一种水稻三明显性核不育基因SDGMS及其应用的制作方法

一种水稻三明显性核不育基因sdgms及其应用
技术领域
1.本发明属于功能基因技术领域，具体涉及一种水稻三明显性核不育基因sdgms及其应用。


背景技术：

2.雄性不育是自然界广泛存在的现象，根据其控制基因所处位置的不同可以分为细胞质雄性不育和细胞核雄性不育，细胞核雄性不育又可以进一步分为显性核不育与隐形核不育。其中细胞质雄性不育和光温敏雄性不育已经在生产中被广泛的应用，对作物杂种优势的利用及杂交育种做出了巨大贡献。
3.显性核不育作为一种相对稀缺的材料，仅在10种作物中鉴定到20多例显性不育，作为十分理想的育种方法，依托于显性核不育材料构建轮回选择(recurrentselection)体系能够快速打破遗传连锁，聚集优良位点，已经在多种作物中得以应用实施。
4.目前在作物中已经克隆了3个控制显性核不育的基因。1972年，高忠丽在山西省太谷县鉴定到了一株雄性不育株，后经过一系列鉴定确定其为单基因控制的显性无花粉型不育，并将该材料命名为小麦太谷不育。刘秉华等(1986)通过对四倍体硬粒小麦与太谷不育回交后代的研究将控制太谷核不育的基因定位在4d染色体短臂上。刘秉华和杨丽(1991)发现小麦矮杆基因(rht10)和太谷不育基因(ms2)是紧密连锁的，由此育成矮败小麦，使得不育与可育单株更易区分，同时提高了异交结实。xia等(2017)发现由于一个末端重复小型逆转录转座子(trim)元件插入到ms2启动子区域，特异激活了ms2蛋白在花药中的表达从而导致显性不育表型产生。liu等(2022)进一步研究发现被激活的ms2蛋白能够活性氧调节蛋白taromo1互作并促进其多聚化，降低了花药中ros水平，从而抑制了小麦的花药发育。
5.1972年四川省宜宾地区农科所在甘蓝型油菜中发现了显性核不育材料，并进一步选育出显性核雄性不育系宜3a。xin等(2016)研究表明油菜yi3a类型雄性不育受到同一基因座位的三个复等位基因ms5a(恢复基因)，ms5b(不育基因)和ms5c(临保基因)控制，ms5编码一个芸薹属特异蛋白，其在染色体联会及减数分裂凝聚亚基syn1的定位发挥重要功能。而ms5b由于第二内含子插入了mule转座原件，在减数分裂过程中不能形成正确的联会复合体和重组原件，导致了雄性不育产生。xin等(2022)在后续研究中发现，ms5a和ms5b所编码的蛋白是甘蓝型油菜雄性正常发育所必须的，而ms5b所编码的嵌合蛋白能够竞争性的与ms5a和ms5b结合，形成无功能的二聚体。ms5b和ms5c的表达量相当，所形成的二聚体产生了显性效应，导致了雄性不育表型的产生。而ms5a的表达量远高于ms5b，因此能够维持足够的ms5a同源二聚体，导致育性的恢复。
6.ms44是由ems突变中鉴定到的玉米显性不育突变体。tim等(2017)研究表明玉米ms44编码一个脂质转移蛋白该蛋白在绒毡层中特异性表达，在ms44蛋白的信号肽切割位点，从丙氨酸到苏氨酸的单一氨基酸改变消除了蛋白质加工，阻碍了蛋白质从绒毡层细胞分泌到室中，导致显性雄性不育。
7.在水稻中目前鉴定到6例水稻显性核不育材料，萍乡显性核不育、三明显性核不
育、8987低温敏显性核不育、浙9248突变体显性核不育、1783和1789显性核不育突变材料及osdms-2显性不育，目前没有基因克隆的报道。
8.萍乡显性核不育由颜龙安等于1978年在萍矮58/华野的f2中分离获得(颜龙安等，1984)，陈学伟等(2000)利用sslp标记将萍乡显性核不育基因ms-p定位于第10染色体上，位于标记rm228和rm258之间，距rm228遗传距离为14.9cm。随后进一步用rm228和rm258邻近的rflp标记对亲本和群体进行分析，发现rflp标记g2155与基因ms-p连锁，遗传距离为2.6cm。贺浩华等(2004)将其定位于ssr标记rm239附近，二者的遗传距离为5.65cm。在此基础上，huang等(2007)将ms-p定位于ssr标记rm171和rm6745之间，ms-p距离两标记的遗传距离分别为0.3cm和3.0cm。
9.8987低温敏显性核不育是由邓晓建和周开达(1994)于1989年在3304/明恢63f5代中发现的具有低温时完全不育较高温时正常结实的特点是由一对基因控制的低温敏显性不育。李仕贵等(1999)利用rflp和微卫星标记将其控制基因tms定位于第6染色体的两个标记c235和rm50之间，tms与两标记的遗传距离分别为6.4cm和12.9cm。
10.水稻三明显性核不育性状由福建省三明市农业科学研究所于2001年在杂交组合se21s/basmati370的f2代群体中发现，相比于其他水稻不育材料，其雄性不育稳定彻底、柱头外露好、雌性育性不受影响，分析表明三明显性核不育受单位点调控(黄显波等，2008)。杨茂泽等(2012)将三明显性核不育基因定位于8号染色体两个in-del标记zm30和zm9之间，区间参考日本晴基因组约99kb。然而目前还没有关于水稻三明显性核不育基因的报道。
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技术实现要素：

[0030]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻显性核不育基因sdgms，为选育雄性不育水稻提供新的基因资源。
[0031]
本发明提供了一种水稻三明显性核不育基因sdgms，包括以下dna片段：
[0032]
1)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna片段；
[0033]
2)在项1)的基础上进行若干个碱基的替换、缺失或插入，且表达产物与seq id no:1所示dna片段的表达产物具有相同功能的dna片段；
[0034]
3)编码氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质的dna片段；
[0035]
4)核苷酸序列如seq id no:3所示的dna片段。
[0036]
本发明提供了一种所述水稻三明显性核不育基因sdgms编码的蛋白质，氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0037]
本发明提供了一种包含所述水稻三明显性核不育基因sdgms的重组载体。
[0038]
优选的，所述重组载体的骨架载体包括pcambia1301。
[0039]
优选的，所述水稻三明显性核不育基因sdgms在骨架载体中的插入位置为kpni和bamhi多克隆位点。
[0040]
本发明提供了所述水稻三明显性核不育基因sdgms、所述蛋白质或所述重组载体在调控水稻三明显性核不育性状中的应用。
[0041]
本发明提供了所述水稻三明显性核不育基因sdgms或所述重组载体在培育和/或
构建不育水稻品系中的应用。
[0042]
