一种日本落叶松LkZFP36基因及其编码的蛋白质、应用、过表达载体和获取方法

一种日本落叶松lkzfp36基因及其编码的蛋白质、应用、过表达载体和获取方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程*领域，特别是涉及一种日本落叶松lkzfp36基因及其编码的蛋白质、应用、过表达载体和获取方法。


背景技术：

2.干旱通常指长期无雨或少雨，水分不足以满足人的生存和经济发展的气候现象。随着全球气温升高，降水格局发生变化，干旱等极端气候事件频繁发生，会影响植物的地理分布，限制植物产量，影响植物的观赏价值，制约植物生态效益。干旱对植物有非常广泛而深刻的影响和危害，干旱胁迫会导致植物的渗透势改变、细胞膜被破坏、色素含量减少、光合系统受影响、生长受到抑制、产量降低甚至死亡等。
3.在长期的干旱胁迫下植物自生分子机制会有不同程度的适应，植物抗旱性与相关基因、蛋白质的代谢密切相关，与之相关性研究是育种工作的基础，也是主流趋势。转录因子可特异性结合下游基因的核苷酸序列，产生相关调控蛋白来响应干旱胁迫。c2h2型锌指蛋白作为最大的转录因子家族之一，广泛存在于真核生物中，能够作为调控因子参与多种信号传导通路，在植物生长发育和非生物胁迫的过程中起到非常重要的作用。植物受到多种信号转导机制的调控，c2h2型锌指蛋白作为转录因子在植物的生长发育和逆境胁迫响应中都起着非常重要的作用。截至目前，已在拟南芥、杨树、马铃薯、葡萄等多个物种鉴定出c2h2型锌指蛋白并进行研究，而落叶松中c2h2型锌指蛋白的研究很少有报道。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种日本落叶松lkzfp36基因及其编码的蛋白质、应用、过表达载体和获取方法，本发明提供了日本落叶松lkzfp36基因抗干旱能力的新用途。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种日本落叶松lkzfp36基因，所述日本落叶松lkzfp36基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了一种上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高日本落叶松抗旱能力中的应用。
9.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松含水量中的应用。
10.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松可溶性糖含量中的应用。
11.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱
胁迫下日本落叶松脯氨酸含量中的应用。
12.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在促进清除干旱胁迫下日本落叶松超氧化物歧化酶中的应用。
13.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在促进清除干旱胁迫下日本落叶松过氧化物酶中的应用。
14.本发明还提供了一种过表达载体，将上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因插入到pcambia1300-35s-gfp载体中，得到。
15.本发明还提供了一种获取抗干旱日本落叶松的方法，包括以下步骤：
16.将上述技术方案所述的过表达载体转化到农杆菌中，得到转化菌；
17.将得到的转化菌侵染日本落叶松的胚性愈伤组织，培养得到抗干旱日本落叶松。
18.本发明公开了lkzfp36基因及其应用，本发明利用农杆菌介导法过表达该基因，获得的日本落叶松转基因愈伤组织，有效地提高了落叶松对干旱胁迫下的耐受性的特征。在干旱胁迫下，转基因愈伤组织相较于野生型生长状态明显较好，初步表明在干旱胁迫下，过表达lkzfp36转基因的愈伤组织受到的损伤相对较轻，其具有较优的抗旱性。
19.在干旱胁迫处理下，转基因愈伤组织的脱水情况明显低于野生型，说明转基因愈伤组织的生长状况是明显优于野生型的，转基因愈伤组织抗旱性也高于野生型。此外，通过生理指标的测定，经比较后发现在干旱胁迫下，转基因愈伤组织脯氨酸和可溶性糖含量均高于野生型，受到胁迫的伤害较低，而野生型的愈伤组织受到胁迫的伤害较重，也验证了lkzfp36基因的过表达愈伤组织抗旱能力明显高于野生型。通过本发明发现lkzfp36特异性地提高落叶松在干旱胁迫下的抗性，可培育出抗干旱的转lkzfp36基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
