兼具消减抗生素抗性基因和促生功能的鞘氨醇单胞菌属细菌NJAU-T56及其应用

兼具消减抗生素抗性基因和促生功能的鞘氨醇单胞菌属细菌njau-t56及其应用
技术领域
1.本发明属于生物防控技术领域，具体涉及兼具消减抗生素抗性基因和促生功能的鞘氨醇单胞菌属细菌njau-t56及其应用。


背景技术：

2.畜禽粪污排放引起土壤抗生素抗性基因的增加，成为一种新型土壤生物污染，对于如何消除抗性基因污染并防止污染的程度进一步加大已是重中之重。另外，由番茄青枯菌所引起的青枯病已经成为番茄产业危害最为严重，造成经济损失最大的病害之一。由于病原菌能在土壤中大量存活，一旦侵染，能在土壤中不断富集，导致严重病害。另外，病原菌爆发同时会伴随产生土壤抗生素抗性基因大量增殖，进一步增强抗生素抗性基因污染风险，并形成生物复合污染，因此，探索协同防控番茄青枯病和消减土壤抗生素抗性基因新型技术，成为当前研究的热点。
3.目前市面上大都是普通腐熟有机肥、化肥和促生或防控土传病害生物有机肥产品，对于既能防治青枯病又能消减土壤抗生素抗性基因的生物有机肥产品很少提及。一般的腐熟有机肥尤其植物源有机肥也能一定程度消减土壤内源性抗生素抗性基因，但效果不是特别好，同时，就算是腐熟过的有机肥也存在着带入新的外源抗生素抗性基因的问题。而化肥虽然不会携带新的外源抗生素抗性基因进入土壤，但不合理施用化肥易损坏土壤生态环境，造成病原菌爆发，也会带来大量的土壤抗生素抗性基因。基于此，本发明从番茄植株根际分离筛选出一株能够有效消减土壤中抗生素抗性基因并拮抗番茄青枯菌的功能细菌，并将其添加至所筛选的具有良好改土增产效果，且自身携带抗生素抗性基因较低的有机肥原料中去，并对其抗生素抗性基因消减能力及抑病特征进行测定，以期创制兼具消减抗生素抗性基因和促生拮抗功能的新型生物有机肥产品。