优选的，所述水稻三明显性核不育基因sdgms联合提高sdgms表达的元件在培育不育水稻品系中的应用。
[0043]
优选的，所述元件包括玉米ubiquitin启动子；所述玉米ubiquitin启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0044]
本发明提供了所述水稻三明显性核不育基因sdgms、所述蛋白质作为标志物在检测或鉴定三明显性核不育水稻品系中的应用。
[0045]
本发明提供了一种水稻三明显性核不育基因sdgms。本发明在前人研究水稻三明显性核不育基因定位于水稻8号染色体两个in-del标记zm30和zm9之间的基础上，针对群体构建过程中多个水稻亲本和三明显性核不育突变来源的系谱相关亲本进行多态性分析，开发得到分子标记，经过精细定位将目标基因定位于标记xch7与sm1之间，然后基于三明显性核不育938背景近等基因系(bc7f1)的全基因组bac文库，利用分子标记xch7和xch95筛选得到基因sdgms。本发明利用遗传转化技术将基因sdgms转移至野生型水稻品种中，可创造显性核不育系；同时增高sdgms表达水平能够增加不育程度。因此，本发明证明了基因sdgms具有显性核不育的生物学功能。
附图说明
[0046]
图1为本发明的sdgms基因的图位克隆，图中(a)为sdgms在水稻第8染色体遗传连锁图上的位置及sdgms的精细定位；标记间的数字代表各标记之间的物理距离，标记下方的数字代表重组株数量；
[0047]
图2为本发明的sdgms转基因互补验证的载体图，即所用的功能性载体为pcambia1301的图谱；
[0048]
图3为本发明的t1代转基因单株的花粉碘染镜检和结实率表型图，图中：a-c为seq id no：1连接至pcambia1301转化日本晴表型；a图为转基因阴性(左)和转基因阳性(右)的整个植株表型；b图为转基因阴性(左)和转基因阳性(右)的成熟期穗部表型；c图为转基因阴性(左)和转基因阳性(右)的花药和花粉碘染表型；d-f为将seq id no：1第1-1723位碱基替换为玉米ubiquitin启动子并连接至pcambia1301转化日本晴表型；d图为转基因阴性(左)和转基因阳性(右)的整个植株表型；e图为转基因阴性(左)和转基因阳性(右)的成熟期穗部表型；f图为转基因阴性(左)和转基因阳性(右)的花药和花粉碘染表型；图4为重组载体pcambia1301u的谱图。
具体实施方式
[0049]
本发明提供了一种水稻三明显性核不育基因sdgms，包括以下dna片段：
[0050]
1)核苷酸序列如seq id no:1(atggccccaaagaaagaacagccagtgaa ggaggtacggaatctcaacactccttattcctgtttgtgtgtcgtgcgccatgactttggttcttcaaagatcatggggatttcaaatgaaaaaaatgatcttttttttttcctctccttgcttgttgtttcttgtcaagccccctgcatcagatgaattcgatctcgtgctgaatgatttgcctgaaagctacaagaagctcatggaggacgccattccaacaagattagaacagataatcatacaggaagctccgtccaatagcaaaggcaaaaagctcttctccaaggttgctgagagactctacacgcccaaaggtgggacttttctggtgaagttgaagccgaccaagagcagtccagatgaggaaatcgtaacactcctgttccga
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[0051]
2)在项1)的基础上进行若干个碱基的替换、缺失或插入，且表达产物与seq id no:1所示dna片段的表达产物具有相同功能的dna片段；
[0052]
3)编码氨基酸序列如seq id no:2(mapkkeqpvkeppasdefdlvln dlpesykklmedaiptrleqiiiqeapsnskgkklfskvaerlytpkggtflvklkptksspdeeivtllfrwkdlyfeafhakgkwyrmsdaeeslpprsqlhyskkekegvfnmnnistsyndvgghnievgrrafknchqsllmaeelvrqkrlkeelgsgplslpvvtisesirfpllqrwvlgtfsapptaksekkvpkkfscefnewgkysralftqelpvgceltfaqiaeklrvlkyraawvpqpaqkhvkdv)所示的蛋白质的dna片段。
[0053]
4)用于互补转化的sdgms基因组序列(seq id no:3，gactcgacggggacagctagcaggcgcactttgggctccacgtgtacagcagtacgttgacgactgggtgttagctacagaggaggtgatcaacgagctcttcccacacacggaggagaactaccgtgactaccttcgctggtaccttcctcgcactcgtgcgcgtgtgaccttcactccagacgccccagagccgcacgttgccgctgtcacggacgcgtatcccacgcaccgtgaccgagactacttcgtggcggtacgtccaatttgtattacttccaacaattatttcatttatcttgcataaaataggacaactactgaatttttta
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[0106]
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[0107]
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[0108]
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[0109]
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[0110]
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[0111]
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[0112]
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[0113]
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[0114]
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[0115]
