一种胰腺癌类器官、培养基及培养方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种胰腺癌类器官、培养基及培养方法。


背景技术：

2.胰腺癌是一组主要起源于胰腺导管上皮及腺泡细胞的恶性肿瘤，恶性程度极高，起病隐匿，早期诊断难，进展迅速，生存时间短，是预后最差的恶性肿瘤之一，被称为“癌中之王”，其发病率和死亡率都高居全球和我国恶性肿瘤的前十位。近年来，胰腺癌的发病率在国内外均呈明显的上升趋势。2021年统计数据显示，在美国所有恶性肿瘤中，胰腺癌新发病例男性位列第10位，女性第9位，占恶性肿瘤相关死亡率的第4位。中国国家癌症中心2021年统计数据显示，胰腺癌位居我国男性恶性肿瘤发病率的第7位，女性第11位，占恶性肿瘤相关死亡率的第6位。胰腺癌的发生发展机制错综复杂，目前尚不十分清楚胰腺癌的病因，其发生或与吸烟、饮酒、高脂肪和高蛋白饮食、过量饮用咖啡、环境污染及遗传等因素有关。近年来的调查报告发现糖尿病人群中胰腺癌的发病率明显高于普通人群；也有人注意到慢性胰腺炎病人与胰腺癌的发病存在一定关系，慢性胰腺炎病人发生胰腺癌的比例明显增高；另外还有许多因素与此病的发生有一定关系，如职业、环境、地理因素等。
3.类器官是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细胞在二维环境中培养得到的单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，各种器官在生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面具有巨大的应用前景。
4.因此，建立胰腺癌类器官模型不但有利于胰腺癌的基础研究，而且有助于胰腺癌的诊断与治疗，提高胰腺癌患者的生存率。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的是提供一种胰腺癌类器官、培养基及培养方法。
6.为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种胰腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
8.b27，0.5-5
×
；
9.egf，5-100ng/ml；
10.noggin，20-1000ng/ml；
11.r-spondin 1，50-1000ng/ml；
12.wnt3a，50-500ng/ml；
13.igf 2，10-100ng/ml；
14.sb 505124，0.5-10μm；
15.sb 203580，0.5-10μm；
16.y-33075，1-100nm。
17.进一步的，所述基础培养基为advanced dmem/f12。
18.进一步的，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
19.b27，1-3
×
；
20.egf，20-60ng/ml；
21.noggin，100-400ng/ml；
22.r-spondin 1，100-800ng/ml；
23.wnt3a，100-400ng/ml；
24.igf 2，40-80ng/ml；
25.sb 505124，1-5μm；
26.sb 203580，1-5μm；
27.y-33075，20-60nm。
28.进一步的，所述胰腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
29.第二方面，本发明提供一种胰腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
30.1)处理新鲜的胰腺癌样本获取细胞团；
31.2)将上述的胰腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，将细胞悬液于培养皿中种胶滴；
32.3)将培养皿放入co2培养箱内静置，轻晃胶滴无明显流动后倒扣，待其充分凝固；
33.4)向培养皿中加入胰腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养；每2～3天更换一次培养基，培养3～10天。
34.进一步的，所述胰腺癌样本包括手术切除标本、活体组织或恶性积液样本。
35.进一步的，当处理的胰腺癌样本为手术切除标本或活体组织时，获取细胞团的方法为对样本进行预处理，预处理的方式包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；当处理的胰腺癌样本为恶性积液样本时，获取细胞团的方法为离心去除上清得到细胞团沉淀备用。
36.优选的，当处理的恶性积液样本存在红细胞过多时，可以进行裂解红细胞处理。
37.进一步的，步骤1)所述细胞团的细胞数量为3～100个。
38.进一步的，步骤2)中胰腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:0.8～3，重悬过程中细胞悬液中细胞浓度为105～107个/ml。
39.进一步的，步骤2)中一个胶滴为10～100μl细胞悬液。
40.进一步的，步骤3)中静置时间为1～20min。
41.进一步的，步骤3)中倒扣时间为10～60min。
42.第三方面，本发明提供一种使用上述胰腺癌类器官培养基或采用上述胰腺癌类器官的培养方法培养得到的胰腺癌类器官。
43.本发明的有益效果为：
44.本发明提供的胰腺癌类器官培养基含有胰腺癌类器官培养所需的最少组分，组分不需要细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(fbs)，节约成本的同时降低了fbs中带来的细胞毒性和抑制物；本发明提供的胰腺癌类器官培养基适合胰腺癌类器官的培养，类器官
培养基的各个组分产生协同作用，使培养得到的胰腺癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。此外，本发明培养基既适用于新鲜组织样本，又适用于恶性积液样本，适用范围广。
附图说明
45.图1为本发明实施例4培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
46.图2为本发明实施例5培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
47.图3为本发明实施例6培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
48.图4为本发明实施例7培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
49.图5为本发明对比例1培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
50.图6为本发明对比例2培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
51.图7为本发明对比例3培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
52.图8为本发明对比例4培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图。
53.图9为本发明对比例5培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图；
54.图10为本发明对比例6培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图。
