一种天然抗菌剂及其用途的制作方法

1.本发明涉及抗菌技术领域，尤其涉及一种天然抗菌剂及其用途。


背景技术：

2.病原细菌和病原真菌是危害人类、动物、植物及环境的有害微生物。为了解决病原菌感染问题，针对不同微生物已研发了多种抗菌剂，如各种抗生素、生物农药、酒精类消毒剂、含氯消毒剂等，为杀灭感染人体、动物、植物有害微生物及环境健康做出了重大贡献。然而，上述杀灭微生物的产品多数为化学制剂，天然抗菌剂比较少见，目前能够同时对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌都具有强抗性作用的天然抗菌剂尚未见报道。
3.中药是天然抗菌剂的宝库，许多中药都具有一定的抗菌作用，但其抗菌谱及抗菌活性差异很大，多数没有制备成抗菌剂的应用价值，需要筛选大量的不同中药，从而选出抗菌强，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌都具有强抗性作用的中药，同时研发出抗菌剂的制备工艺。
4.提取方法对中药抗菌效果有很大影响。目前多数中药的提取是采用煎煮的方式，该方法有可能使不耐热的抗菌成分分解，也可能使挥发性抗菌成分挥发。提高中药的抗菌活性提取方法是目前科学家探索的重点。
5.益生菌也是天然抗菌剂的来源，许多益生菌具有一定的抗菌作用，但其抗菌谱、抗菌活性差异很大，多数没有制备成抗菌剂的应用价值，需要筛选大量的不同类型的益生菌及同一类益生菌不同菌株，从而选出抗菌强，抗菌谱宽的益生菌菌株，同时研发出效果更优的抗菌剂。


技术实现要素：

6.本发明提供一种天然抗菌剂及其用途，得到了一种抗菌强、抗菌谱宽的复合菌剂。
7.本发明提供一种中药制剂的制备方法，包括利用消解回流技术消解中药粉末；所述消解的温度为120-140℃，消解的时间为20-40分钟；
8.所述中药为石榴皮、黄独中的一种或几种。本发明所述中药制剂为抑菌制剂，利用所述制备方法制备得到的抑菌制剂效果更优。利用本发明中药石榴皮作为原料提取制备抗菌制剂的方法，石榴皮抗菌制剂具有强抗革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌和假中间金黄色葡萄球菌的特性，该制备方法使石榴皮的抗大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的mic低至0.78mg/ml及0.39mg/ml(每毫升体积对应的生药重量)。
9.根据本发明所述中药制剂的制备方法，先将中药粉末浸泡在水中1.5-2.5小时再消解；所述浸泡时料液比为10g:85-95ml。
10.优选的，所述中药粉末为中药粉碎后过70-90目筛得到。
11.优选的，将消解得到的消解混合液离心后取上清液。
12.进一步优选的，在常温下离心，所述离心的转速为3500-4500rpm,离心的时间为10-20min。
13.优选的，中药石榴皮作为原料提取中药制剂的方法包括利用消解仪消解石榴皮，消解仪为130℃，消解30分钟，随后冷却至室温。消解过程中，消解仪的回流装置保证消解过程中挥发的成分又回流到消解瓶中。
14.优选的，所述制备方法中还包括活性炭(药物脱色专用)过滤步骤。
15.本发明提供一种抗菌剂，其由榴皮和/或黄独制备得到。
16.优选的，利用所述中药制剂的制备方法。
17.石榴皮和/或黄独在以下任一项或几项中的应用：
18.1)制备抗菌剂。
19.优选的，包括利用所述中药制剂的制备方法。
20.2)抗细菌和/或真菌。
21.优选的，细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
22.根据所述应用，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌中的一种或几种。
23.本发明还提供利用所述中药制剂的制备方法制备得到艾草制剂在抗金黄色葡萄球菌中的应用。