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[0116]
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[0117]
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[0118]
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[0119]
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[0120]
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[0121]
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[0122]
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[0123]
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[0124]
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[0125]
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[0126]
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[0127]
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[0128]
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[0129]
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[0130]
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[0131]
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[0132]
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[0133]
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[0134]
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[0135]
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[0136]
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[0137]
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[0138]
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[0139]
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[0140]
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[0141]
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[0142]
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[0143]
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[0144]
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[0145]
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[0146]
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[0147]
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[0148]
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[0149]
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[0150]
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[0151]
ccgggcacttcgcttcagtcttcaccacgtatctagctaaaccattcccaaaat
[0152]
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[0153]
acatttatttactctttttttcttcaaaacgaaatgggtgtggtagagtcagag
[0154]
accataacgatatcaatactatcaaaacatcttaaaataccagaaacggaatt
[0155]
atcggaatagagcctcggaaacaacgatatttgaatacatctgtcggcgacat
[0156]
gggtccgggagtatcatgactagaggcttgaggtagacacaatcgcccacgtg
[0157]
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[0158]
tagtctccccgagggggtcggactgctcccgcctcggccccgagggccgaggc
[0159]
gccccgacccctcgtgggttctgctccgcgtgtgcgggttaggtgagcacagcg
[0160]
gcgctcacctaaccgcatttatggcggtttggctgagcgtgtcatgccgcatgt
[0161]
agcgtagtgcaatgcactcttttatccggtctgtgaccagtcacagaccggtca
[0162]
gatcgcgggttaggtggcgacaggcgatctgacacacgcctcgccccatcccg
[0163]
tcaggacgagggcttctaagcgctcgttcccagctggagctagcgtgttatctc
[0164]
