一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用

一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因atfax3基因与应用
技术领域
1.本发明属于分子育种技术领域，涉及一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因atfax3基因与应用。


背景技术：

2.由于关于质体中的脂肪酸向外运输的膜转运蛋白报道很少，因此脂肪酸运出质体的机制一直存在很大的争议。李楠楠等首次在拟南芥中对atfax1进行了研究，研究人员分离出fax1，并对其功能进行验证。他们发现这种叶绿体质膜定位的转运体对于生物量产生、雄性育性以及脂肪酸衍生化合物(如脂类、蜡或花粉粒的细胞壁物质)的合成至关重要(li nannan,et al."fax1,a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export.."plant biology 13.2(2015):doi:10.1371/journal.pbio.1002053.)。此外，还有研究发现在衣藻和甘蓝型油菜中，fax1也在质体转运脂肪酸的过程中起作用([1]li nannan,et al."characterization of fatty acid exporters involved in fatty acid transport for oil accumulation in the green alga chlamydomonas reinhardtii.."biotechnology for biofuels
[0003]
12.1(2019):doi:10.1186/s13068-018-1332-4.[2]xiao zhongchun,et al."the brassica napus fatty acid exporter fax1-1 contributes to biological yield,seed oil content,and oil quality.."biotechnology for biofuels 14.1(2021):doi:10.1186/s13068-021-02035-4.)。
[0004]
李楠楠团队的另外一项研究中，进一步证明了质体包膜定位蛋白fax2和fax4作为种子胚胎质体中进行三酰基甘油(tag)生物合成的fa输出体，主要作用在拟南芥种子灌浆过程中fa从质体运输到er中进行tag的生物合成(li nannan,et al."two plastid fatty acid exporters contribute to seed oil accumulation in arabidopsis.."plant physiology 182.4(2020):doi:10.1104/pp.19.01344.)。
[0005]
近期研究表发现，opda1在杨树的损伤胁迫调控中发挥重要作用，并且opda1过表达植株的茉莉酸含量以及与茉莉酸合成相关基因的表达量升高。此外，opda1还定位于杨树叶片叶绿体内层。atfax3作为调控opda1输出的候选基因之一，猜测其也可能在提高植株损伤胁迫中起作用(zhao xin,et al."opdat1,a plastid envelope protein involved in 12-oxo-phytodienoic acid export for jasmonic acid biosynthesis in populus.."tree physiology 41.9(2021):doi:10.1093/treephys/tpab037.)。
[0006]
目前的研究发现，fax/tmemb_14家族成员作为膜内转运蛋白在质体脂肪酸输出中起到转运作用。fax蛋白在拟南芥中有7个同源物，被命名为fax1-7。atfax1-4被预测定位在质体膜中，并被预测参与植物中的脂质转运。其中fax3与fax4的dna序列相似，进化树也显示二者亲缘关系较近。然而目前对于fax3的研究还非常少，因此，申请人拟验证fax3是否具有转运脂肪酸的功能以及在膜脂合成方面起作用，并且进一步探究fax3调控种子中油脂的积累的机制。为培育出油脂产量更高，品质更好的油料作物提供新思路。