24.本发明提供了中药黄独作为原料提取抗菌制剂的方法。在此基础上，提供了黄独抗菌制剂具有强抗革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌和假中间金黄色葡萄球菌的特性。
25.本发明提供枯草芽孢杆菌ac-1、枯草芽孢杆菌ac-1发酵液、枯草芽孢杆菌ac-1代谢产物中的一种或几种在以下任一项或几项中的应用：
26.1)制备抗菌剂。
27.2)抗真菌。
28.优选的所述真菌为犬小孢子菌、红色毛癣菌、石膏样犬小孢子菌中的一种或几种。本发明ac-1抗真菌制剂具有强抗红色毛鲜菌，犬小孢子菌，石膏样犬小孢子菌等病原真菌的特性。
29.本发明所述枯草芽孢杆菌ac-1，分类命名为：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏编号：cgmcc no.26448，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，cgmcc。保藏日期：2023年1月12日；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
30.本发明提供一种复合抗菌剂，其原料包括枯草芽孢杆菌ac-1和石榴皮。
31.本发明提供所述复合抗菌剂的制备方法，利用所述方法制备石榴皮制剂，利用石榴皮制剂制备所述复合抗菌剂。
32.本发明还提供所述复合抗菌剂在以下任一项中的应用：
33.1)抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌中的一种或几种。
34.2)抗犬小孢子菌、红色毛癣菌、石膏样犬小孢子菌中的一种或几种。
35.3)减少宠物毛发上的菌。
36.4)制备饲料添加剂、猫砂、宠物护理用品中的一种或几种。
37.优选的，所述宠物护理用品为宠物清洁用品。
38.优选的，所述宠物为猫。
39.本发明在抗菌中药及抗菌益生菌筛选的基础上，将筛选出的目标中药及目标益生菌结合起来，形成新型抗菌活性更优的复合抗菌剂，能够拓宽抗菌谱及应用范围。
40.本发明筛选到具有强烈抗细菌(包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)的中药石榴皮及其抗菌活性产物制备方法，利用本发明的制备方法，制备得到的石榴皮中药制剂抗菌性更好。
41.本发明筛选到具有强烈抗病原真菌的益生菌枯草芽孢杆菌ac-1及其抗真菌活性产物制备方法。
42.本发明提供了将石榴皮与枯草芽孢杆菌ac-1相结合制备强抗真菌及细菌(包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)制剂的方法及其应用。
43.本发明利用中药和枯草芽孢杆菌提取物形成天然强活性抗菌剂(细菌和真菌)。该复合抗菌剂具有强抗革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌、病原真菌红色毛鲜菌、犬小孢子菌和石膏样犬小孢子菌的特性。
44.本发明提供中药石榴皮及枯草芽孢杆菌ac-1作为原料制备复合抗菌制剂。在此基础上，提供了复合抗菌剂具有强抗革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌和假中间葡萄球菌及病原真菌红色毛鲜菌，犬小孢子菌，石膏样犬小孢子菌的特性。
45.本发明提供了石榴皮抗菌剂与ac-1抗菌剂复配，不影响石榴皮抗菌剂对大肠杆菌抗细菌活性，但使复合抗菌剂对金黄色葡萄球菌及假中间葡萄球菌的抗菌活性增加的证据。
46.本发明复合抗菌剂用于宠物猫砂，实现长效抗菌，减少宠物饲养环境菌的数量，改善宠物饲养环境。
47.本发明复合抗菌剂用于宠物猫猫毛护理，减少宠物毛发上菌的数量，改善猫的健康及其饲养环境。
附图说明
48.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
49.图1是本发明石榴皮提取液对大肠杆菌(a)、金黄色葡萄球菌(b)及假中间葡萄球菌(c)抗性图，bar＝2cm。
50.图2是本发明黄独提取液对大肠杆菌(a)、金黄色葡萄球菌(b)及假中间葡萄球菌(c)抗性图。