具体实施方式
55.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
56.本发明实施例采用的b27购自赛默飞世尔科技有限公司。
57.本发明实施例采用的egf购自sigma-aldrich公司。
58.本发明实施例采用的noggin购自sigma-aldrich公司。
59.本发明实施例采用的r-spondin 1购自sigma-aldrich公司。
60.本发明实施例采用的wnt3a购自sigma-aldrich公司。
61.本发明实施例采用的igf 2购自美国medchemexpress公司。
62.本发明实施例采用的sb 505124购自美国medchemexpress公司。
63.本发明实施例采用的sb 203580购自美国medchemexpress公司。
64.本发明实施例采用的y-33075购自美国medchemexpress公司。
65.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
66.实施例1
67.一种胰腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
68.b27，1
×
；
69.egf，50ng/ml；
70.noggin，100ng/ml；
71.r-spondin 1，200ng/ml；
72.wnt3a，100ng/ml；
73.igf 2，20ng/ml；
74.sb 505124，2μm；
75.sb 203580，5μm；
76.y-33075，40nm。
77.所述基础培养基为advanced dmem/f12。
78.所述胰腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
79.实施例2
80.一种胰腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
81.b27，5
×
；
82.egf，80ng/ml；
83.noggin，400ng/ml；
84.r-spondin 1，200ng/ml；
85.wnt3a，250ng/ml；
86.igf 2，100ng/ml；
87.sb 505124，10μm；
88.sb 203580，10μm；
89.y-33075，80nm。
90.所述基础培养基为advanced dmem/f12。
91.所述胰腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
92.实施例3
93.一种胰腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
94.b27，1
×
；
95.egf，40ng/ml；
96.noggin，250ng/ml；
97.r-spondin 1，500ng/ml；
98.wnt3a，200ng/ml；
99.igf 2，60ng/ml；
100.sb 505124，2.5μm；
101.sb 203580，4μm；
102.y-33075，50nm。
103.所述基础培养基为advanced dmem/f12。
104.所述胰腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
105.实施例4
106.一种胰腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
107.1)将新鲜的活体组织进行预处理获取3～100个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；
108.2)将实施例1的胰腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，胰腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:1.5；用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，重悬过程中细胞悬液中细胞浓度为3
×
106个/ml；将细胞悬液于培养皿中种胶滴，一个胶滴为80μl细胞悬液；
109.3)将培养皿放入co2培养箱内静置5min，轻晃胶滴无明显流动后倒扣30min，待其充分凝固；
110.4)向培养皿中加入实施例1的胰腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养；每2天更换一次培养基，培养4天后，培养得到的胰腺癌类器官如图1所示。
111.实施例5
112.一种胰腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
113.1)将新鲜的活体组织进行预处理获取3～100个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；
114.2)将实施例2的胰腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，胰腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:1；用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，重悬过程中细胞悬液中细胞浓度为2
×
105/ml；将细胞悬液于培养皿中种胶滴，一个胶滴为30μl细胞悬液；
115.3)将培养皿放入co2培养箱内静置15min，轻晃胶滴无明显流动后倒扣50min，待其充分凝固；
116.4)向培养皿中加入实施例2的胰腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养；每2天更换一次培养基，培养7天后，培养得到的胰腺癌类器官如图2所示。
117.实施例6
118.一种胰腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
119.1)将新鲜的活体组织进行预处理获取3～100个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；
120.2)将实施例3的胰腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，胰腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:2；用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，重悬过程中细胞悬液中细胞浓度为107个/ml；将细胞悬液于培养皿中种胶滴，一个胶滴为50μl细胞悬液；
121.3)将培养皿放入co2培养箱内静置10min，轻晃胶滴无明显流动后倒扣40min，待其充分凝固；
122.4)向培养皿中加入实施例3的胰腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养；每2天更换一次培养基，培养3天后，培养得到的胰腺癌类器官如图3所示。
123.实施例7
124.一种胰腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
125.1)将新鲜胰腺癌恶性积液样本，离心去除上清得到细胞团沉淀备用，如存在红细
胞过多，可以进行裂解红细胞处理；