技术实现要素：

[0007]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因atfax3基因与应用，该基因定位于质体包膜，可以参与脂肪酸的跨膜转运，是首次确定fax3主要作用于角果皮，影响角果皮质体中脂肪酸的转运，进而探究其在膜脂合成、种子发育所需碳源供应方面的作用机制。最终确认fax3在种子油脂合成积累的调控作用。
[0008]
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009]
1、一种脂肪酸转运蛋白，包括a)或b)的蛋白质：
[0010]
a)由如seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011]
b)将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加与植物脂肪酸转运能力相关的蛋白质。
[0012]
2、编码前述脂肪酸转运蛋白的基因，即atfax3基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0013]
3、含有前述基因的表达盒。
[0014]
4、含有前述基因或表达盒的重组载体。
[0015]
5、含有前述基因或表达盒的重组质粒。
[0016]
6、含有前述基因、表达盒或重组载体的重组菌。
[0017]
7、含有前述基因、表达盒或重组载体的转基因植物细胞系。
[0018]
8、前述脂肪酸转运蛋白、基因、表达盒、重组载体、重组质粒、重组菌或转基因植物细胞系在调控植物种子油脂合成中的应用。
[0019]
作为优选的技术方案之一，所述植物为拟南芥。
[0020]
作为进一步优选的技术方案之一，所述脂肪酸转运蛋白参与拟南芥质体脂肪酸跨膜转运过程、影响角果皮和种子连接处细胞的发育、种子形态以及调控油脂合成。
[0021]
作为优选的技术方案之一，所述脂肪酸转运蛋白定位于质膜，主要作用于角果皮，从而转运脂肪酸。
[0022]
9、一种构建转基因植物的方法，使前述脂肪酸转运蛋白在拟南芥中过表达或敲除，进而影响拟南芥质体中的脂肪酸转运，改变(提高/降低)种子中油脂合成量。
[0023]
作为优选的技术方案之一，过表达或敲除的方法为：向拟南芥中导入35s驱动的前述脂肪酸转运蛋白的编码基因，或者敲除所述编码基因。定位于质膜，过表达会提高种子含油量，而敲除会使油脂含量显著下调。
[0024]
本发明的有益效果在于：
[0025]
本发明首次对拟南芥(arabidopsis thaliana)中对fax3的定位及功能进行探究。利用生物信息学分析，比对不同物种中fax家族成员的蛋白序列，推测fax3的作用机制。然后开展相关实验，证明了atfax3参与叶绿体内脂肪酸跨膜转运过程，并且主要在角果皮中起作用，从而影响拟南芥种子中的油脂合成。本发明为提高种子含油量以及品质提供了新的思路。
[0026]
具体优势如下：
[0027]
1)本发明成功克隆了拟南芥atfax3基因，并将其转运蛋白应用到提高油脂含量研究中去。通过进行功能验证相关实验，证明了atfax3可以参与脂肪酸的跨膜转运，并影响种子中的能量分配。
[0028]
2)首先在拟南芥中敲除fax3，发现拟南芥表现出种子油脂含量显著降低，角果皮细胞叶绿体内脂滴增多。为探究种子油脂合成和提高产油量提供新思路。
附图说明
[0029]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
[0030]
图1是本发明拟南芥rna的提取(a)及atfax3的扩增(b)，m为marker，1，2，3，4为四个重复的扩增结果；
[0031]
图2是本发明野生型拟南芥(wt)和转基因拟南芥过表达株系#1,#2,#8,#10,#12。m为marker；h为dna-free water；wt为野生型；1,2,3,4,5一次对应过表达株系
[0032]
#1,#2,#8,#10,#12。
[0033]
图3是本发明atfax3在拟南芥各组织中的表达水平检测；
[0034]
图4是本发明野生型拟南芥(wt)和转基因拟南芥过表达(atfax3-wt)株系#1、
[0035]
#2、#8、#10、#12基因表达水平验证；
[0036]
图5是本发明atfax3突变株系3、12序列分析(a)和fax3半定量电泳图(b)，actin作为内参基因，wt、atfax3#3和atfax3#12各两个技术重复；
[0037]
图6是fax3过表达和突变体干种子形态观察与分类，根据干种子大小，将种子分为large、normal、small和shrunken四种类型；
[0038]
图7是对不同发育时期各品系角果中的种子形态观察(a)和统计(b)，daf：开花后天数。
[0039]
图8是拟南芥角果皮模式图(a)和atfax3突变体角果皮切片的透射电镜观察(b)。模式图中方框内为具体的切片位置。
具体实施方式
[0040]
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0041]
实施例1拟南芥(arabidopsis thaliana)atfax3基因的克隆方法
[0042]
通过生工ez-10dnaaway rna提取试剂盒从拟南芥的嫩叶中提取rna，电泳检测rna质量(如图1中a)。利用takara公司的反转录试剂盒将其mrna反转录成cdna；以该cdna作为pcr模板，扩增得到atfax3-cds片段，引物组合：
[0043]
atfax3-oe-f：5'-atgaggtctcgcaccatggcggatttgat tttgagttc-3'，如seq id no.3所示；