51.图3是本发明艾草提取液对大肠杆菌(a)、金黄色葡萄球菌(b)及假中间葡萄球菌(c)抗性图。
52.图4是本发明金银花黄独提取液对大肠杆菌(a)、金黄色葡萄球菌(b)及假中间葡萄球菌(c)抗性图；bar＝2cm。
53.图5是本发明枯草芽孢杆菌ac-1抗菌制剂对石膏样犬小孢子菌(a)、红色毛鲜菌(b)及犬小孢子菌(c)的抗性图。
54.图6是本发明ac-1对金黄色葡萄球菌的抗性图，其中a为对照，b为ac-1对金黄色葡
萄球菌的抗性，bar＝2cm。
55.图7是本发明复合抗菌液对大肠杆菌(a)、金黄色葡萄球菌(b)及假中间葡萄球菌(c)抗性图，bar＝2cm。
56.图8是本发明ac-1菌剂对石膏样犬小孢子菌抗性图；
57.其中，a为ac-1菌剂对石膏样犬小孢子菌抗性(稀释10
×
)；b为对照；bar＝2cm。
58.图9是本发明复合抗菌液对犬小孢子菌的抗性图；
59.(a)对照，(b)原液(1
×
)，(c)稀释10
×
，(d)稀释100
×
；bar＝2cm。
具体实施方式
60.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
61.实施例1抗革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌中药的筛选
62.本实施例提供以多种中药为原料，制备抗细菌制剂的方法，具体包括如下步骤：
63.1.中药材料
64.石榴皮(购自北京同仁堂药店)
65.黄独(购自北京同仁堂药店)
66.艾草(购自北京同仁堂药店)
67.紫苏(购自北京同仁堂药店)
68.白头翁(购自北京同仁堂药店)
69.防风(购自北京同仁堂药店)
70.金银花(购自北京同仁堂药店)
71.蒲公英(购自北京同仁堂药店)
72.2.中药消解
73.(1)中药粉碎：取上述适量的中药，放入粉碎机(多功能粉碎机，型号：bj-200，德清拜杰电器有限公司)，固定盖子，定时1至3分钟进行粉碎。
74.(2)过筛：将粉碎的中药用80目筛子进行分筛。将筛出的粉末放入自封袋，置于4℃保存备用。
75.(3)消解：称取10g中药粉末，量取90ml灭菌去离子水，放入消解锥形瓶中混匀；常温侵泡2小时后消解，设置消解仪(标准cod消解器，cod-100w，青岛景弘环保科技有限公司，青岛)为130℃，消解30分钟，随后冷却至室温。
76.(4)离心：将消解好冷却至室温的消解混合液分装到50ml的离心管中，4000rpm，常温离心10-20min，弃去药渣，取上清液至新的离心管中，存于4℃备用。
77.3.中药脱色
78.(1)实验用品
79.活性炭：a805346-1kg(药物脱色，200目，1kg装，上海麦克林生化科技有限公司)；
80.定性滤纸(新星牌，直径11cm，生产厂家)。
81.玻璃漏斗：口外径10cm，脚外径1cm，脚长10cm，硼硅酸玻璃。
82.(2)脱色步骤
83.①
将1张滤纸进行3+1层折叠，为防止破损，再叠加两张滤纸；
84.②
沿漏斗边缘，用无菌水将滤纸润湿，使其紧贴漏斗内壁，排空气泡，再次用无菌水润湿滤纸，静置使无菌水自然流出。
85.③
漏斗中加入适量活性炭(药物脱色专用)，以不超过折叠的滤纸边缘2cm左右为标准，超过滤纸边缘，容易使活性炭越过滤纸进入到过滤液体中(本漏斗共加入活性炭8-10克，可用于过滤约100ml中药液体)。
86.④
取50ml消解中药分批次，缓缓加入到活性炭中，用250ml三角瓶收集滤液。(注：一定要悬空过滤，不然滤速受到空气压强的影响会极慢。)
87.⑤
中药消解液(深褐色)过滤后得到浅褐色消解液，此为不同中药抗菌剂原液，10g生药的中药抗菌剂原液定溶总体积100ml,浓度为100mg/ml(每毫升100毫克生药)，密封，4℃保存待用。
88.实施例2以不同中药为原料制备的抗细菌制剂的抗菌活性检测
89.1.菌种