ccagagatggcacgttagttctggttagatatatgccaggcttcatcctaacca
[0165]
ttacaggcaagatgttttgtgaagaagggcaaacatgcatgttgctaagctga
[0166]
cgcgtggtggacaagaatgaccgatttgtgaccagtctgacactgatcatgtc
[0167]
gtcagcagacagccacgttcccacgtcgcgcctgcctccggcggaagtggagg
[0168]
taggtatgtgacgtcccatcagaaggtcattcggacggcaaccatacaaatct
[0169]
ccgtccatttatgaagaaaaggcaagtccagtttagagaaagggagcatgtgg
[0170]
tatccccttgagatataaaaggaggaccttgcccagttagagagggggactgg
[0171]
accttttccagattcggaacccagaacaagggagaggctggttcatactttgta
[0172]
gctccttcatacacagatccaccaaaacacaggagtagggtattacgcttctca
[0173]
gcggcccgaacctgtatacatcgcccgtgtcttgtgctcttttcgcggtcgcga
[0174]
atcttcccacatacagagagagcttagaatttcatcctgagcccccggccgaac
[0175]
cggcaaaggggggcctgcgcggtctcccggtgaggagccccacgctccgtcat
[0176]
ctggcgcgccaggtagggggcttagtgtgtgttttccgagctctcgtactattc
[0177]
cgtgtgcgccaagcttttcctgttcagcctgatggccgagcacgcaaaggcgca
[0178]
cgacctctctccgagtgtgagtggcgacgacggggagccaaacccccgccgtc
[0179]
gagctcgttctccgccgccccctccacgccaaagtcctaagcggggggaggcgctcgagagggtcgaaagatccgcgacttca)。互补转化的sdgms基因组序列中第2559-4536位碱基为一个反转录转座子插入，第4631-6924位碱基为开放读码框(orf)，包含3个外显子(4631-4663位碱基，4799-5087位碱基，6392-6924位碱基)和2个内含子(4364-4798位碱基，5088-6391位碱基)，第6925-9064位碱基为3’端非翻译区序列。
[0180]
本发明提供了一种所述水稻三明显性核不育基因sdgms编码的蛋白质，氨基酸序列如seq id no:2所示。编码的蛋白质为一个核糖体失活蛋白，具有rrnan-糖苷酶活性，能够负调控蛋白质翻译，其生物学功能为导致植物显性雄性不育。
[0181]
本发明提供了一种包含所述水稻三明显性核不育基因sdgms的重组载体。
[0182]
在本发明中，所述重组载体的骨架载体优选包括pcambia1301。所述水稻三明显性核不育基因sdgms优选在骨架载体中的插入位置为kpni和bamhi多克隆位点。
[0183]
在本发明中，所述重组载体的构建方法，优选包括以下步骤：
[0184]
pcr扩增水稻三明显性核不育基因sdgms；
[0185]
将扩增的水稻三明显性核不育基因sdgms通过同源重组方式插入骨架载体中，经验证得到重组载体。
[0186]
在本发明中，水稻三明显性核不育基因sdgms扩增用引物优选包括核苷酸序列如seq id no:5(atgattacgaattcgagctcggtaccgact cgacggggacagctag，其中下划线为限制性内切酶kpni切点)所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:6(gcctgcaggtcgactctagag gatccgaagactgaagcgaagtgcc，下划线为限制性内切酶bamhi切点)所示的反向引物，其中。所述扩增的反应体系优选为50μl，包含以下组分：1
×
反应缓冲液、200μm的dntps、200ngbac-dna、正反向引物各0.3μm和kodfx聚合酶1.0u。所述扩增的反应程序优选如下：98℃2min；98℃10s，58℃10s，68℃10min，35个循环；68℃15min；25℃1min。
[0187]
在本发明中，外源片段水稻三明显性核不育基因sdgms插入到pcmabia1301载体的11046位～11050bp位之间位置，具体为kpni/bamhi酶切位点。本发明对所述同源重组的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的同源重组方式即可，例如采用限制性内切酶对扩增的水稻三明显性核不育基因sdgms片段和骨架载体进行双酶切，酶切后的基因片段与线性载体连接得到重组载体。所述验证的方法将连接产物转化入大肠杆菌感受态中，经过抗性筛选得到阳性转化子，再对阳性转化子进行测序，测序片段为预期序列，则说明成功构建重组载体。
[0188]
鉴于所述基因sdgms为显性核不育基因，可改变野生型水稻的育性，本发明提供了所述水稻三明显性核不育基因sdgms、所述蛋白质或所述重组载体在调控水稻三明显性核不育性状中的应用。
[0189]
鉴于所述基因sdgms为显性核不育基因，导入野生型水稻品种中，可创建显性核不育系，本发明提供了所述水稻三明显性核不育基因sdgms或所述重组载体在培育和/或构建不育水稻品系中的应用。
[0190]
在本发明中，所述培育不育水稻品系的方法为将携带所述水稻三明显性核不育基因sdgms的水稻品系与目标性状的水稻品系进行杂交，杂交后代得到不育水稻品系。所述构建不育水稻品系的方法优选为将携带所述水稻三明显性核不育基因sdgms的克隆至载体中，得到的重组载体在农杆菌介导下转入水稻愈伤组织中，经过遗传转化体系的培育，得到不育水稻品系。
[0191]
在本发明中，所述水稻三明显性核不育基因sdgms优选联合提高所述sdgms表达的元件在培育不育水稻品系中的应用，所述元件优选包括玉米ubiquitin启动子。所述玉米ubiquitin启动子的核苷酸序列优选如seq id no:4(ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccct
ctctagagataatgagcattgc atgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcaccggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcag)所示。在本发明实施例中，采用玉米ubiquitin启动子替代水稻三明显性核不育基因sdgms中原本启动子构建超表达载体，有利于提高基因sdgms的表达量，从而使转基因水稻品系的表型变现为完全不育性。本发明对所述野生型水稻品系的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的野生型水稻品系均可，在本发明实施例中，以日本晴作为野生型水稻品系进行转基因实验，但不能理解为对本发明保护范围的限制。
[0192]
本发明提供了所述水稻三明显性核不育基因sdgms、所述蛋白质作为标志物在检测或鉴定三明显性核不育水稻品系中的应用。
[0193]
在本发明中，所述水稻三明显性核不育基因sdgms的检测方法，优选为通过pcr扩增的方法检测待测水稻品系中是否存在水稻三明显性核不育基因sdgms。在本发明中，所述pcr扩增的方法同上，在此不做赘述。
[0194]
下面结合实施例对本发明提供的一种水稻三明显性核不育基因sdgms及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0195]
实施例1
[0196]
水稻三明显性核不育基因sdgms的精细定位
[0197]
杨茂泽等(2012)将控制水稻三明显性核不育性质的相关基因定位于8号染色体两个in-del标记zm30和zm9之间，区间参考日本晴基因组约99kb。发明者以938背景近等基因系(bc7f1)为材料(https://www.ricedata.cn/variety
[0198]
/varis/614634.htm)对控制水稻三明显性核不育性质的相关基因进行精细定位，在前人的研究基础上将候选区间扩大至nip参考基因组约500kb。为了克隆该基因，发明人在将938背景不育株与野生型938进行回交，并于海南陵水种植回交后代单株，并对393株单株进行育性考察，可育株与不育株数量分别为189株和204株，符合1:1分离(x2＝0.57)，结果表明三明显性核不育为单位点显性遗传。由于用于定位的亲本材料没有参考基因组，根据ricevarmap2(http://ricevarmap.ncpgr.cn/)网站信息对群体构建过程中使用的水稻亲本938、basmati370以及三明显性核不育突变来源亲本se21s的系谱相关亲本zs97、农垦58进行多态性分析，并针对候选区间内可能的in-del变异开发分子标记。利用分子标记xch43和xch95筛选重组单株，共筛选到的188株重组单株，并将sdgms定位于标记xch7与sm1之间，对应日本晴参考基因组约53.3kb区域(水稻tigr/msu注释6.1版，http://rice.plant biology.msu.edu/)。
[0199]
其中分子标记的对应引物：
[0200]
xch43-f:5
’‑
gagttgagaaggctaaaacgact-3’(seq id no:20)；
[0201]
xch43-r:5
’‑
tgtttccccttctgtttgcc-3’(seq id no:7)；
[0202]
xch95-f:5
’‑
attccctagtggttgcagct-3’(seq id no:8)；
[0203]
xch95-r:5
’‑
aggcttcagctccgacttag-3’(seq id no:9)；
[0204]
xch7-f:5
’‑
gagatagtggtggaggtggatgc-3’(seq id no:10)；
[0205]
xch7-r:5
’‑
gcacttgtactcccatttctcaacc-3’(seq id no:11)；
[0206]
sm1-f:5
’‑
gactttctagcattgcccatat-3’(seq id no:12)；
[0207]
sm1-r:5
’‑
ggcgaaggggaattggaataac-3’(seq id no:13)。
[0208]
实施例2三明显性核不育基因组bac文库的构建和目的bac的测序
[0209]
精细定位过程中，发明人推测定位区间内可能存在较大的结构变异，因此构建了三明显性核不育938背景近等基因系(bc7f1)的全基因组bac文库。共包含36480个单克隆，保存于95块384孔板中，平均插入片段约110kb，覆盖水稻基因组约10倍。利用定位区间的标记xch7和xch95在bac文库中共筛选到两个包含目标区间片段的bac62-h-5和9-b-10，通过对两个标记的测序确定了62-h-5为可育基因型，而9-b-10为不育基因型。通过对两个bac片段的测序，并与日本晴和珍汕97参考基因组进行序列比对分析确定了sdgms(seq id no:1)是定位区间内唯一的候选基因。
[0210]
xch7-f:5
’‑
gagatagtggtggaggtggatgc-3’(seq id no:14)；
[0211]
xch7-r:5
’‑
gcacttgtactcccatttctcaacc-3’(seq id no:15)
[0212]
xch95-f:5
’‑
attccctagtggttgcagct-3’(seq id no:16)
[0213]
xch95-r:5
’‑
aggcttcagctccgacttag-3’(seq id no:17)。
[0214]
实施例3：sdgms的转基因互补试验
[0215]
根据预测的候选基因全长序列，设计一对带有限制性核酸内切酶kpni和bamhi接头的pcr扩增寡核苷酸引物，其引物序列如seq id no:3(5
’‑
atgattacgaattcgagctcggtac
cgactcgacggggacagctag-3’，下划线为限制性内切酶kpni切点)和seq id no:4(5
’‑
gcctgcaggtcg actctagaggatccgaagactgaagcgaagtgcc-3’下划线为限制性内切酶bamhi切点)所示。
[0216]
用pcr技术从bac片段9-b-10中将含有启动子、编码区和下游终止序列的长度为9064bp片段扩增出来。pcr反应体系如下：在50μl反应中含有1
×
反应缓冲液，200μm的dntps，200ngbac-dna，引物各0.3μm，kodfx聚合酶1.0u。反应程序如下：步骤一：98℃2min。步骤二：98℃10s，58℃10s，68℃10min(35个循环)。步骤三：68℃15min。步骤四：25℃1min。反应结束后把pcr产物进行纯化。用限制性内切酶kpni和bamhi把载体pcambia1301(cambia公司，canberra,australia)进行切割后，通过同源重组的方法把pcr产物连接到载体上。经过测序挑选出无突变的正确克隆载体导入农杆菌eha105中。将日本晴的成熟种子在诱导培养基上诱导出愈伤组织。
[0217]
把含有目的基因转化载体的eha105侵染日本晴的愈伤组织，经过共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因的水稻小植株。
[0218]