[0044]
atfax3-oe-r：3'-atgaggtctctcgccgtggaggctgcgcatgataccgt-5'，如seq id no.4所示；
[0045]
为atfax3基因过表达克隆。
[0046]
为了获得fax3突变体株系，设计双靶点
[0047]
t1：5'-ccactgcttcaccgatccga-3'；
[0048]
t2：5'-ctcggtgcagtagttccctc-3'，以atu6-29载体质粒(购自武汉艾迪晶生物有限公司)作为启动子驱动靶基因表达。以atfax3基因过表达克隆为例，pcr(聚合酶链式反应)方法与程序见表1。
600为0.2～0.4。无菌操作，将二活的农杆菌菌液倒入50ml离心管中4000rpm离心15min，去上清，加入100ml重悬液【0.22g ms(包含维生素的植物无菌培养基基盐)，5g蔗糖】，用移液枪吸打混匀，移入培养皿中，
[0061]
在培养皿中加入30ul表面活性剂silwet l-77，继续吹扫使三者融合。将开花后的拟南芥剪去已经授粉的花以及角果，其余盛开的花浸入培养皿中35s，然后暗培养2d(暗培养时需将拟南芥放倒)。暗培养结束后，在16h/8h昼夜循环(100μmol photons-m-2-s-1)，20℃～22℃条件下培养约两个月收种。
[0062]
实施例3转基因拟南芥的验证
[0063]
将用浸花法转化的拟南芥植株种子(t0)消毒后铺在含有25mg/l潮霉素的1/2ms培养基上进行筛选。培养7天后，将长出的拟南芥移入营养土中继续培养，2个月后收获种子(t1)。将t1代种子消毒后铺在含有25mg/l潮霉素的1/2ms培养基上生长7天，若发芽生根率为100％，则为阳性纯合。
[0064]
用sds方法提取抗性植株的全基因组dna，以pcr的方法扩增标记基因片段，筛选出阳性植株。以该dna作为pcr模板，使用promega公司的2
×
rapid taq master mix聚合酶，以及dna验证性引物
[0065]
atfax3-oe-1-f：5'-gagcacgcctctgtctatg-3'，如seq id no.5所示；
[0066]
atfax3-oe-1-r：3'-gctcaggtagtggttgtcg-5'，如seq id no.6所示；
[0067]
扩增得到相应的片段，pcr方法与程序pcr反应体系与基因扩增程序与基因扩增一致。
[0068]
扩增片段的电泳显示，该基因片段大小约为1000bp左右，与预测的片段大小970bp一致(图2)。m为2000bp的dna marker，wt为野生型拟南芥，1,2,3,4,5分别为转基因拟南芥株系p35s::fax3-gfp#1,#2,#8,#10,#12。
[0069]
实施例4拟南芥atfax3基因的组织表达量水平检测和定位
[0070]
选取温室中生长状态良好的一个月的拟南芥植株材料(材料分为根、茎、新叶、老叶、花、开花后4天、10天、16天的角果)，通过ez-10dnaaway rna mini-preps提取试剂盒提取其rna；然后利用takara公司反转录试剂盒(rr047a)进行cdna的反转录合成，以cdna为模板釆用promega公司的qpcr master mix a6002试剂对基因进行qpcr实验。参比基因引物：
[0071]
qpcr-atactin2-pf：5'-gtcgccatccaagctgttc-3'，如seq id no.7所示；
[0072]
qpcr-atactin2-pr：3'-ggatggcatgaggaagagag-5'，如seq id no.8所示；
[0073]
目的基因引物：
[0074]
qpcr-atfax3-pf：5'-gctgttctgctgtatgtc-3'，如seq id no.9所示；
[0075]
qpcr-atfax3-pr：3'-gtatcgggttcccattacg-5'，如seq id no.10所示。
[0076]
其他相关操作步骤见表4(实时荧光定量反应体系)。
[0077]
表4.实时荧光定量反应体系
[0078][0079]
反应条件如下：95℃,10min；95℃,15s；60℃,1min；40个循环，65℃,5s。退火温度依引物不同而异，本研究中采用atactin2(at3g18780)作为内参基因。
[0080]
每个样品设三个平行重复，以加入野生型拟南芥模板的反应体系为对照。配好的反应体系放入quantstudio
tm 1real-time(abi公司)荧光定量pcr仪中进行pcr反应程序。程序结束后，利用溶解曲线tm值判断产物单一性以及溶解温度。通过目的基因和参比基因比值的数值，得出相对于内参基因的目的基因的相对表达量，最后进行样品间相对表达量的比较。独立重复上述步骤两次，将所得数据用quantstudio
tm design&analysis softwa软件进行分析作图。图3为atfax3在各组织中的表达水平检测，数据结果表明：atfax3在角果中表达量最高，特别是开花后14天的角果中表达量很高。
[0081]
实施例5野生型拟南芥与转基因拟南芥atfax3基因的表达量水平检测
[0082]
取温室中生长状态良好的同期野生型拟南芥及转基因拟南芥中叶，通过生工ez-10dnaaway rna提取试剂盒提取rna，并将mrna用taraka公司的反转录试剂盒反转录成cdna，利用cdna做模板进行实时荧光定量pcr的检测实验(方法同上)。野生型和不同株系过表达拟南芥中atfax3基因中的表达水平结果见图4。转基因植株相比野生型atfax3基因的表达量水平依次高了约47，23，2.5，2.3，1.5倍。野生型和fax3突变株系#3，#12的mrna反转录成cdna用于碱基测序，所得结果见图5中a。再进行pcr扩增，并通过琼脂凝胶电泳仪测定pcr产物的数量(如图5中b)。