90.具有代表性的革兰氏阴性菌大肠杆菌atcc25922(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌atcc25923(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)，假中间葡萄球菌atcc49051(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)。以上菌株均为市售菌株。
91.2.抑菌梯度设计
92.实施例1获得的不同中药抗菌剂原液设为1
×
，在此基础上稀释2倍、5倍、10倍设为稀释2
×
，5
×
，10
×
，每组实验设置三个重复。
93.3.实验步骤
94.1)将3种指示菌，挑单菌落，用lb液体培养基(50ml液体/125ml三角瓶)，37℃，200rpm，培养过夜(培养12小时)。3种指示菌菌数约为108cfu/ml。
95.2)按照菌液与lb培养基1：5000的比例取3种指示菌液体，分别加入到融化的lb固体培养基中(50-60℃)，充分混匀，铺板，吹干，此为指示菌培养基。
96.注：lb固体培养基和指示菌混匀时温度不宜过高，过高会导致菌死亡。
97.3)指示菌培养基用无菌打孔器打孔，每孔置入中药抗菌剂原液(1
×
)，2
×
稀释液，5
×
，10
×
稀释液各200μl。
98.4)37℃培养箱，过夜培养，次日早(培养12小时)统计抑菌圈直径，拍照。
99.4.实验结果
100.石榴皮、黄独、艾草、金银花中药抗菌液抗菌效果见图1-图4从图1中可以看出，石榴皮抗菌液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌在稀释10
×
时仍然具有较强的抗性。
101.从图2中可以看出，黄独抗菌液对大肠杆菌、假中间葡萄球菌在稀释2
×
时仍然具有较强的抗性，但稀释5
×
其抗菌活性就丧失了，对金黄色葡萄球菌在稀释5
×
时仍然有一定抗性。
102.从图3中可以看出，艾草抗菌液对大肠杆菌几乎没有明显抗性，对金黄色葡萄球菌在稀释5
×
时仍然有一定抗性，对假中间葡萄球菌1
×
时只有较弱抗性。
103.从图4中可以看出，各浓度金银花抗菌液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及假中间葡萄球菌都没有明显抗性。
104.其他几种检测的中药，包括紫苏、白头翁、防风、金银花、蒲公英抗菌液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌在各个浓度下几乎都没有抗性或抗性较弱(图片没有给出)。
105.实施例3消解法获得的石榴皮抗菌制剂的最低抑菌浓度显著降低
106.1消解法获得的石榴皮抗菌制剂
107.按实施例1的方法，获得石榴皮抗菌制剂，获得的制剂浓度为100mg/ml。
108.2石榴皮抗菌制剂的最低抑菌浓度测定
109.所用细菌为具有代表性的革兰氏阴性菌大肠杆菌标准菌株atcc25922(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)，革兰氏阳性菌标准菌株金黄色葡萄球菌atcc25923(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)
110.试验取96孔板，首先每两排1～16孔中加入100μl lb肉汤培养基，在每两排1～14孔采用2倍梯度稀释法加入提取药液(药物起始浓度100mg/ml,第一孔加入100μl，取上一个孔的1/2液体到下一个孔))，每排第14孔多余100μl弃掉，随后每两排1～15孔加入100μl稀释好的1.0
×
106cfu/ml大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌液。第15孔不加药物为阳性对照组，第16孔不加菌液再补充100μl lb肉汤为阴性对照组。轻轻混匀后37℃恒温箱培养24h，待检测。在超净工作台内，往96孔板有液体的每孔分别加入5μl ttc(5％)和琥珀酸钠(2％)溶液，轻轻混匀后37℃恒温箱继续培养1h和2h后观察试验结果。依据阴性对照孔和阳性对照孔的试验结果作为参照对象判断第1～14孔试验结果，如果第1～14孔内与阳性对照组相同结果为孔内粉红色，说明有细菌生长；若第1～14孔内与阴性对照组相同结果为孔内澄清，说明无细菌生长；药物浓度最低梯度且无细菌生长者即为该味蒙药的mic。mic以每毫升生药(毫克)计。