其中，遗传转化的主要步骤、培养基及其配制方法如下所述：
[0219]
(1)试剂和溶液缩写
[0220]
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)；cn(carbenicillin，羧苄青霉素)；kt(kinetin，激动素)；naa(napthaleneaceticacid，萘乙酸)；iaa(indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-d(2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；as(acetosringone，乙酰丁香酮)；ch(caseinenzymatichydrolysate，水解酪蛋白)；hn(hygromycinb，潮霉素)；dmso(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜)；n6max(n6大量元素成分溶液)；n6mix(n6微量元素成分溶液)；msmax(ms大量元素成分溶液)；msmix(ms微量元素成分溶液)
[0221]
(2)主要溶液配方
[0222]
1)n6
max
培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10
×
)配制)：
[0223][0224]
将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml，室温储存。
[0225]
2)n6
min
培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100
×
)配制)：
[0226][0227]
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml，室温储存。
[0228]
3)铁盐(fe
2+
edta)贮存液(按照100
×
浓缩液配制)：
[0229]
将3.73g乙二铵四乙酸二钠(na2edta
·
2h2o)和2.78gfeso4·
7h2o分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。
[0230]
4)维生素贮存液(按照100
×
浓缩液配制)：
[0231][0232]
加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。
[0233]
5)ms培养基大量元素母液(ms
max
母液)(按照10
×
浓缩液配制)：
[0234][0235]
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml，室温储存。
[0236]
6)ms培养基微量元素母液(ms
min
母液)(按照100
×
浓缩液配制)：
[0237][0238]
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml，室温储存。
[0239]
7)2,4-d贮存液(1mg/ml)的配制：
[0240]
秤取2,4-d100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。
[0241]
8)6-ba贮存液(1mg/ml)的配制：
[0242]
秤取6-ba100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
[0243]
9)萘乙酸(naa)贮存液(1mg/ml)的配制：
[0244]
秤取naa100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃避光保存。
[0245]
10)吲哚乙酸(iaa)贮存液(1mg/ml)的配制：
[0246]
秤取iaa100mg，用1ml1n氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃避光保存。
[0247]
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：
[0248]
秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
[0249]
12)as贮存液的配制：
[0250]
秤取as0.392g，加入dmso10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，-20℃保存备用。
[0251]
13)1n氢氧化钾贮存液配制：
[0252]
秤取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。
[0253]
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方：
[0254]
1)诱导培养基
[0255][0256]
加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(30ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌15min，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
[0257]
2)继代培养基：
[0258][0259]
加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(30ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
[0260]
3)预培养基(粳稻可以不做这一步)：
[0261][0262]
加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
[0263]
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
[0264]
4)悬浮培养基：
[0265][0266]
加蒸馏水至100ml，调节ph值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。
[0267]
使用前加入1ml无菌葡萄糖贮存液和100μlas贮存液。
[0268]
5)共培养基：
[0269][0270]
加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
[0271]
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlas贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