[0083]
实施例6转基因拟南芥种子的形态分类
[0084]
当详细检查种子的形态时，我们将fax3突变株系的种子分为4组：正常、大、小和萎缩(图6)。当我们用体视显微镜(stereo discovery v20,zeiss)观察不同发育时期的fax3突变体、atfax3-oe和野生型在8、14和18daf(daf：开花后天数)的种子形态观察。将18daf的单个角果中种子形态分成正常(normal)和不正常两类。与野生型相比，fax3#3大约有12.1％的种子萎缩或变小，fax3#12大约有20.1％的种子萎缩或变小(图7)
[0085]
实施例7野生型拟南芥与转基因拟南芥中进行拟南芥atfax3基因的脂肪酸转运的功能验证
[0086]
由于atfax3主要表达在角果的皮中高表达，因此申请人进一步研究了fax3突变体和野生型在发育中的子房的细胞学差异(图8中a)。为了观察野生型和fax3突变体株系的角果皮细胞质体内的脂滴情况。将选定的wt和fax3突变体10daf(daf：开花后天数)果实的果皮用2.5％(v/v)戊二醛(ph7.4，0.1m pbs配置)在室温下固定2小时以上，然后再4℃。用0.1m pbs缓冲液清洗组织，用质量浓度1％锇酸(ph7.4，0.1m pbs配置)在4℃后固定2小时，用0.1m pbs在4℃清洗四次，每次15分钟。然后用体积浓度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇水溶液梯度脱色20分钟，然后用无水乙醇：无水丙酮(体积比1:1)脱色20分钟，然后用无水丙酮：环氧树脂epon812(体积比2:1)在室温下进行3-4小时。100％丙酮：环氧树
脂epon812(1:2)室温下3-4小时，然后在室温下用纯包埋剂包埋2次，每次3-4小时。将样品放在pcr管中，用纯包埋剂包埋。将组织包埋在新鲜树脂中，并在60℃的烘箱中聚合48小时。在leica reichert ultracut s切片机上切下约70纳米厚的超薄切片。收集到涂有碳化的铜格上，用醋酸铀染色。然后用柠檬酸铅将切片染色10分钟。使用tecnai 12tem 100kv(phillips,eindhoven,the netherlands)检查记录切片，配备megaview ii ccd照相机和分析软件3.0版(soft imaging system gmbh,germany)。fax3突变体叶绿体中的脂滴比野生型叶绿体中的大20倍，这也使突变体的叶绿体结构变得混乱(图8中b)。
[0087]
以上结果说明，atfax3参与叶绿体内脂肪酸跨膜转运过程，并且主要在角果皮中起作用，当atfax3突变后，种子的形态也部分变小和皱缩，基于此，我们将进一步探索atfax3是否在拟南芥种子中的油脂合成中起作用。
[0088]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种脂肪酸转运蛋白，其特征在于，包括a)或b)的蛋白质：a)由如seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加与植物脂肪酸转运能力相关的蛋白质。2.编码权利要求1所述脂肪酸转运蛋白的基因，即atfax3基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示。3.含有权利要求2所述基因的表达盒。4.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述表达盒的重组载体。5.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述表达盒的重组质粒。6.含有权利要求2所述基因、权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体的重组菌。7.含有权利要求2所述基因、权利要求3所述表达盒或权利要求4所述重组载体的转基因植物细胞系。8.权利要求1所述脂肪酸转运蛋白、权利要求2所述基因、权利要求3所述表达盒、权利要求4所述重组载体、权利要求5所述重组质粒、权利要求6所述重组菌或权利要求7所述转基因植物细胞系在调控植物种子油脂合成中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥；所述脂肪酸转运蛋白参与拟南芥质体脂肪酸跨膜转运过程、影响角果皮和种子连接处细胞的发育、种子形态以及调控油脂合成；所述脂肪酸转运蛋白定位于质膜，主要作用于角果皮，从而转运脂肪酸。10.一种构建转基因植物的方法，其特征在于，使权利要求1所述脂肪酸转运蛋白在拟南芥中过表达或敲除，进而影响拟南芥质体中的脂肪酸转运，改变种子中油脂合成量。

技术总结
本发明公开了一种脂肪酸转运蛋白及其编码基因AtFAX3基因与应用。本发明首次对拟南芥(Arabidopsis thaliana)中对FAX3的定位及功能进行探究。利用生物信息学分析，比对不同物种中FAX家族成员的蛋白序列，推测FAX3的作用机制。然后开展相关实验，证明了AtFAX3参与叶绿体内脂肪酸跨膜转运过程，并且主要在角果皮中起作用，从而影响拟南芥种子中的油脂合成。本发明为提高种子含油量以及品质提供了新的思路。思路。思路。


技术研发人员：李楠楠 魏祥蕾 曹徐绿 娄旭阁 任岚扬
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/9