21.图1为本发明中日本落叶松lkzfp36基因pcr产物的胶回收电泳图，其中m为dl2000 dnamarker，1-4为pcr产物；
22.图2为本发明中日本落叶松lkzfp36基因的核苷酸与氨基酸序列；
23.图3为本发明中日本落叶松lkzfp36基因构建到pcambia1300-35s-sgfp过表达载体的pcr图，其中m为dl2000 dna marker，1-4为lkzfp36基因；
24.图4为本发明中lkzfp36基因过表达胚性愈伤组织的获得；
25.图5为本发明中lkzfp36基因过表达胚性愈伤组织dna水平上的检测；
26.图6为本发明中lkzfp36基因过表达胚性愈伤组织rna水平定量分析；
27.图7为本发明中lkzfp36基因转基因与野生型胚性愈伤组织在7％peg6000胁迫下7天后下的表型观察；
28.图8为本发明中lkzfp36基因转基因与野生型胚性愈伤组织的相对含水量；
29.图9为本发明中lkzfp36基因转基因与野生型胚性愈伤组织可溶性糖含量；
30.图10为本发明中lkzfp36基因转基因与野生型胚性愈伤组织脯氨酸含量；
31.图11为本发明中lkzfp36基因转基因与野生型胚性愈伤组织可溶性蛋白含量；
lysala phe alaasn arg alaarg asn seralapro ala ile val pro ala ser phe tyr glymet his arg pro ala gly ser ser leu serile pro his arg met ser val phe gly cysgly ile pro leu pro ser pro alaala serpro phe pro tyr phe leuasp tyr gln hishis glnala pro val gly leu gly phe glyserala leuarg proala thrvalarg leuserarg phe tyrval pro metmetargalaval glyasp gln thr cys ile pro。
38.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高日本落叶松抗旱能力中的应用。
39.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松含水量中的应用。
40.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松可溶性糖含量中的应用。
41.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松脯氨酸含量中的应用。
42.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在促进清除干旱胁迫下日本落叶松超氧化物歧化酶中的应用。
43.本发明还提供了过表达上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因在促进清除干旱胁迫下日本落叶松过氧化物酶中的应用。
44.本发明还提供了一种过表达载体，将上述技术方案所述的日本落叶松lkzfp36基因插入到pcambia1300-35s-gfp载体中，得到。本发明对所述日本落叶松lkzfp36基因插入到pcambia1300-35s-gfp载体的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规方法操作即可。
45.本发明还提供了一种获取抗干旱日本落叶松的方法，包括以下步骤：
46.将上述技术方案所述的过表达载体转化到农杆菌中，得到转化菌；
47.将得到的转化菌侵染日本落叶松的胚性愈伤组织，培养得到抗干旱日本落叶松。
48.本发明对所述过表达载体转化到农杆菌中的方法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规方法即可。本发明对所述转化菌侵染日本落叶松的愈伤组织的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规方法即可。本发明对所述培养没有特殊限定，本领域技术人员采用常规日本落叶松愈伤组织培养成苗的方法即可。
49.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
50.以下实施例中如无特别说明均为常规方法。所使用的材料、试剂、酶、感受态细胞和质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