技术实现要素：

4.本发明目的在于针对畜禽粪污排放、畜禽粪便源有机肥大量施用导致的土壤抗生素抗性基因污染防治和番茄连作土传青枯病防控，提供一种兼具消减抗生素抗性基因和促生拮抗功能的鞘氨醇单胞菌属细菌sphingomonas sp.njau-t56，并利用其创制生物有机肥。
5.本发明的目的可通过以下技术方案实现:
6.一株鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas sp.)细菌njau-t56，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年12月25日，保藏编号为cgmcc no.26209。
7.本发明所述的njau-t56制备的菌剂。
8.作为本发明的一种优选，所述的菌剂通过以下方法制备得到：将保藏编号为cgmcc no.26209的鞘氨醇单胞菌njau-t56接种至r2a液体培养基进行液体发酵，条件为ph7.0，温
度为30℃，搅拌速度为170～190转/分钟，发酵时间为48-72h，离心获得的菌体用无菌水重悬，使菌悬液中菌含量＞106个/ml，得所述的菌剂。
9.本发明所述的njau-t56在促进番茄生长、抑制番茄青枯病病原菌和/或消减土壤中抗生素抗性基因及抗生素抗性基因整合子类基因含量中的应用。
10.本发明所述的菌剂在促进番茄生长、抑制番茄青枯病病原菌和/或消减土壤中抗生素抗性基因及抗生素抗性基因整合子类基因含量中的应用。
11.作为本发明的一种优选，所述的抗生素抗性基因选自氨基糖苷类抗生素抗性基因。
12.作为本发明的一种优选，所述的抗生素抗性基因选自链霉素耐药基因aada
13.作为本发明的一种优选，所述的抗生素抗性基因整合子类基因为1类整合子酶基因intl1。
14.作为本发明的一种优选，本发明所述的菌剂在抑制番茄青枯病番茄专化型病原菌中的应用。
15.作为本发明的一种优选，将本发明所述的菌剂直接加至植物根际，菌剂的灌菌量按菌剂体积与土壤重量比为50～150ml
·
kg-1
来施用，优选按照100ml
·
kg-1
来施用。
16.有益效果
17.本发明提供一株用于消减土壤中抗生素抗性基因和防控土传青枯病的鞘氨醇单胞菌。接种njau-t56菌液能够有效降低长期浇灌畜禽粪水土壤中抗生素抗性基因的含量和根际土壤中病原菌青枯菌的数量，3周后，与未接种对照土体土壤中各类抗生素抗性基因的含量相比，接种njau-t56菌液处理的土壤中链霉素耐药基因aada、1类整合子酶基因intl1的含量显著低于鲜鸡粪处理。链霉素耐药基因属于氨基糖苷类抗生素抗性基因，氨基糖苷类抗生素抗性基因和1类整合子酶基因，皆为土壤常见抗生素抗性基因或其遗传元件。可见njau-t56对土壤中相关抗生素抗性基因有显著消减效果，且盆栽中，njau-t56在一定程度上对番茄植株具有促生效果。
附图说明
18.图1菌株njau-t56与土壤常见高含抗生素抗性基因菌株平板对峙效果
19.图2菌株njau-t56与番茄青枯病病原菌平板对峙效果
20.图3基于功能菌njau-t56的16s rrna基因序列构建的系统发育树
21.图4接种菌株njau-t56对番茄种植土壤中不同抗生素抗性基因含量的影响
22.注：of1代表鸡粪有机肥处理，of1+njau-t56代表鸡粪有机肥加njau-t56菌剂处理，of2代表中药渣有机肥处理，of2+njau-t56代表中药渣有机肥加njau-t56菌剂处理，f代表鲜鸡粪处理。
23.生物材料保藏证明
24.njau-t56，分类命名为鞘氨醇单胞菌sphingomonas sp.njau-t56，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年12月25日，保藏编号为cgmcc no.26209。
具体实施方式
25.实施例1功能菌的分离与筛选
26.1.供试材料：
27.供试病原菌：番茄专化型青枯病致病菌(ralstonia solanacearum,rs)，高含抗生素抗性基因菌bacillus sp.,escherichia coli和pseudomonas sp.由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室分离和保存。
28.供试土壤：某长期浇灌养鸡场养殖粪污的土壤。
29.2.菌株分离与筛选：
30.将所采集番茄根际土壤样品处理后，稀释涂布于固体r2a平板上，30℃培养箱中培养2-4天之后，分别挑取形态差异菌落纯化待用。
31.3.功能菌初筛：
32.以平板对称轴画线，分别将所分离待测菌株与土壤中常见的高含抗生素抗性基因菌株接种于对称轴线两边，给菌株接种5个点，共计10个点，呈v字形，接种量为1.5ul/点。挑选其中抑制效果较强的菌落，于试管斜面划线保存和超低温冰箱甘油管冷冻保存待用。
33.4.功能菌复筛：
34.复筛同样以平板对称轴画线，采用初筛同样的方法测得，但以相同条件下不接种拮抗菌的r2a平板作为对照，并设置3个重复，置于30℃培养箱中培养5天后，观察各功能菌对高含量抗生素抗性基因菌株的抑制能力。选取其中效果最好的菌株，暂命名为njau-t56，其能显著抑制土壤中的芽孢杆菌属细菌bacillus sp.c
30
、c
71
、c
16
和假单胞属细菌pseudomonas sp.c4r
11
(图1)。
35.5.拮抗青枯菌能力测试
36.将已经筛选到的具有良好拮抗高含抗生素抗性基因菌株的功能菌，置于1/2r2a和1/2na混合培养基上，以平板对称轴画线，将拮抗菌与青枯菌分别于对称轴线两边呈v字形各点5接种，以相同条件下不接种拮抗菌的混和平板为对照，设置三个重复，30℃培养5天后，观察拮抗效果，发现njau-t56能显著抑制番茄青枯菌rs(图2)，将其保存待用。
37.实施例2菌株njau-t56的鉴定
38.菌株njau-t56在混合培养基平板上培养72小时后，菌落边缘光滑呈圆形、扁平、淡黄色、湿润有光泽、边缘整齐、不透明，且与培养基连接不紧密易被挑取；16s序列构建的发育树比对分析结果表明，菌株njau-t56与sphingomonas echinoides同源性最高，与sphingomonas hankookensis同源性最远，结合发育树比对分析结果和形态特征，将菌株njau-t56鉴定为鞘氨醇单孢菌属细菌(sphingomonas sp.)(图3)。该菌株对作物无害，对人和动物无致病性。
39.实施例3njau-t56菌剂制备
40.将njau-t56菌体挑入液体r2a培养基中，ph7.0，温度为30℃，搅拌速度为180转/分钟，发酵时间为60h，离心获得的菌体用无菌水重悬，使菌悬液中菌含量＞106个/ml，得njau-t56菌剂。
41.实施例4利用盆栽实验研究菌株njau-t56结合不同有机肥对番茄植株生物量及典型抗生素抗性基因含量的影响
42.盆栽实验地点位于江苏省南京市南京农业大学玻璃温室，试验时间为2022年3月
至5月，供试番茄品种为常规矮生红番茄。将番茄种子在室温下消毒清洗，并于30℃培养箱中遮光催芽至露白后分别埋入一定含水量的基质中，分别长至两叶一心后移栽入盆栽。供试菌剂为njau-t56。
43.盆栽试验共设置8个处理，分别为1)of1，施用鸡粪有机肥；2)of2，施用中药渣有机肥；3)f，施用鲜鸡粪；4)of1+njau-t56，施用鸡粪有机肥和njau-t56菌剂(实施例3制备，下同)；5)of2+njau-t56，施用中药渣有机肥和njau-t56菌剂；6)f+njau-t56，施用鲜鸡粪和njau-t56菌剂；7)cf，施用化肥；8)cf+njau-t56，施用化肥和njau-t56菌剂。每个盆装土300g，移栽7天后，njau-t56菌剂接种量为每盆30ml，生长21天后，每个处理分别取4盆长势一致的番茄进行生物量测定。
44.各处理生物量如表1所示，对于地上部株高，各处理间无显著性差异，但各施肥组中，接种njau-t56菌剂的处理普遍高于对照；茎粗方面，接种njau-t56菌剂处理的番茄植株在化肥施肥组中的表现最好，比不接菌对照粗0.09cm，其他施肥组中无明显差异；从鲜重上看，无论施用何种肥料，接菌明显优于不接菌的对照，其中化肥和鸡粪有机肥处理中接菌处理显著优于不接菌处理，对照中各重复的长势存在较大差异；干重方面，各施肥组中，接菌处理均优于对照，化肥组中接种njau-t56的处理显著优于不接菌处理。综上所述，整体上，接种njau-t56菌剂对番茄植株体现出良好的促生效果，且有助于植株的长势均一。
45.表1盆栽试验植株生物量
[0046][0047]
注：cf代表化肥处理，of1代表鸡粪有机肥处理，of2代表中药渣有机肥处理，f代表鲜鸡粪处理，都为未接菌对照。表中数据表示平均值
±
标准偏差。
[0048]
实施例4添加菌株njau-t56对番茄盆栽土壤抗生素抗性基因含量的影响
[0049]
取盆栽试验中的1)of1、2)of2、3)f、4)of1+njau-t56、5)of2+njau-t56这5个处理进行抗生素抗性基因的检测。对加入功能菌后的处理和对照番茄土壤样品进行抗生素抗性基因含量的测定，结果如图4所示，鲜鸡粪处理的链霉素耐药基因和1类整合子酶基因含量都是最高的，加入腐熟有机肥(鸡粪有机肥和中药渣有机肥)的处理中链霉素耐药基因和1类整合子酶基因明显下降，而加入njau-t56菌剂的处理效果更加明显，进一步显著降低了这两种基因的丰度。链霉素耐药基因属于氨基糖苷类抗生素抗性基因，因此，njau-t56对土壤中的整合子类integron基因、氨基糖苷类aminoglycoside抗生素抗性基因含量都具有显
著的消减能力,利用njau-t56与不同有机肥联合研制生物有机肥，能够有效降低土壤中该两类基因的丰度。