126.2)将实施例3的胰腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，胰腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:1.5；用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，重悬过程中细胞悬液中细胞浓度为5
×
106个/ml；将细胞悬液于培养皿中种胶滴，一个胶滴为40μl细胞悬液；
127.3)将培养皿放入co2培养箱内静置5min，轻晃胶滴无明显流动后倒扣30min，待其充分凝固；
128.4)向培养皿中加入实施例3的胰腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养；每2天更换一次培养基，培养5天后，培养得到的胰腺癌类器官如图4所示。
129.对比例1
130.一种胰腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有igf2，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养3天后培养得到的胰腺癌类器官如图5所示，胰腺癌类器官大小显著小于实施例3，因此igf2对胰腺癌类器官生长至关重要。
131.对比例2
132.一种胰腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中的igf2替换为胰岛素，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养3天后培养得到的胰腺癌类器官如图6所示，胰腺癌类器官大小显著小于实施例3，因此说明igf2对胰腺癌类器官生长促进效果胰岛素无法替代。
133.对比例3
134.一种胰腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中的egf替换为fgf，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养3天后培养得到的胰腺癌类器官如图7所示。由图7可知，细胞生长慢，因此说明egf对胰腺癌类器官生长促进效果fgf无法替代。
135.对比例4
136.一种胰腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有sb 505124，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养3天后培养得到的胰腺癌类器官如图8所示。由图8可知，细胞逐渐凋亡，因此说明sb 505124对胰腺癌类器官生长至关重要。
137.对比例5
138.一种胰腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有sb 203580，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养得到的胰腺癌类器官如图9所示。由图9可知，细胞逐渐凋亡，因此说明sb 203580对胰腺癌类器官生长至关重要。
139.对比例6
140.使用实施例3的胰腺癌类器官培养基，采用实施例6的培养方法培养肺癌类器官，培养3天后，培养得到的胰腺癌类器官如图10所示。由图10可知，细胞逐渐凋亡，无法长出肺癌类器官。本发明的培养基培养胰腺癌类器官具有专属性。
141.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种胰腺癌类器官培养基，其特征在于，包括基础培养和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：b27，1-5
×
；egf，10-100ng/ml；noggin，20-500ng/ml；r-spondin 1，100-1000ng/ml；wnt3a，50-500ng/ml；igf 2，10-100ng/ml；sb 505124，1-10μm；sb 203580，1-10μm；y-33075，1-100nm。2.根据权利要求1所述胰腺癌类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为advanced dmem/f12。3.根据权利要求1所述的胰腺癌类器官培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：b27，1-3
×
；egf，20-60ng/ml；noggin，100-400ng/ml；r-spondin 1，100-800ng/ml；wnt3a，100-400ng/ml；igf 2，40-80ng/ml；sb 505124，1-5μm；sb 203580，1-5μm；y-33075，20-60nm。4.根据权利要求1所述的胰腺癌类器官培养基，其特征在于，所述胰腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。5.一种胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)处理新鲜的胰腺癌样本获取细胞团；2)将权利要求1～4任意一项所述的胰腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，将细胞悬液于培养皿中种胶滴；3)将培养皿放入co2培养箱内静置，轻晃胶滴无明显流动后倒扣，待其充分凝固；4)向培养皿中加入将权利要求1～4任意一项所述的胰腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养；每2～3天更换一次培养基，培养3～10天。6.根据权利要求5所述的胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤1)所述胰腺癌样本包括手术切除标本、活体组织或恶性积液样本；当处理的胰腺癌样本为手术切除标本或活体组织时，获取细胞团的方法为对样本进行预处理，预处理的方式包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；当处理的胰腺癌样本为恶性积液样本时，获取细胞团的方法为离心去除上清得到细胞团沉淀备用。7.根据权利要求5所述的胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤1)所述细胞团的
细胞数量为3～100个。8.根据权利要求5所述的胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤2)中胰腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:0.8～3，重悬过程中细胞悬液中细胞浓度为105～107个/ml。9.根据权利要求5所述的胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤2)中一个胶滴为10～100μl细胞悬液。10.一种胰腺癌类器官，其特征在于，采用权利要求1～4任意一项所述胰腺癌类器官培养基或使用权利要求5～9任意一项所述胰腺癌类器官的培养方法培养获得。

技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种胰腺癌类器官、培养基及培养方法。胰腺癌类器官培养基，其特征在于，包括基础培养和特异性添加因子，特异性添加因子包括如下终浓度的组分：B27，1-5


技术研发人员：廖传荣 朱宇 兰坚强 黄敏
受保护的技术使用者：创芯国际生物科技（广州）有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/9