杆菌宿主2
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岩藻糖基乳糖合成途径中的wcaj基因、lon基因、lacz基因、iclr基因以及优选条件下还可以敲除的fsab基因、nudd基因、ldha基因，并优选通过优化通路配置、rbs强度以及融合标签等方式调节基因表达水平，从而达到提高2
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岩藻糖基乳糖产量的目的。
17.采用本发明的代谢工程菌进行5l罐的岩藻糖基化乳糖的发酵生产验证，结果显示，以甘油为底物时，2
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岩藻糖基乳糖(2
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fl)的生产产量可达40.05g/l。
附图说明
18.图1是重组大肠杆菌e20的构建策略图；
19.图2是重组质粒prsf-duet-1-cbgw-f的示意图；
20.图3示出了5l发酵罐生产2
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岩藻糖基乳糖的发酵曲线；
21.图4示出了菌株bwlz01～bwlz15及其发酵结果；
22.图5示出了菌株bwlz13和bwlz16～bwlz18及其发酵结果；
23.图6示出了菌株bwlz16和bwlz19～bwlz25及其发酵结果；
24.图7示出了菌株bwlz25～bwlz29的发酵结果；
25.图8示出了菌株bwlz25和bwlz30～bwlz35的发酵结果；
26.图9示出了菌株bwlz30和e01-e15的发酵结果；
27.图10示出了菌株e09和e16-e20的发酵结果。
具体实施方式
28.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
29.本发明第一方面提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有过表达的甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc；
30.所述重组大肠杆菌中还敲除了udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr。
31.其中，lon蛋白酶为温度敏感的atp依赖性蛋白酶。
32.优选地，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌bl21(de3)。
33.优选地，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因各自独立地来源于大肠杆菌escherichia coli，更优选各自独立地来自于大肠杆菌k-12，更优选地，其核苷酸序列依次如seq id no.1-4所示。
34.优选地，futc基因来源于幽门螺杆菌helicobacter pylori，优选地，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
35.优选地，所述重组大肠杆菌中还敲除了d-果糖-6-磷酸醛缩酶b基因fsab、gdp-甘露糖甘露糖基水解酶nudd和d-乳酸脱氢酶基因ldha中的至少一种。
36.优选地，所述α-1,2岩藻糖基转移酶的n端带有融合标记。优选地，所述融合标记为三个天冬氨酸标记。在所述优选的情况下，能够进一步提高重组大肠杆菌生产2
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fl的能力。编码所述ddd的核苷酸序列优选为gatgatgat。
37.优选地，所述过表达是基因在松弛型质粒载体上表达。优选地，所述松弛型质粒载体的拷贝数为20以上，更优选为40以上，进一步优选为80拷贝以上，比如可以为80、90、100、110、120拷贝以及任意两个值之间组成的任意范围。
38.载体可以为本领域常规的松弛型质粒载体，比如为prsfduet-1、petduet-1或pcdfduet-1，优选地，松弛型质粒载体为prsfduet-1。在优选的情况下，能够进一步提高重组大肠杆菌生产2
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fl的能力。
39.在本发明的一种优选的实施方式中，通过组合调控manb、manc、gmd、wcag以及futc的表达来提高大肠杆菌产2
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岩藻糖基乳糖能力。调控表达是将gdp-l-岩藻糖的从头合成途径(过表达manc、manb、gmd以及wcag)作为模块ⅰ，gdp-l-岩藻糖与乳糖的岩藻糖基化途径(过表达futc)作为模块ⅱ，采用通过不同拷贝数组合和不同的通路配置改变模块的表达强度。
40.在一种实施方式中，过表达是将模块ⅰ基因在载体的mcsⅰ(多克隆位点i)以操纵子形式表达。
41.在一种实施方式中，过表达是将模块ⅱ基因在载体的mcsⅱ(多克隆位点ⅱ)表达。
42.所述过表达也可以是将模块ⅰ基因在载体的mcsⅱ表达，模块ⅱ基因在载体的mcsⅰ表达。
43.优选地，过表达的manc基因、manb基因、gmd基因、wcag基因和futc基因同时位于
prsf-duet-1载体上。也即，这五种基因以单质粒组合的形式存在。
44.优选地，prsf-duet-1载体上，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因以操纵子形式连接由单一启动子调控(所述启动子优选为t7启动子)，futc基因由另一个启动子调控(所述启动子优选为t7启动子)。
45.在本发明的一种优选的实施方式中，通过调节模块ⅰ操纵子基因顺序，调节模块ⅰ核糖体结合位点强度等手段，提高大肠杆菌产2
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岩藻糖基乳糖能力。
46.优选地，prsf-duet-1载体上，gmd基因和wcag基因排列在前，manc基因和manb基因排列在后。
47.优选地，gmd基因和wcag基因的相对表达水平高于manc基因和manb基因相对表达水平。
48.优选地，gmd基因和wcag基因的rbs(核糖体结合位点)各自独立地为rbs-wt，将manc基因和manb基因的rbs各自独立地为rbs-34。
49.在本发明的一种实施方式中，核糖体结合位点rbs-34、rbs-ori、rbs-wt(manb)、rbs-wt(manc)、rbs-wt(gmd)和rbs-wt(wcag)的核苷酸序列依次为seq id no.6～11。
50.在一种实施方式中，prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-(ddd)f载体，也即，编码模块ⅰ的操纵子基因(rwt)gmd(rwt)wcag(r34)manc(r34)manb的核苷酸序列如seq id no.12所示。其中，rwt为基因gmd、wcag、manc、manb在e.coli k-12mg1655基因组上的野生型核糖体结合位点，g代表gmd，w代表wcag，c代表manc，b代表manb，f代表futc。
51.本发明第二方面提供一种重组大肠杆菌的构建方法，该方法包括：以大肠杆菌为宿主，向其中导入过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc的质粒，并敲除所述宿主中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr，构建得到所述重组大肠杆菌。