[0272]
6)筛选培养基：
[0273][0274]
加蒸馏水至250ml，调节ph值到6.0，封口，按上述方法灭菌。
[0275]
使用前溶解培养基，加入250μlhn(50mg/ml)和400μlcn(10gcn/36ml水)分装倒入培养皿中(25ml/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400mg/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250mg/升)。
[0276]
7)预分化培养基(粳稻可以不做这一步)：
[0277][0278]
加蒸馏水至250ml，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，封口，按上述方法灭菌。
[0279]
使用前溶解培养基，250μlhn(50mg/ml)250μlcn(250mg/ml)，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
[0280]
8)分化培养基：
[0281][0282][0283]
加蒸馏水至900ml，1n氢氧化钾调节ph值到6.0。
[0284]
煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
[0285]
9)生根培养基
[0286][0287]
加蒸馏水至900ml，用1n氢氧化钾调节ph值到5.8。
[0288]
煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法灭菌。
[0289]
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤：
[0290]
3.1愈伤诱导
[0291]
1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞(hgcl2)种子表面消毒15min；
[0292]
2)用灭菌水洗种子4-5次；
[0293]
3)将8-10粒种子放在诱导培养基上；
[0294]
4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4～5周，温度26
±
1℃。
[0295]
3.2愈伤继代：
[0296]
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的日本晴种子胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25
±
1℃。
[0297]
3.3预培养：
[0298]
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度26
±
1℃。
[0299]
3.4农杆菌培养：
[0300]
1)在带有对应抗性选择的la培养基(la培养基的配制参照j.萨姆布鲁g等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上划线预培养农杆菌eha105(该菌株来自cambia公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；
[0301]
2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
[0302]
35农杆菌侵染：
[0303]
1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
[0304]
2)调节农杆菌的悬浮液至od
600
至0.8～1.0；
[0305]
3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30min；
[0306]
4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19～20℃。
[0307]
3.6愈伤洗涤和选择培养：
[0308]
1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
[0309]
2)浸泡在含400mg/l羧苄青霉素(cn)的灭菌水中摇30min；
[0310]
3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
[0311]
4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次每次2周至长出好的抗性愈伤。
[0312]
3.7分化：
[0313]
1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；
[0314]
2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，每瓶平均分布三个独立的愈伤，光照下培养5周-6周至长出大的苗子，温度26℃。
[0315]
3.8生根与炼苗：
[0316]
1)剪掉分化时产生的老根；
[0317]
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周至长出大的苗子后去掉封口膜加部分自来水炼苗一周再移栽，温度26℃。
[0318]
3.9移栽
[0319]
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润，等长势很壮再移栽至大田。
[0320]
4.0转基因阳性植株的鉴定
[0321]
取转基因植株叶片并抽提总dna，使用hygr基因(该基因位于转化载体上，作为筛选抗性基因，会随着目标基因一同插入水稻基因组)的扩增引物鉴定转基因阳性植株。
[0322]
hygr-f:5
’‑
acactacatggcgtgatttcat-3’(seq id no:18)；
[0323]
hygr-r:5
’‑
tccactatcggcgagtacttct-3’(seq id no:19)。
[0324]
本发明共获得独立转基因互补t0代水稻植株25株，包括18株阳性单株和7株阴性单株。将阳性植株种植在大田中，待水稻抽穗开花时取花粉用碘化钾染色镜检，对t0代进行小穗育性考察。小穗育性考察的方法根据结实率来判断，其中结实率公式如公式i所示。
[0325]
结实率(％)＝(每穗实粒数/每穗颖花数)
×
100％公式i
[0326]
转基因阴性单株的小穗育性与野生型日本晴(nip)相比没有显著差异，转基因阳性单株有5株小穗育性为0，表现为完全不育；其余单株小穗育性也低于35％，与转基因阴性和野生型nip相比有明显下降。
[0327]
收获t0代植株的种子后将其种植在田间继续观察t1代表型。在成熟期进行表型考察，对t1代单株进行阳性检测(检测方法同上)，同时进行小穗育性考察、花粉碘染。