51.实施例1
52.1日本落叶松lkzfp36基因的获得如下：
53.1.1目的基因序列的获得
54.在目的基因序列两端设计引物如表1。
55.表1本发明用于目的基因克隆的引物序列
[0056][0057]
利用ctab法提取日本落叶松总rna，并且反转录成cdna。以此cdna为模板，使用kod酶体系按照200μl的总反应体系进行目的基因的克隆，反应条件为：95℃预变性2min；98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环数为32；最后68℃延伸2min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。pcr体系如表2。
[0058]
表2本发明用于目的基因克隆pcr反应体系
[0059]
成分用量10
×
kod buffer10μllkzfp36 cds-f(10μm)6μllkzfp36 cds-r(10μm)6μldntp(25μm)40μl2
×
pcr buffer for kod fx100μlkod酶4μlddh2o34μl
[0060]
1.2目的基因连接pclone ez-omni-kan载体测序
[0061]
对目的片段产物进行胶回收，将回收产物连接到pclone ez-omni-kan载体，热激法大肠杆菌转化后，将挑取合适的单菌落进行扩大培养pcr检测，提取阳性质粒后进行测序。经检测，核苷酸序列如seq id no.1所示，将该基因片段命名为lkzfp36，由987bp个碱基组成。其编码具有序列表中seq id no.2的氨基酸序列的蛋白质。
[0062]
1.3实验结果
[0063]
1.3.1lkzfp36基因的克隆
[0064]
采用落叶松的三代全长转录文件为基础数据库，设计引物，在日本落叶松中进行pcr，lkzfp36基因长度为987bp，初步说明pcr结果正确，进行下一步实验，将pcr的产物进行纯化，并连接到pclone ez-omni-kan载体上，将重组质粒转化大肠杆菌，涂布于加kan的筛选平板上。将阳性菌落随机挑出几个，用菌液pcr检验如有条带如图1。测序结果如图2。
[0065]
2.lkzfp36转基因日本落叶松的获得
[0066]
2.1过表达载体的构建
[0067]
根据lkzfp36的序列设计引物一对引物，lkzfp36过表达的引物，lkzfp36f：5
′‑
catgcccgggatgccgtccaagcgagaaagggac-3
′
(划线部位为增加的smaⅰ酶切位点)，lkzfp36r：5
′‑
catggtcgactcacggaatacatgtttggtcacc-3
′
(划线部位为增加的salⅰ酶切位点)。质粒为模板进行pcr。
[0068]
(1)pcr反应体系，如表3所示：
[0069]
表3本发明中用于载体构建的pcr反应体系
[0070]
成分用量cdna10μl
lkzfp36f(10μm)6μllkzfp36r(10μm)6μldntp(25μm)40μl2
×
pcr buffer for kod fx100μlkod酶4μlddh2o34μl
[0071]
(2)反应程序
[0072]
94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸2min。之后双酶切及连接到pcambia1300-35s-gfp载体转大肠杆菌。构建完成测序成功的菌液提取质粒一起用液氮法转化农杆菌gv3101用kan和rfp筛选，对菌液进行pcr检测提取质粒测序，将构建成功的菌液用于转基因备用。
[0073]
2.2农杆菌介导的日本落叶松转基因愈伤组织的获得
[0074]
(1)在基础bm培养基高压灭菌后，待培养基温度降至40℃至50℃之间，加入谷氨酰胺(450mg/l)和头孢霉素(0.2mg/ml)后倒入平板中。每周使用该培养基继代胚性愈伤组织一次，预先培养5天后挑取长势良好(无色透明呈毛刺状)的胚性愈伤组织备用。
[0075]
(2)从新划线的pcambia1300-lkzfp36-sgfp农杆菌平板上，挑取合适的单菌落接种至20ml含kan(50mg/l)lb液体培养基中，放入28℃摇床，180rpm，过夜震荡培养。直至菌液浓度达到od
600
＝0.6至0.8之间，中止培养，将菌液分装至2ml离心管内，5000rpm室温离心5min，倒掉上清液后，用不加抗生素的10*bm液体培养基重悬菌体至浓度为od
600
＝0.3，加入到已灭菌的小瓶中备用。
[0076]