52.优选地，所述重组大肠杆菌中还敲除了d-果糖-6-磷酸醛缩酶b基因fsab、gdp-甘露糖甘露糖基水解酶nudd和d-乳酸脱氢酶基因ldha中的至少一种。其中，还敲除了ldha的构建策略图可以参见图1。
53.优选地，通过ptargetf载体进行基因的敲除。
54.优选地，利用松弛型质粒载体进行基因的过表达。
55.优选地，所述松弛型质粒载体为prsf-duet-1载体。
56.优选地，manc基因、manb基因、gmd基因、wcag基因和futc基因同时位于prsf-duet-1载体上。
57.关于各个基因的调控表达方式可以参见第一方面，在此不再赘述。
58.本发明第三方面提供如上所述的方法构建得到的重组大肠杆菌。
59.本发明第四方面提供如上所述的重组大肠杆菌在生产2
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岩藻糖基乳糖及其衍生品中的应用。
60.其中，2
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岩藻糖基乳糖的衍生品比如可以为gdp-l-岩藻糖、3-岩藻糖基乳糖。
61.本发明第五方面提供一种生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，该方法包括：利用如上所述的重组大肠杆菌进行培养和诱导发酵生产2
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岩藻糖基乳糖；
62.其中，所述诱导发酵在碳源、底物和诱导剂的存在下进行。
63.所述重组大肠杆菌可以按照本领域常规的方式先进行活化和扩培，比如可以在lb液体培养基中，35-40℃条件下培养4-12h，扩培得到种子液，得到的种子液可以以0.1-10体积％的接种量接种到发酵培养基中进而进行培养和诱导发酵。
64.优选地，所述发酵培养基中含有碳源。
65.优选地，所述碳源选自甘油、葡萄糖和蔗糖中的至少一种，更优选为甘油。
66.优选地，甘油的初始加入量使得体系中的甘油含量为15-30g/l。也即，发酵培养基中的初始甘油含量为15-30g/l。
67.在本发明的一种优选的实施方式中，所述发酵培养基包含：15-30g/l甘油、5-15g/l酵母浸粉、1-4g/l酪氨酸、6-8g/l na2hpo4、2-4g/l kh2po4、0.5-1.5g/l nh4cl、0.5-1.5g/l氯化钠、1-2g/l硫酸镁、5-15mg/l维生素b1和1-3g/l柠檬酸。
68.优选地，所述发酵培养基中还包含微量金属元素。优选地，以100l发酵液的体积计，所述发酵液中包含5-15g feso4·
7h2o、1-4g znso4·
7h2o、0.1-2g cuso4·
5h2o、0.1-0.8g mnso4·
h2o、0.1-0.5g na2b4o7·
10h2o、0.05-0.2g(nh4)6mo7o
24
和1-3g cacl2。可以先将微量金属元素溶于盐酸(如2-8m盐酸)，用氢氧化钠调至ph6.5-7，在超净工作台过滤灭菌。
69.优选地，所述培养的条件包括：温度为30-40℃，ph为6.5-7.2。
70.所述培养的时间没有特别的限制，比如可以经培养使得重组大肠杆菌进入对数生长期，时间为8-16h。
71.在进入诱导培养时，向发酵培养基中添加底物和诱导剂，并降低温度。优选地，所述底物为乳糖。乳糖的初始添加量可以在较宽的范围内选择，比如可以使得体系中乳糖的初始浓度为5-15g/l。
72.优选地，所述诱导剂为iptg(也即，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)。优选地，所述诱导剂的添加量使得体系中诱导剂的浓度为0.2-1mm。
73.优选地，所述诱导发酵的条件包括：温度为20-30℃，ph为6.5-7.2。可通过氨水调节ph。
74.优选地，所述诱导发酵的方式为补料分批发酵。优选地，所述诱导发酵过程中，保持发酵体系中的乳糖浓度在3-10g/l范围内。
75.采用甘油溶氧级联添加甘油补料，比如将溶氧控制在20-30％范围内。
76.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
77.以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实例中所使用的质粒、pcr试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、dna胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。质粒和dna产物的测序工作交予北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
78.本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
79.所有的实验重复3次，实验结果表示为：“平均值
±
标准差”。使用origin 2022、adobe illustrator 2022软件作图。
80.菌液od的测定：根据菌液的生长情况选择合适的稀释倍数，使得测定值在0.2-0.88的范围内，使用分光光度计测量600nm波长下的吸光度表征细胞密度od
600
。
81.2'-fl、乳糖和甘油浓度的测定：通过配备碳水化合物分析柱(rezex roa有机酸，phenomenex，t orrance，ca)和折射率(ri)检测器的高效液相色谱(hplc)(agilent t echnies 1100series，usa)测定。采用60℃加热的色谱柱对培养液进行分析。流动相为5mm的h2so4溶液，流速为0.6ml/min；进样量为20μl。将标品稀释成不同浓度，hplc检测各个浓度的峰面积，以峰面积为y轴，物质含量浓度为x轴，绘制标准品的标准曲线。
82.其中，2
′‑
fl的标准曲线为：y＝223225.73x-1845.312，r2＝0.99993；
83.其中，乳糖的标准曲线为：y＝329116.032x+14725.032，r2＝0.99991；
84.其中，甘油的标准曲线为：y＝276367.829x+23392.699，r2＝0.99986。
85.lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸提物，5g/l nacl。
86.tb培养基：11.8g/l胰蛋白胨，23.6g/l酵母提取物，9.4g/l k2hpo4，2.2g/l kh2po4，20g/l甘油。
87.抗生素浓度：卡那霉素50mg/l，链霉素50mg/l。
88.所述发酵培养基包含：20g/l甘油、10g/l酵母浸粉、2g/l酪氨酸、6.8g/l na2hpo4、3.0g/l kh2po4、1.0g/l nh4cl、1.0g/l氯化钠、1.4g/l硫酸镁、10mg/l维生素b1和1.7g/l柠檬酸，还含10ml/l微量金属元素。其中，微量金属元素包含：10g/l feso4·
7h2o、2.2g/l znso4·
7h2o、1.0g/l cuso4·
5h2o、0.38g/l mnso4·
h2o、0.23g/l na2b4o7·
10h2o、0.1g/l(nh4)6mo7o
24
和2.0g/l cacl2。微量金属元素溶于5m盐酸，用氢氧化钠调至ph6.8，在超净工作台过滤灭菌。
89.实施例1
90.本实施例用于说明大肠杆菌bl21(de3)染色体组基因wcaj、lon、lacz、iclr、ldha的敲除。