[0328]
结果显示，带有转基因片段的阳性单株小穗育性下降明显，均低于30％，而阴性单株小穗育性约为70％。同时我们t0代完全不育两个单株与野生型nip进行回交，对回交家系进行阳性检测及小穗育性考察。结果显示携带转基因片段的单株表现出不育表型，大量单株小穗育性为0，仅有少数单株有少量结实，花粉碘染结果显示家系中不育单株无花粉粒或仅存少量未染色皱缩花粉粒；转基因阴性单株结实情况与野生型nip相似，表现为正常可育。
[0329]
将启动子更换为玉米ubiquitin启动子使得sdgms表达量上升，具体操作步骤如下：
[0330]
根据预测的候选基因全长序列，设计一对带有限制性核酸内切酶kpni和bamhi接头的pcr扩增寡核苷酸引物，其引物序列如seq id no:5(5
’‑
accatttacgaacgatagccggtacctggcagcaaaccaaatatga-3’，下划线为限制性内切酶kpni切点)和seq id no:6(5
’‑
tgatttttgcggactctagaggatcccccatctcgccattcttct-3’下划线为限制性内切酶bamhi切点)所示。
[0331]
用pcr技术从bac片段9-b-10中将含有启动子、编码区和下游终止序列的长度为7377bp片段扩增出来。pcr反应体系如下：在50μl反应中含有1
×
反应缓冲液，200μm的dntps，200ngbac-dna，引物各0.3μm，kodfx聚合酶1.0u。反应程序如下：步骤一：98℃2min。步骤二：98℃10s，58℃10s，68℃10min(35个循环)。步骤三：68℃15min。步骤四：25℃1min。反应结束后把pcr产物进行纯化。用限制性内切酶kpni和bamhi把载体pcambia1301u(cambia公司，canberra australia，characterization ofos bzip23 as a key player of the basic leucine zipper transcription factorfamily.yong xiang,ning tang,hao du,haiyan ye,lizhong xiong plant physiology,2008,148(4):1938-1952 doi:10.1104/pp.108.128199)进行切割后，通过同源重组的方法把pcr产物连接到载体上(见图4)。经过测序挑选出无突变的正确克隆载体导入农杆菌eha105中。将日本晴的成熟种子在诱导培养基上诱导出愈伤组织。
[0332]
将构建成功的携带玉米ubiquitin启动子和sdgms基因的重组载体采用上述遗传转化体系的构建方法转入野生型日本晴中采用上述方法鉴定转基因阳性植株同时检测转基因阳性植株的小穗育性。
[0333]
结果表明，转基因阳性单株表型为完全不育。
[0334]
本实验的结果说明，将显性核不育基因sdgms转化导入野生型水稻品种，可创造显
性核不育系；同时增高sdgms表达水平能够增加不育程度。此实验也证明了该基因具有显性核不育的生物学功能。本发明将这个从三明显性核不育材料来源的sdgms座位克隆获得的基因确认为目的基因，即三明显性核不育基因sdgms。
[0335]
以上所述仅是本发明的优选实施方式应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说在不脱离本发明原理的前提下还可以做出若干改进和润饰这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种水稻三明显性核不育基因sdgms，其特征在于，包括以下dna片段：1)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna片段；2)在项1)的基础上进行若干个碱基的替换、缺失或插入，且表达产物与seq id no:1所示dna片段的表达产物具有相同功能的dna片段；3)编码氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质的dna片段；4)核苷酸序列如seq id no:3所示的dna片段。2.一种权利要求1所述水稻三明显性核不育基因sdgms编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如seq id no:2所示。3.一种包含权利要求1所述水稻三明显性核不育基因sdgms的重组载体。4.根据权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架载体包括pcambia1301。5.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于，所述水稻三明显性核不育基因sdgms在骨架载体中的插入位置为kpni和bamhi多克隆位点。6.权利要求1所述水稻三明显性核不育基因sdgms、权利要求2所述蛋白质或权利要求3～5中任意一项所述重组载体在调控水稻三明显性核不育性状中的应用。7.权利要求1所述水稻三明显性核不育基因sdgms或权利要求3～5中任意一项所述重组载体在培育和/或构建不育水稻品系中的应用。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述水稻三明显性核不育基因sdgms联合提高所述sdgms表达的元件在培育和/或构建显性不育水稻品系中的应用。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述元件包括玉米ubiquitin启动子；所述玉米ubiquitin启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示。10.权利要求1所述水稻三明显性核不育基因sdgms、权利要求2所述蛋白质作为标志物在检测或鉴定三明显性核不育水稻品系中的应用。

技术总结
本发明提供了一种水稻三明显性核不育基因SDGMS及其应用，属于功能基因技术领域。本发明通过精细定位确定水稻三明显性核不育基因SDGMS的基因组位置。本发明将显性核不育基因SDGMS转化导入野生型水稻品种，可创造显性核不育系；同时提高SDGMS表达水平能够增加不育程度。本发明提供的SDGMS基因具有显性核不育的生物学功能，可调控水稻三明显性核不育性状，在培育和/或构建不育水稻品系以及检测或鉴定三明显性核不育水稻品系中的应用。鉴定三明显性核不育水稻品系中的应用。鉴定三明显性核不育水稻品系中的应用。


技术研发人员：张启发 欧阳亦聃 徐聪昊 黄显波
受保护的技术使用者：湖北洪山实验室 湖北稻道鸿业生物科技有限公司 三明市农业科学研究院
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/8/9