(3)挑取2g准备好的预先培养的愈伤组织，迅速加入到40ml已稀释的农杆菌菌液中。轻轻摇晃小瓶，使愈伤组织充分接触到侵染液体，呈现出絮状分散状态，放到摇床上侵染30min后。将侵染完成的愈伤组织转移至已灭菌的滤纸上，使用布氏漏斗抽真空，抽出多余菌液。将愈伤组织放置于未加入头孢霉素的10*bm固体培养基上，在22℃暗室中共培养2天。
[0077]
(4)用含有头孢霉素(0.2mg/ml)的10*bm液体培养基清洗6-8次，每次清洗时间为1min，轻轻摇晃小瓶避免造成愈伤损伤。在洗菌结束后，使用布氏漏斗抽出多余液体，至愈伤组织表面水分抽干。将愈伤组织转移到含有头孢霉素(0.2mg/ml)和特美汀(0.2mg/ml)的10*bm培养基中，在22℃暗室中培养4-6天。
[0078]
(5)将脱菌后的愈伤组织转移至到含有头孢霉素(0.2mg/ml)、特美汀(0.2mg/ml)和潮霉素(4mg/l)的10*bm培养基中，在22℃暗室中筛选培养20天，在筛选10天时需更换一次培养基。将仍然存活的愈伤放至于含有头孢霉素和特美汀的10*bm培养基中过渡培养10天后，再挑选生长状态良好的愈伤组织放至含有头孢霉素的bm固体培养基中继代增殖培养，以备后续实验使用。
[0079]
2.3转lkzfp36基因胚性愈伤组织的分子检测
[0080]
分别以野生型(wt)和过表达胚性愈伤组织为材料，ctab法提取日本落叶松基因组dna。以pcambia1300-35s-gfp为阳性对照，以wt的总dna为阴性对照，对筛选的过表达胚性愈伤组织进行pcr检测。
[0081]
2.4结果与分析
[0082]
2.4.1lkzfp36基因的载体构建
[0083]
将lkzfp36基因测序正确的菌落提取质粒。经过双酶切之后，pcr产物连接到pcambia1300-35s-gfp载体上面，转入大肠杆菌中进行pcr检测。送去测序，序列正确后提取质粒转入农杆菌gv3101中，挑单克隆进行pcr检测，将有条带的菌液提取质粒(如图3)送测序，将序列正确的菌液储存-80℃用于后续转基因。
[0084]
2.4.2lkzfp36基因转基因胚性愈伤组织的获得
[0085]
使用已活化的pcambia1300-35s-sgfp农杆菌侵染生长状态良好的日本落叶松胚性愈伤组织。在共培养后进行洗菌，此后再进行转基因胚性愈伤组织的筛选。完成筛选后，第二周在恢复为正常的bm培养基进行继代。同时实验中会出现损失部分愈伤组织的情况，这需要每次在更换培养基时挑选长势良好的愈伤组织进行培养，最终才能得到具抗性愈伤组织。获得lkzfp36转基因愈伤组织的过程如图4。
[0086]
2.4.3lkzfp36转基因日本落叶松的的分子检测
[0087]
在lkzfp36过表达转基因胚性愈伤组织中挑选植株提取dna和rna，分别在基因组水平和转录水平上对转基因进行检测。dna水平上pcr，片段长度是lkzfp36基因加上gfp基因的长度是在1735bp见图5。
[0088]
提取移栽的lkzfp36过表达转基因胚性愈伤组织的rna反转录成cdna，进行lkzfp36基因的表达量分析，结果见图6。由图可知，与野生型相比lkzfp36过表达转基因愈伤组织的表达量均有所提高。
[0089]
3.转基因日本落叶松在干旱胁迫下的生理分析
[0090]
将长势强壮一致的lkzfp36转基因愈伤line1、line4、line8和野生型愈伤组织各三盘分别放置于含有7％peg6000的bm培养基中，在暗室中培养7天后，观察各转基因愈伤与野生型愈伤的生长情况，进行3次生物学重复，观察表型及生理指标。
[0091]
3.1相对含水量的测定
[0092]
分别称量未经处理和经过7％peg6000胁迫的野生型和转基因胚性愈伤组织，记录数值为鲜重w1，每个株系生物学重复3次。将愈伤放入平板中，在烘箱内烘干后再称量，记录数值为干重w2。最终计算，相对含水量s＝(w1-w2)/w1
×
100％。
[0093]
3.2可溶性糖含量测定
[0094]
将未处理和经过7％peg6000胁迫的野生型和转基因株系的胚性愈伤组织分别进行研磨，称取0.1g样品放入干净的1.5ml离心管中，每个株系生物学重复3次；向装有样品的离心管中加入1ml去离子水，盖上盖子，震荡均匀，95℃水浴10min；待冷却至室温后，4000rpm室温离心10min；取上清液，按照体积比1：9的比例，用去离子水稀释上清液，摇匀后作为样本上清液备用；在空白管中加入200μl去离子水、100μl底物液、1ml浓硫酸，标准管中加入200μl 100μg/ml标准品应用液、100μl底物液、1ml浓硫酸，在样品管中加入200μl样本上清液、100μl底物液、1ml浓硫酸。盖好盖子，震荡混匀，95℃水浴10min；取出后立即用流水冷却，吸取离心管内液体加至96孔测量板内，测量在波长620nm的od值；最终计算，可溶性糖含量＝标准曲线计算所得糖含量