91.利用crispr-cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌bl21(de3)基因组中wcaj、lon、lacz、iclr和ldha基因，具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1)：
92.(1)以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，使用引物对wcaj-l-f/r和wcaj-r-f/r，lon-l-f/r和lon-r-f/r，lacz-l-f/r和lacz-r-f/r，iclr-l-f/r和iclr-r-f/r，ldha-l-f/r和ldha-r-f/r通过pcr分别扩增出wcaj、lon、lacz、iclr、ldha的上下游片段，胶回收。再分别以wcaj、lon、lacz、iclr、ldha上下游片段为模板，采用wcaj-l-f和wcaj-r-r，lon-l-f和lon-r-r，lacz-l-f和lacz-r-r，iclr-l-f和iclr-r-r，ldha-l-f和ldha-r-r引物通过重叠pcr得到完整的wcaj、lon、lacz、iclr、ldha模板，胶回收dna片段。
93.(2)以原始ptargetf质粒(addgene:#62226)为模板，wcaj-sg-f/r，lon-sg-f/r，lacz-sg-f/r，iclr-sg-f/r和ldha-sg-f/r为引物，采用pcr扩增将原始质粒上的n20序列分别替换为与wcaj、lon、lacz、iclr和ldha序列互补的n20序列，分别得到带有靶向wcaj、lon、lacz、iclr和ldha的各种ptargetf质粒(即带有wcaj、lon、lacz、iclr和ldha特异性n20序列的靶向质粒ptargetf)。转化e.coli trans1-t1感受态，涂布lb平板(含链霉素)，37℃扩大培养提取质粒并测序。
94.(3)取pcas质粒(addgene:#60847)及大肠杆菌bl21(de3)感受态，取pcas质粒及大肠杆菌电转感受态，冰上放置5min至感受态融化，取500ng质粒加入100μl感受态细胞中，轻
轻混匀。冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上2min。加入1ml lb培养基，于30℃，200r/min培养1h。取200μl浓缩菌液，均匀涂布于lb平板(卡那霉素抗性)上，30℃倒置培养16-20h，菌落pcr验证后，含pcas质粒的大肠杆菌成功构建。将阳性克隆菌落挑至5ml lb液体试管，过夜培养。将过夜培养的种子液以2％接种量，接入到30ml lb液体培养基中，于30℃，200r/min培养2～3h后，在菌体od
600
为0.2时加入终浓度为20mm l-阿拉伯糖诱导λ-red重组酶的表达。培养4h后，当od
600
达到0.6时，制备bl21(de3)/pcas电转感受态。
95.(4)取500ng ptargetf质粒和1000ng的模板dna片段，电转入上述大肠杆菌bl21(de3)/pcas感受态中，涂布于lb平板(卡那霉素和链霉素双抗性)，30℃培养16-20h，挑取单克隆进行测序验证。
96.(5)将上述阳性克隆菌落挑至5ml lb液体试管，加入终浓度为1mm iptg和30mg/l卡那霉素，30℃培养12h，划线lb固体平板(卡那霉素抗性)，30℃培养24h。将平板上长出单菌落继续划线lb固体平板(卡那霉素和链霉素双抗性)，在单抗性平板上生长，在双抗性平板上不长的菌落，菌落pcr验证是否去除ptargetf质粒。将去除ptargetf质粒的单菌落挑至无抗lb液体试管，42℃培养12h，划线无抗平板，长出的单菌落继续划线平板(卡那霉素抗性)。在无抗平板上生长，而在卡那霉素抗性的平板上不生长的单菌落，菌落pcr验证pcas质粒是否去除。成功得到基因组敲除wcaj基因的大肠杆菌bl21(de3)δwcaj，以大肠杆菌bl21(de3)δwcaj为宿主菌。
97.(6)利用上述相同策略，结合步骤(2)中获得的带有lon特异性n20序列的靶向质粒ptargetf和1000ng的供体dna片段(即步骤(1)得到的完整的lon模板)，敲除大肠杆菌bl21(de3)δwcaj基因组的lon基因，得到相应的大肠杆菌bl21(de3)δwcajδlon。
98.(7)以步骤(6)构建的大肠杆菌工程菌bl21(de3)δwcajδlon为出发菌株，通过参照步骤(2)～(5)操作，最终构建获得工程化大肠杆菌bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclrδldha。
99.表1基因敲除引物
100.[0101][0102]
实施例2
[0103]
本实施例从头合成路径的重组大肠杆菌过表达基因的构建。
[0104]
选择来自e.coli k-12mg1655的manb、manc、gmd、wcag基因，选择来自h.pylori 26695的futc基因(genebank:ky499613.1)。其中安徽通用生物技术公司通过对futc基因进行优化和合成，以满足大肠杆菌密码子偏好性的要求。
[0105]
重组菌过表达基因的构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表2)：
[0106]
(1)prsf-cb载体构建：以prsfduet-1质粒为模版通过引物mcs
ⅰ‑
up、mcs
ⅰ‑
down进行pcr反应将质粒线性化，片段cb以e.coli k-12mg1655基因组为模板通过引物mcs
ⅰ‑
cb-f、mcs
ⅰ‑
cb-r进行目的基因的扩增。pcr产物通过凝胶电泳法确定扩增片段大小，然后对片段和质粒进行组装。将无缝克隆的反应液转入克隆宿主e.coli trans1-t1中。在37℃下培养12h后，挑选单菌落进行菌落pcr验证，并通过测序进一步确定序列阳性转化子，得到构建成功的质粒prsf-cb。
[0107]
(2)prsf-cbgw载体构建：以prsf-cb为模板通过引物mcs
ⅰ‑
up、cbgw-down进行pcr反应将质粒线性化，片段gw以e.coli k-12mg1655基因组为模板通过引物cbgw-f、cbgw-r进行目的基因的扩增。pcr产物通过凝胶电泳法确定扩增片段大小，然后对片段和质粒进行组装。将无缝克隆的反应液转入克隆宿主e.coli trans1-t1中。在37℃下培养12h后，挑选单菌落进行菌落pcr验证，并通过测序进一步确定序列阳性转化子，得到构建成功的质粒prsf-cbgw。
[0108]
(3)prsf-cbgw-f载体构建：委托安徽通用生物科技有限公司合成来源于幽门螺杆菌的2
′‑
岩藻糖基乳糖合成酶futc基因序列至载体pcdf-f上。以prsf-cbgw为模板通过引物mcs
ⅱ‑
up、mcs
ⅱ‑
down进行pcr反应将质粒线性化，片段f以pcdf-f为模板通过引物mcs
ⅱ‑
f-f、mcs
ⅱ‑
f-r进行目的基因的扩增。pcr产物通过凝胶电泳法确定扩增片段大小，然后对片段和质粒进行组装。将无缝克隆的反应液转入克隆宿主e.coli trans1-t1中。在37℃下培养12h后，挑选单菌落进行菌落pcr验证，并通过测序进一步确定序列阳性转化子，得到构
建成功的质粒prsf-cbgw-f(重组质粒prsf-duet-1-cbgw-f的示意图见图2)。
[0109]
(4)prsf-gwcb-f载体构建：以prsf-cbgw-f为模板通过引物mcs
ⅰ‑
up、mcs
ⅰ‑
down进行pcr反应将质粒线性化；片段cb以e.coli k-12mg1655基因组为模板通过引物c-manc-f、mcs
ⅰ‑
cb-r进行目的基因的扩增，片段gw以e.coli k-12mg1655基因组为模板通过引物mcs
ⅰ‑