技术特征：
1.一株鞘氨醇单胞菌属(sphingomonassp.)细菌njau-t56，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年12月25日，保藏编号为cgmccno.26209。2.权利要求1所述的njau-t56制备的菌剂。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述的菌剂通过以下方法制备得到：将保藏编号为cgmccno.26209的鞘氨醇单胞菌njau-t56接种至r2a液体培养基进行液体发酵，条件为ph7.0，温度为30℃，搅拌速度为170～190转/分钟，发酵时间为48-72h，离心获得的菌体用无菌水重悬，使菌悬液中菌含量＞106个/ml，得所述的菌剂。4.权利要求1所述的njau-t56在促进番茄生长、抑制番茄青枯病病原菌和/或消减土壤中抗生素抗性基因及抗生素抗性基因整合子类基因含量中的应用。5.权利要求2-4中任一项所述的菌剂在促进番茄生长、抑制番茄青枯病病原菌和/或消减土壤中抗生素抗性基因及抗生素抗性基因整合子类基因含量中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的抗生素抗性基因选自氨基糖苷类抗生素抗性基因。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的抗生素抗性基因选自链霉素耐药基因aada。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的抗生素抗性基因整合子类基因为1类整合子酶基因intl1。9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于权利要求2-3中任一项所述的菌剂在抑制番茄青枯病番茄专化型病原菌中的应用。10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将权利要求2-4中任一项所述的菌剂直接加至植物根际，菌剂的灌菌量按菌剂体积与土壤重量比为50～150ml
·
kg-1
来施用，优选按照100ml
·
kg-1
来施用。

技术总结
本发明提供兼具消减抗生素抗性基因和促生功能的鞘氨醇单胞菌属细菌NJAU-T56及其应用。该菌株分离于番茄根际土壤，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26209，该菌株能够拮抗番茄青枯菌，以及土壤中常见的含高抗生素抗性基因菌株高抗生素抗性基因菌。盆栽试验结果表明，使用该功能菌株研制的生物有机肥料能够显著促进番茄植株的生长，降低土壤中抗生素抗性基因链霉素耐药基因aadA、1类整合子酶基因intl1含量。同时在与番茄青枯菌对峙中发现NJAU-T56能明显拮抗番茄青枯菌。明显拮抗番茄青枯菌。明显拮抗番茄青枯菌。


技术研发人员：沈其荣 冉滨源 李荣 欧燕楠 邓旭辉 沈宗专 李若尘
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/8/9