×
加入样本体积
×
稀释倍数/样本鲜重。
[0095]
3.3脯氨酸含量测定
[0096]
将未处理和经过7％peg6000胁迫的野生型和转基因株系的胚性愈伤组织分别进行研磨，称取0.1g样品放入干净的1.5ml离心管中，每个株系生物学重复3次；向装有样品的
离心管中加入1ml去离子水，盖上盖子，震荡均匀后，3500rpm室温离心10min，取上清液备用；在空白管中加入0.5ml试剂一、1ml试剂二、1ml试剂三，标准管中加入0.5ml 5μg/ml标准品应用液、1ml试剂二、1ml试剂三，在样品管中加入0.5ml样本上清液、1ml试剂二、1ml试剂三。盖好盖子，震荡混匀，95℃水浴30min；取出后立即用流水冷却，吸取离心管内液体加至96孔测量板内，测量在波长520nm的od值，记录数值分别为a空白、a标准、a测定；最终计算，脯氨酸含量＝(a测定-a空白)/(a标准-a空白)
×
c标准
×
稀释倍数
×
提取液总体积/样本鲜重。
[0097]
3.4可溶性蛋白含量测定
[0098]
将未处理和经过7％peg6000胁迫的野生型和转基因株系的胚性愈伤组织分别进行研磨，称取0.1g样品放入干净的1.5ml离心管中，每个株系生物学重复3次；向装有样品的离心管中加入1ml去离子水，盖上盖子，震荡均匀，3500rpm室温离心10min，取上清液备用；在空白管中加入200μl pbs、2ml bca工作液，标准管中加入200μl 500μg/ml标准品应用液、2ml bca工作液，在样品管中加入200μl样本上清液、2ml bca工作液。盖好盖子，震荡混匀，37℃水浴30min；取出后立即用流水冷却，吸取离心管内液体加至96孔测量板内，测量在波长562nm的od值；计算公式：可溶性蛋白含量(μg/g湿重)＝标准曲线计算所得蛋白含量
×
加入样本体积(ml)
×
稀释倍数/样本鲜重(g)。
[0099]
3.5超氧化物歧化酶(sod)活性测定
[0100]
将未处理和经过7％peg6000胁迫的野生型和转基因株系的胚性愈伤组织分别进行研磨，称取0.1g样品放入干净的1.5ml离心管中，每个株系生物学重复3次；向装有样品的离心管中加入1ml磷酸缓冲液(0.1mol/l)，盖上盖子，震荡均匀后，3500rpm室温离心10min，取上清液备用；在对照管中加入20μl去离子水、20μl酶工作液、200μl底物工作液，在对照空白管中加入20μl去离子水、20μl酶稀释液、200μl底物工作液，在测定管中加入20μl样本上清液、20μl酶工作液、200μl底物工作液，在测定空白管中加入20μl样本上清液、20μl酶稀释液、200μl底物工作液。盖好盖子，混匀，37℃水浴20min；取出后，吸取离心管内液体加至96孔测量板内，测量在波长450nm的od值，记录数值分别为a对照、a对照空白、a测定、a测定空白；计算公式：sod抑制率(％)＝[(a对照-a对照空白)-(a测定-a测定空白)]/(a对照-a对照空白)
×
100％，sod活力(u/mgprot)＝sod抑制率/50％
×
反应体系(0.24ml)/稀释倍数(0.02ml)/样本蛋白浓度(mgprot/ml)。
[0101]
3.6过氧化物酶(pod)含量测定
[0102]
将未处理和经过7％peg6000胁迫的野生型和转基因株系的胚性愈伤组织分别进行研磨，称取0.1g样品放入干净的1.5ml离心管中，每个株系生物学重复3次；向装有样品的离心管中加入1ml磷酸缓冲液(0.1mol/l)，盖上盖子，震荡均匀后，3500rpm室温离心10min，取上清液备用；在测定管中加入2.4ml试剂一、0.3ml试剂二应用液、0.2ml试剂三应用液，对照管中2.4ml试剂一、0.3ml试剂二应用液、0.2ml双蒸水。分别向测定管和对照管中加入0.1ml样本上清液。盖好盖子，混匀，37℃水浴30min；取出后分别向测定管和对照管中加入1ml试剂四，混匀后，3500rpm室温离心10min，取上清液加至96孔测量板内，测量在波长420nm的od值，记录数值分别为a测定、a对照；计算公式：pod活力(u/mgprot)＝(a测定-a对照)/(12
×
比色光径)
×
反应体系总体积(4ml)/取样量(0.1ml)
÷
反应时间
÷
样本蛋白浓度(mgprot/ml)
×
1000。
[0103]
3.7结果与分析
[0104]
3.7.1peg6000胁迫下转基因愈伤的生长情况
[0105]
未经处理的野生型和转基因愈伤组织的生长状况无明显差异；经过7％peg6000处理后，转基因愈伤组织相较于野生型生长状态明显较好(图7)，初步表明在干旱胁迫下，过表达lkzfp36转基因愈伤组织受到的损伤相对较轻，其具有较优的抗旱性。