gw-f、gw-r进行目的基因的扩增，然后将片段cb、gw进行重叠pcr组装成片段gwcb；然后对片段和质粒进行组装。将无缝克隆的反应液转入克隆宿主e.coli trans1-t1中。在37℃下培养12h后，挑选单菌落进行菌落pcr验证，并通过测序进一步确定序列阳性转化子，得到构建成功的质粒prsf-gwcb-f。
[0110]
(5)prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-f载体构建：以prsf-gwcb-f质粒为基础，采用引物wt-g-f/r将gmd、wcag的rbs替换高强度rwt，采用引物w-rbs34-c-f/r将manc的rbs替换为低强度r34，采用引物c-rbs34-b-f/r将manb的rbs替换为低强度r34构建prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-f载体。
[0111]
(6)prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-(ddd)f载体构建：以prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-f为模板，采用引物ddd-f/r扩增质粒，回收片段后直接转入克隆宿主e.coli trans1-t1中。在37℃下培养12h后，挑选单菌落进行菌落pcr验证，并通过测序进一步确定序列阳性转化子，得到构建成功的prsf-(rwt)gw(r34)c(r34)b-(ddd)f载体。
[0112]
(7)将步骤(6)获得的prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-(ddd)f载体转入实施例1中获得的大肠杆菌bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclrδldha中，得到重组大肠杆菌e20(其构建策略图如图1所示)。
[0113]
表2重组质粒构建引物
[0114][0115][0116]
实施例3
[0117]
本实施例用于说明采用本发明所述的重组大肠杆菌摇瓶发酵合成2
′‑
岩藻糖乳糖的方法。
[0118]2′‑
岩藻糖基乳糖发酵过程：将实施例2制备得到的重组大肠杆菌e20接种于lb液体培养基，37℃，200rpm，过夜培养12h，作为种子液以2体积％的接种量接入50ml tb培养基，37℃，220rpm，培养至od
600
为0.6～0.8，加入终浓度为0.8mm iptg，同时加入10g/l乳糖，25℃，220rpm诱导培养96h。
[0119]
取1ml发酵液，100℃煮沸5min，12000rpm，离心5min，取上清用于hplc测定。
[0120]
诱导发酵过程中，固定时间取样，利用hplc仪检测本发明的重组大肠杆菌e20发酵生成2
′‑
岩藻糖基乳糖的量，结果显示96h发酵后，50ml摇瓶中2
′‑
fl产量达到5.25g/l。
[0121]
实施例4
[0122]
本实施例用于说明采用本发明所述的重组大肠杆菌在5l罐发酵合成2
′‑
岩藻糖乳糖的方法。
[0123]
将实施例2构建的重组大肠杆菌e1接种至150ml含有相应抗生素的lb培养基中，37℃，220rpm培养12h获得一级种子液，转接300μl至300ml含有相应抗生素的lb培养基中培养6h得到二级种子液。将二级种子液转入3l发酵培养基中，37℃，300～1000rpm转速培养至菌液od
600
为20，加入终浓度为0.8mm的iptg和底物乳糖9g/l，并将溶氧控制在20～30％，采用甘油溶氧级联添加补料液(当溶氧高于30％时甘油自动泵入发酵罐以补充碳供应)，当乳糖浓度低于3～5g/l时，补充乳糖，并降低温度至25℃进入诱导发酵；整个发酵过程采用50％氨水调控ph为6.5-7.2。
[0124]
诱导发酵过程中，固定时间取样，利用hplc仪检测重组大肠杆菌发酵生成2
′‑
岩藻糖基乳糖的量，检测结果如图3所示。结果显示，在90h发酵后，5l发酵罐2
′‑
fl的产量达到了40.05g/l。
[0125]
实施例5
[0126]
本实施例用于说明组合模块化调控2'-岩藻糖基乳糖代谢通路的方法。
[0127]
根据本领域常规的方式，并参照实施例2所述的方法，构建质粒或质粒组合，并将质粒或质粒组合导入底盘宿主e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlacz，构建了菌株bwlz02～bwlz15，并进行摇瓶发酵，具体如图4所示。其中，图4a示出了包含有不同质粒组合的菌株bwlz01～bwlz15(其中，质粒prsfduet-1、petduet-1和pcdfduet-1的复制子分别为rsf1030、pbr322和clodf13)；图4b示出了菌株bwlz01～bwlz15的发酵结果。
[0128]
摇瓶发酵的方法包括：取-80℃超低温冰箱保存的少许甘油菌液或挑取lb平板上单菌落于试管lb液体培养基中，37℃、200rpm下培养12h作为种子液。按照2％(v/v)接种量转接种子液到装液量为30ml的tb培养基中，37℃、220r/min下培养至细胞密度为0.6～0.8，加入iptg使其终浓度为0.2mm，间隔取样，设置3个平行，培养96h结束。
[0129]
其中，菌株bwlz01～bwlz15对应的质粒或质粒组合依次为prsf-cb-gw(基因簇组合形式)+pet-f、prsf-cbgw(操纵子组合形式)+pet-f、prsf-cb-gw(基因簇组合形式)+pcdf-f、prsf-cbgw(操纵子组合形式)+pcdf-f、pet-cb-gw(基因簇组合形式)+prsf-f、pet-cbgw(操纵子组合形式)+prsf-f、pet-cb-gw(基因簇组合形式)+pcdf-f、pet-cbgw(操纵子组合形式)+pcdf-f、pcdf-cb-gw(基因簇组合形式)+prsf-f、pcdf-cbgw(操纵子组合形式)+prsf-f、pcdf-cb-gw(基因簇组合形式)+pet-f、pcdf-cbgw(操纵子组合形式)+pet-f、prsf-cbgw-f(单质粒组合形式)、pet-cbgw-f(单质粒组合形式)、pcdf-cbgw-f(单质粒组合形式)。
[0130]
通过实验发现，在组合模块调节代谢通量中，高拷贝质粒组合优于低拷贝质粒组合，操纵子组合优于基因簇组合，单质粒组合优于双质粒组合。prsf-cbgw-f(单质粒组合形式)是15种不同拷贝数模块组合中产量最高的，菌株bwlz13的2'-fl产量为2.56g/l。
[0131]
实施例6
[0132]
本实施例用于说明优化模块代谢通量调控2'-岩藻糖基乳糖产生的方法。
[0133]
根据本领域常规的方式，并参照实施例2所述的方法，以bwlz(e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlacz)为出发菌株，按照表3所述的质粒构建相应的菌株bwlz16～bwlz35，并根据实施例5所述的方法对构建好的菌株进行摇瓶发酵。
[0134]
表3菌株和质粒
[0135]
[0136][0137]
其中，图5示出了菌株bwlz16～bwlz18及其发酵结果，bwlz17中manb的核糖体结合位点由bwlz16野生型核糖体结合位点替换为更弱的duet系列质粒原始的核糖体结合位点rt7。从图5中能够看出，在模块ⅰ操纵子中gmd-wcag排列在前，manc-manb排列在后能够提高2'-fl生物合成的效率。另一方面，当manb的核糖体结合位点(rbs)由bwlz16中野生型rbs(rwt)替换为更弱的质粒原始的rbs(rt7)时，菌株bwlz17的2'-fl产量远低于菌株bwlz16，而仅仅在菌株bwlz17的质粒基础上调整manc和manb的排列顺序，菌株bwlz18中2'-fl的产量相比于菌株bwlz17明显提升。
[0138]
图6示出了菌株bwlz16和bwlz19～bwlz25及其发酵结果；结果显示，基因gmd-wcag相对表达水平高，基因manc-manb相对表达水平低有利于2'-fl的合成。
[0139]
图7示出了菌株bwlz25～bwlz29的发酵结果；结果显示基因futc在强度高t7启动子调控下，2'-fl产量更高。
[0140]
图8示出了菌株bwlz25和bwlz30～bwlz35的发酵结果，结果显示，对比于菌株bwlz25发酵结果，ddd标签的结果是正向的且提高了7.2％。
[0141]
实施例7
[0142]
本实施例用于说明敲除旁路基因调控2'-岩藻糖基乳糖产生的方法。
[0143]
根据本领域常规的方式，参照实施例1所述的方法，以e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlacz为底盘宿主进行基因敲除，分别敲除pfka基因(编码6-磷酸果糖激酶-1)、pfkb基因(编码6-磷酸果糖激酶-2)、fsaa基因(编码d-果糖-6-磷酸醛缩酶a)、fsab基因(编码d-果糖-6-磷酸醛缩酶b)、mtld基因(编码甘露醇-1-磷酸脱氢酶)、nudd基因(编码gdp-甘露糖甘露糖基水解酶)、nudk基因(编码gdp-甘露糖水解酶)、arca基因(编码厌氧氧化还原控制因子)、iclr基因(编码乙醛酸操纵子阻遏蛋白)、pflb基因(编码丙酮酸甲酸裂解酶)、pta-acka基因(编码磷酸乙酰基转移酶、乙酸激酶)、ldha基因(编码d-乳酸脱氢酶)、poxb基因(编码丙酮酸氧化酶)、gor基因(编码谷胱甘肽还原酶)、waaf基因(编码脂多糖庚糖基转移酶ⅱ)，将质粒prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-(ddd)f分别导入上述菌株中，得到菌株e01-e15，并根据实施例5所述的方法进行摇瓶发酵，其发酵结果如图9所示，结果显示敲除了pfkb、fsab、nudd、pflb、ldha基因后，2'-fl的产量均得到提升。
[0144]
以e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclr为底盘宿主，选取上一步中对2'-fl的产量正向提升的旁路基因进行敲除，分别构建了菌株e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclrδpfkb、e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclrδfsab、e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclrδnudd、e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclrδpflb、e.coli bl21(de3)δwcajδlonδlaczδiclrδldha，然后将质粒prsf-(rwt)g(rwt)w(r34)c(r34)b-(ddd)f分别导入上述菌株中，得到重组菌株e16～e20，并根据实施例5所述的方法进行摇瓶发酵，其发酵结果如图10所示，结果显示，进一步敲除fsab、nudd和ldha基因后，其生物量略有降低，但2'-fl的产量却相当或略有提高，比如e20。
[0145]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
[0146]
序列表
[0147]
seq id no.1：
[0148]
atgaaaaaattaacctgctttaaagcctatgatattcgcgggaaattaggcgaagaactgaatgaagatatcgcctggcgcattggtcgcgcctatggcgaatttctcaaaccgaaaaccattgtgttaggcggtgatgtccgcctcaccagcgaaaccttaaaactggcgctggcgaaaggtttacaggatgcgggcgttgacgtgctggatattggtatgtccggcaccgaagagatctatttcgccacgttccatctcggcgtggatggcggcattgaagttaccgccagccataatccgatggattataacggcatgaagctggttcgcgagggggctcgcccgatcagcggagataccggactgcgcgacgtccagcgtctggctgaagccaacgactttcctcccgtcgatgaaaccaaacgcggtcgctatcagcaaatcaacctgcgtgacgcttacgttgatcacctgttcggttatatcaatgtcaaaaacctcacgccgctcaagctggtgatcaactccgggaacggcgcagcgggtccggtggtggacgccattgaagcccgctttaaagccctcggcgcgcccgtggaattaat
caaagtgcacaacacgccggacggcaatttccccaacggtattcctaacccactactgccggaatgccgcgacgacacccgcaatgcggtcatcaaacacggcgcggatatgggcattgcttttgatggcgattttgaccgctgtttcctgtttgacgaaaaagggcagtttattgagggctactacattgtcggcctgttggcagaagcattcctcgaaaaaaatcccggcgcgaagatcatccacgatccacgtctctcctggaacaccgttgatgtggtgactgccgcaggtggcacgccggtaatgtcgaaaaccggacacgcctttattaaagaacgtatgcgcaaggaagacgccatctatggtggcgaaatgagcgcccaccattacttccgtgatttcgcttactgcgacagcggcatgatcccgtggctgctggtcgccgaactggtgtgcctgaaagataaaacgctgggcgaactggtacgcgaccggatggcggcgtttccggcaagcggtgagatcaacagcaaactggcgcaacccgttgaggcgattaaccgcgtggaacagcattttagccgtgaggcgctggcggtggatcgcaccgatggcatcagcatgacctttgccgactggcgctttaacctgcgcacctccaataccgaaccggtggtgcgcctgaatgtggaatcgcgcggtgatgtgccgctgatggaagcgcgaacgcgaactctgctgacgttgctgaacgagtaa
[0149]
seq id no.2：
[0150]