[0106]
3.7.2peg6000胁迫下转基因愈伤的生理指标测定
[0107]
植物在干旱胁迫时，植物体内的相对含水量会出现变化，相对含水量越高则表明植物受到的损伤越小，抗逆性更强。可溶性糖和脯氨酸是植物参与非生物胁迫反应中的重要渗透调节物质。其中可溶性糖既是植物中的信号分子，也是代谢物。分别测量未处理和经过7％peg6000处理的野生型和转基因愈伤组织的相对含水量(图8)、可溶性糖含量(图9)和脯氨酸含量(图10)。如图所示，未经处理的野生型和转基因愈伤组织的相对含水量、可溶性糖含量和脯氨酸含量均无明显差异，经过7％peg6000处理后，野生型相较于转基因愈伤组织的相对含水量明显出现大幅下降，而转基因愈伤组织相较于野生型的可溶性糖和脯氨酸含量出现了大幅上升。可以推断，干旱胁迫下过表达lkzfp36转基因愈伤组织积累了更多的可溶性糖和脯氨酸，维持了胞内外环境间的渗透平衡，进而减轻了细胞膜的损伤，提高了转基因愈伤组织的抗旱性。
[0108]
植物在生长过程中具有一套清除活性氧的防御系统，本实验中测定了超氧化物歧化酶(sod)和过氧化物酶(pod)的活性，进一步研究其抗旱机制。可溶性蛋白属于代谢酶类，能够影响植物细胞渗透势，测定结果如图11所示，说明了转基因愈伤组织的抗脱水能力较强，细胞结构更稳固。如图12和图13所示，未经处理的野生型和转基因愈伤组织sod和pod活性的差异不明显，7％peg6000处理后野生型和转基因愈伤组织的sod和pod活性均有所增加，但转基因愈伤组织的增加幅度明显更大。由此推断，过量表达lkzfp36能通过促进活性氧的清除以减少植株损伤，进而增强了转基因愈伤组织的抗旱性。
[0109]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种日本落叶松lkzfp36基因，其特征在于，所述日本日本落叶松lkzfp36基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。3.过表达权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高日本落叶松抗旱能力中的应用。4.过表达权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松含水量中的应用。5.过表达权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松可溶性糖含量中的应用。6.过表达权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因在提高干旱胁迫下日本落叶松脯氨酸含量中的应用。7.过表达权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因在促进清除干旱胁迫下日本落叶松超氧化物歧化酶中的应用。8.过表达权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因在促进清除干旱胁迫下日本落叶松过氧化物酶中的应用。9.一种过表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的日本落叶松lkzfp36基因插入到pcambia1300-35s-gfp载体中，得到。10.一种获取抗干旱日本落叶松的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求9所述的过表达载体转化到农杆菌中，得到转化菌；将得到的转化菌侵染日本落叶松的胚性愈伤组织，培养得到抗干旱日本落叶松。

技术总结
本发明提供了一种日本落叶松LkZFP36基因及其编码的蛋白质、应用、过表达载体和获取方法，属于基因工程技术领域。所述日本落叶松LkZFP36基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明发现在干旱胁迫下转基因落叶松愈伤组织受损程度明显低于WT并且生理指标的结果也验证了LkZFP36基因的过表达愈伤组织抗逆能力明显高于WT。发现LkZFP36特异性的提高日本落叶松在干旱胁迫下的抗性，可培育出抗干旱的转LkZFP36基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要意义。种培育方面具有重要意义。种培育方面具有重要意义。


技术研发人员：杨静莉 崔昕昱 邵莉颖 李成浩
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/9