atggcgcagtcgaaactctatccagttgtgatggcaggtggctccggtagccgcttatggccgctttcccgcgtactttatcccaagcagtttttatgcctgaaaggcgatctcaccatgctgcaaaccaccatctgccgcctgaacggcgtggagtgcgaaagcccggtggtgatttgcaatgagcagcaccgctttattgtcgcggaacagctgcgtcaactgaacaaacttaccgagaacattattctcgaaccggcagggcgaaacacggcacctgccattgcgctggcggcgctggcggcaaaacgtcatagcccggagagcgacccgttaatgctggtattggcggcggatcatgtgattgccgatgaagacgcgttccgtgccgccgtgcgtaatgccatgccatatgccgaagcgggcaagctggtgaccttcggcattgtgccggatctaccagaaaccggttatggctatattcgtcgcggtgaagtgtctgcgggtgagcaggatatggtggcctttgaagtggcgcagtttgtcgaaaaaccgaatctggaaaccgctcaggcctatgtggcaagcggcgaatattactggaacagcggtatgttcctgttccgcgccggacgctatctcgaagaactgaaaaaatatcgcccggatatcctcgatgcctgtgaaaaagcgatgagcgccgtcgatccggatctcaattttattcgcgtggatgaagaagcgtttctcgcctgcccggaagagtcggtggattacgcggtcatggaacgtacggcagatgctgttgtggtgccgatggatgcgggctggagcgatgttggctcctggtcttcattatgggagatcagcgcccacaccgccgagggcaacgtttgccacggcgatgtgattaatcacaaaactgaaaacagctatgtgtatgctgaa tctggcctggtcaccaccgtcggggtgaaagatctggtagtggtgcagaccaaagatgcggtgctgattgccgaccgtaacgcggtacaggatgtgaaaaaagtggtcgagcagatcaaagccgatggtcgccatgagcatcgggtgcatcgcgaagtgtatcgtccgtggggcaaatatgactctatcgacgcgggcgaccgctaccaggtgaaacgcatcaccgtgaaaccgggcgagggcttgtcggtacagatgcaccatcaccgcgcggaacactgggtggttgtcgcgggaacggcaaaagtcaccattgatggtgatatcaaactgcttggtgaaaacgagtccatttatattccgctgggggcgacgcattgcctggaaaacccggggaaaattccgctcgatttaattgaagtgcgctccggctcttatctcgaagaggatgatgtggtgcgtttcgcggatcgctacggacgggtgtaa
[0151]
seq id no.3：
[0152]
atgtcaaaagtcgctctcatcaccggtgtaaccggacaagacggttcttacctggcagagtttctgctggaaaaaggttacgaggtgcatggtattaagcgtcgcgcatcgtcattcaacaccgagcgcgtggatcacatttatcaggatccgcacacctgcaacccgaaattccatctgcattatggcgacctgagtgatacctctaacctgacgcgcattttgcgtgaagtacagccggatgaagtgtacaacctgggcgcaatgagccacgttgcggtctcttttgagtcaccagaatataccgctgacgtcgacgcgatgggtacgctgcgcctgctggaggcgatccgcttcctcggtctggaaaagaaaactcgtttctatcaggcttccacctctgaactgtatggtctggtgcaggaaattccgcagaaagagaccacgccgttctacccgcgatctccgtatgcggtcgccaaactgtacgcctactggatcaccgttaactaccgtgaatcctacggcatgtacgcctgtaacggaattctcttcaaccatgaatccccgcgccgcggcgaaaccttcgttacccgcaaaatcacccg
cgcaatcgccaacatcgcccaggggctggagtcgtgcctgtacctcggcaatatggattccctgcgtgactggggccacgccaaagactacgtaaaaatgcagtggatgatgctgcagcaggaacagccggaagatttcgttatcgcgaccggcgttcagtactccgtgcgtcagttcgtggaaatggcggcagcacagctgggcatcaaactgcgctttgaaggcacgggcgttgaagagaagggcattgtggtttccgtcaccgggcatgacgcgccgggcgttaaaccgggtgatgtgattatcgctgttgacccgcgttacttccgtccggctgaagttgaaacgctgctcggcgacccgaccaaagcgcacgaaaaactgggctggaaaccggaaatcaccctcagagagatggtgtctgaaatggtggctaatgacctcgaagcggcgaaaaaacactctctgctgaaatctcacggctacgacgtggcgatcgcgctggagtcataa
[0153]
seq id no.4：
[0154]
atgagtaaacaacgagtttttattgctggtcatcgcgggatggtcggttccgccatcaggcggcagctcgaacagcgcggtgatgtggaactggtattacgcacccgcgacgagctgaacctgctggacagccgcgccgtgcatgatttctttgccagcgaacgtattgaccaggtctatctggcggcggcgaaagtgggcggcattgttgccaacaacacctatccggcggatttcatctaccagaacatgatgattgagagcaacatcattcacgccgcgcatcagaacgacgtgaacaaactgctgtttctcggatcgtcctgcatctacccgaaactggcaaaacagccgatggcagaaagcgagttgttgcagggcacgctggagccgactaacgagccttatgctattgccaaaatcgccgggatcaaactgtgcgaatcatacaaccgccagtacggacgcgattaccgctcagtcatgccgaccaacctgtacgggccacacgacaacttccacccgagtaattcgcatgtgatcccagcattgctgcgtcgcttccacgaggcgacggcacagaatgcgccggacgtggtggtatggggcagcggtacaccgatgcgcgaatttctgcacgtcgatgatatggcggcggcgagcattcatgtcatgg agctggcgcatgaagtctggctggagaacacccagccgatgttgtcgcacattaacgtcggcacgggcgttgactgcactatccgcgagctggcgcaaaccatcgccaaagtggtgggttacaaaggccgggtggtttttgatgccagcaaaccggatggcacgccgcgcaaactgctggatgtgacgcgcctgcatcagcttggctggtatcacgaaatctcactggaagcggggcttgccagcacttaccagtggttccttgagaatcaagaccgctttcgggggtaa
[0155]
seq id no.5：
[0156]
atggcgtttaaagtggtgcaaatttgcggaggcttgggtaaccaaatgtttcagtacgccttcgctaaaagtttgcaaaagcattccaacacgccggtgctgctcgatatcactagctttgattggtctgatcgcaaaatgcaactggaactttttccgattgacttgccatacgcctcggcgaaagagatcgcgatcgctaaaatgcagcacctcccgaagctagtccgcgatgcactgaagtgcatgggcttcgaccgcgtgtctcaagaaatcgttttcgaatacgagccgaagcttctcaagccaagccgcctcacttatttcttcggctacttccaggacccacgatactttgatgctatctcccctttaatcaagcaaaccttcaccctgccacccccccccgaaaacaacaagaataataataagaaagaggaagagtatcagtgcaagctttcactcatcctcgccgctaagaatagcgtgtttgttcacatccgtcgcggtgactatgtcggcattggctgtcagctgggtattgattaccagaagaaggctcttgagtacatggcaaagcgcgtgccaaacatggaacttttcgtgttttgcgaagatctggaattcacacagaaccttgaccttggataccctttcatggatatgaccacccgtgacaaggaggaagaagcgtactgggacatgctgctcatgcagtcttgccagcacggcattatcgcaaactccacctattcgtggtgggcagcgtacttgatcgagaacccagaaaagattattattggccctaaacactggttgttcgggcacgaaaacatcctgtgtaaagagtgggtgaaaatcgaatcccatttcgaggtcaaatcccagaagtataacgcataa
[0157]
seq id no.6：
[0158]
aaagaggagaaa
[0159]
seq id no.7：
[0160]
aagaaggaga
[0161]
seq id no.8：
[0162]
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[0163]
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[0164]
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[0165]
seq id no.10：
[0166]
acgcgaacgcgttgaaactgaataaattcaaaaatacagaggaataatac
[0167]
seq id no.11：
[0168]
tgctgaaatctcacggctacgacgtggcgatcgcgctggagtcataaatg
[0169]
seq id no.12：
[0170]
acgcgaacgcgttgaaactgaataaattcaaaaatacagaggaataatactataccatggatgtcaaaagtcgctctcatcaccggtgtaaccggacaagacggttcttacctggcagagtttctgctggaaaaaggttacgaggtgcatggtattaagcgtcgcgcatcgtcattcaacaccgagcgcgtggatcacatttatcaggatccgcacacctgcaacccgaaattccatctgcattatggcgacctgagtgatacctctaacctgacgcgcattttgcgtgaagtacagccggatgaagtgtacaacctgggcgcaatgagccacgttgcggtctcttttgagtcaccagaatataccgctgacgtcgacgcgatgggtacgctgcgcctgctggaggcgatccgcttcctcggtctggaaaagaaaactcgtttctatcaggcttccacctctgaactgtatggtctggtgcaggaaattccgcagaaagagaccacgccgttctacccgcgatctccgtatgcggtcgccaaactgtacgcctactggatcaccgttaactaccgtgaatcctacggcatgtacgcctgtaacggaattctcttcaaccatgaatccccgcgccgcggcgaaaccttcgttacccgcaaaatcacccgcgcaatcgccaacatcgcccaggggctggagtcgtgcctgtacctcggcaatatggattccctgcgtgactggggccacgccaaagactacgtaaaaatgcagtggatgatgctgcagcaggaacagccggaagatttcgttatcgcgaccggcgttcagtactccgtgcgtcagttcgtggaaatggcggcagcacagctgggcatcaaactgcgctttgaaggcacgggcgttgaagagaagggcattgtggtttccgtcaccgggcatgacgcgccgggcgttaaaccgggtgatgtgattatcgctgttgacccgcgttacttccgtccggctgaagttgaaacgctgctcggcgacccgaccaaagcgcacgaaaaactgggctggaaaccggaaatcaccctcagagagatggtgtctgaaatggtggctaatgacctcgaagcggcgaaaaaacactctctgctgaaatctcacggctacgacgtggcgatcgcgctggagtcataagcatgagtaaacaacgagtttttattgctggtcatcgcgggatggtcggttccgccatcaggcggcagctcgaacagcgcggtgatgtggaactggtattacgcacccgcgacgagctgaacctgctggacagccgcgccgtgcatgatttctttgccagcgaacgtattgaccaggtctatctggcggcggcgaaagtgggcggcattgttgccaacaacacctatccggcggatttcatctaccagaacatgatgattgagagcaacatcattcacgccgcgcatcagaacgacgtgaacaaactgctgtttctcggatcgtcctgcatctacccgaaactggcaaaacagccgatggcagaaagcgagttgttgcagggcacgctggagccgactaacgagccttatgctattgccaaaatcgccgggatcaaactgtgcgaatcatacaaccgccagtacggacgcgattaccgctcagtcatgccgaccaacctgtacgggccacacgacaacttccacccgagtaattcgcatgtgatcccagcattgctgcgtcgcttccacgaggcgacggcacagaatgcgccggacgtggtggtatggggcagcggtacaccgatgcgcgaatttctgcacgtcgatgatatggcggcggcgagcattcatgtcatggagctggcgcatgaagtctggctggagaacacccagccgatgttgtcgcacattaacgtcggcacgggcgttgactgcactatccgcgagctggcgcaaaccatcgccaaagtggtgggttacaaaggccgggtggtttttgatgccagcaaaccggatggcacgccgcgcaaactgctggatgtgacgcgcctgcatcagcttggctggtatcacgaaatctcactggaagcggggcttgccagcacttaccagtggttccttgagaatcaagaccgctttcgggggtaaaaagaggagaaataccatatggcgcagtcgaaactctatccagttgtgatggcaggtggctccggtagccgcttatggccgctttcccgcgtactttatcccaagcagtttttatgcctgaaaggcgatctcaccatgctgcaaaccaccatctgccgcctgaacggcgtggagtgcgaaagcccggtggtgatttgcaatgagcagcaccgctttattgtcgcggaa
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[0171]
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[0172]
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[0208]
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技术特征：
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有过表达的甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc；所述重组大肠杆菌中还敲除了udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌bl21(de3)；和/或所述重组大肠杆菌中还敲除了d-果糖-6-磷酸醛缩酶b基因fsab、gdp-甘露糖甘露糖基水解酶nudd和d-乳酸脱氢酶基因ldha中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其中，所述过表达是基因在松弛型质粒载体上表达；优选地，松弛型质粒载体为prsfduet-1；优选地，过表达的manc基因、manb基因、gmd基因、wcag基因和futc基因同时位于prsf-duet-1载体上；更优选地，prsf-duet-1载体上，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因以操纵子形式连接由单一启动子调控，futc基因由另一个启动子调控；进一步优选地，prsf-duet-1载体上，gmd基因和wcag基因排列在前，manc基因和manb基因排列在后；进一步优选地，gmd基因和wcag基因的相对表达水平高于manc基因和manb基因相对表达水平；进一步优选地，gmd基因和wcag基因的rbs各自独立地为rbs-wt，将manc基因和manb基因的rbs各自独立地为rbs-34。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组大肠杆菌，其中，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因各自独立地来源于大肠杆菌escherichia coli，优选各自独立地来自于大肠杆菌k-12，更优选地，其核苷酸序列依次如seq id no.1-4所示；和/或futc基因来源于幽门螺杆菌helicobacter pylori，优选地，其核苷酸序列如seq id no.5所示；优选地，所述α-1,2岩藻糖基转移酶的n端带有融合标记；更优选地，所述融合标记为三个天冬氨酸标记。5.一种重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，该方法包括：以大肠杆菌为宿主，向其中导入过表达甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manc、磷酸甘露糖变位酶基因manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、gdp-岩藻糖合成酶基因wcag和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futc的质粒，并敲除所述宿主中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj、lon蛋白酶基因lon、β-半乳糖苷酶基因lacz和乙醛酸操纵子阻遏蛋白基因iclr，构建得到所述重组大肠杆菌；优选地，所述重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌bl21(de3)；优选地，所述重组大肠杆菌中还敲除了d-果糖-6-磷酸醛缩酶b基因fsab、gdp-甘露糖甘露糖基水解酶nudd和d-乳酸脱氢酶基因idha中的至少一种。6.根据权利要求5所述的方法，其中，通过ptargetf载体进行基因的敲除；和/或利用松弛型质粒载体进行基因的过表达，优选地，所述松弛型质粒载体为prsf-duet-1
载体；优选地，所述manc基因、manb基因、gmd基因、wcag基因和futc基因同时位于prsf-duet-1载体上；更优选地，prsf-duet-1载体上，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因以操纵子形式连接由单一启动子调控，futc基因由另一个启动子调控；进一步优选地，prsf-duet-1载体上，gmd基因和wcag基因排列在前，manc基因和manb基因排列在后；进一步优选地，mmd基因和wcag基因的相对表达水平高于manc基因和manb基因相对表达水平；进一步优选地，gmd基因和wcag基因的rbs各自独立地为rbs-wt，将manc基因和manb基因的rbs各自独立地为rbs-34。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，manc基因、manb基因、gmd基因和wcag基因各自独立地来源于大肠杆菌escherichia coli，优选各自独立地来自于大肠杆菌k-12，更优选地，其核苷酸序列依次如seq id no.1-4所示；和/或futc基因来源于幽门螺杆菌helicobacter pylori，优选地，其核苷酸序列如seq id no.5所示；优选地，所述α-1,2岩藻糖基转移酶的n端带有融合标记；更优选地，所述融合标记为三个天冬氨酸标记。8.权利要求5-7中任意一项所述的方法构建得到的重组大肠杆菌。9.权利要求1-4和8中任意一项所述的重组大肠杆菌在生产2
′‑
岩藻糖基乳糖及其衍生品中的应用。10.一种生产2
′‑
岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，该方法包括：利用权利要求1-4或8中任意一项所述的重组大肠杆菌进行培养和诱导发酵生产2
′‑
岩藻糖基乳糖；其中，所述诱导发酵在碳源、底物和诱导剂的存在下进行；优选地，所述碳源选自甘油、葡萄糖和蔗糖中的至少一种；优选地，所述底物为乳糖；优选地，所述诱导剂为iptg；优选地，所述培养的条件包括：温度为30-40℃，ph为6.5-7.2，时间为8-16h；优选地，所述诱导发酵的条件包括：温度为20-30℃，ph为6.5-7.2；优选地，所述诱导发酵的方式为补料分批发酵，更优选地，所述诱导发酵过程中，保持发酵体系中的乳糖浓度在3-10g/l范围内；优选地，所述诱导剂的添加量使得体系中诱导剂的浓度为0.2-1mm；优选地，甘油的初始加入量使得体系中的甘油含量为15-30g/l。

技术总结
本发明涉及微生物领域，公开了重组大肠杆菌及其构建方法和生产2


技术研发人员：李邓斌 魏超 张媛 王小艳 张根林 王靖 李萱 王格格 孙浩轩 赵国淼 周娜娜
受保护的技术使用者：石河子大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/9