111.3结果
112.按照上述方法，利用消解回流的方法获得的石榴皮抗菌剂对大肠杆菌抗性的mic为0.78mg/ml,对金黄色葡萄球菌的mic为0.39mg/ml，对假中间葡萄球菌的mic为0.39mg/ml。
113.在另外的独立实验中，利用文献报道的水煎法提取石榴皮抗菌剂对大肠杆菌的mic为31.25mg/ml,与前人报道的一致(刘琳等，中国畜牧兽医，2023,50(1):328-340)。水煎法提取石榴皮抗菌剂对金黄色葡萄球菌的mic为3.92mg/ml。
114.使用的水煎法制备石榴皮中药水提物方法如下，称取中药30g，置于300ml(45
±
5)℃温水中浸泡1h，随后武火加热至沸腾，改为文火煎煮1h，4层纱布过滤收集滤液(1)；向药渣中再加入300ml温水浸泡1h，重复煎煮操作一次，收集滤液(2)。合并滤液(1)和(2)，5000rpm离心5min，过滤上清液，再对过滤液文火浓缩至30ml，并加入0.3％苯甲酸钠作为防腐剂，此时各药液浓度相当于1g/ml生药，将药液于4℃保存备用。(刘琳等，中国畜牧兽医，2023,50(1)：328-340)。
115.实施例4枯草芽孢杆菌ac-1抗真菌制剂的制备
116.取枯草芽孢杆菌ac-1(保藏编号：cgmcc no.26448，保藏单位：中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc)。
117.甘油管保存的枯草芽孢杆菌ac-1在lb固体培养基划板，37℃培养过夜，次日挑取单菌落于装有100ml lb液体培养基的三角瓶(250ml规格)中，37℃，200rpm培养12h，按2％的接种量接种于装有100ml endo-kno3培养基的三角瓶(250ml规格)中，35℃，200rpm培养48h，取发酵液10,000-11,000rpm离心10min取上清，将上清液在超净台用0.22μm的无菌过滤器过滤1-2遍。所得液体为ac-1抗真菌制剂(浓度记作1ml/ml,每毫升体积含有无菌菌液1ml)，利用真空浓缩方法，浓缩5倍(浓度为5ml/ml，表示每毫升体积含有无菌菌液5ml)，4℃低温保存浓缩液，需要时可以按比例稀释。
118.实施例5枯草芽孢杆菌ac-1抗真菌制剂对真菌及细菌的抗性1.所用病原真菌及细菌
119.1)犬小孢子菌atcc36299(来自中国科学院微生物研究所)。
120.2)红色毛癣菌atcc10218(来自中国科学院微生物研究所)。
121.3)石膏样犬小孢子菌atcc14683(来自中国科学院微生物研究所)。
122.4)大肠杆菌atcc25922(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)。5)金黄色葡萄球菌atcc25923(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)。
123.6)假中间葡萄球菌atcc49051(中国科学院遗传与发育生物学研究所保存)。
124.2.所用ac-1抗真菌制剂：利用实施例3获得的抗真菌制剂(浓度1ml无菌菌液/ml)。
125.3枯草芽孢杆菌ac-1抗真菌制剂对真菌及细菌的抗性检测
126.对真菌的抗性检测：平板对峙法：在pda固体培养基平皿底部标上中心点，然后接种直径为0.6cm的受试病原菌菌饼，在中心点垂直的两个方向3cm处分别用打孔器打出2个孔洞，在孔洞中加入100μl(浓度为1ml/ml)的ac-1抗真菌制剂，以不打空洞不加任何试剂的样品作为对照。
127.对细菌的抗性检测：见实施例2
128.4.检测结果
129.对病原真菌的检测：检测结果见图5。从图5可以看出，枯草芽孢杆菌ac-1抗真菌制剂对犬小孢子菌、红色毛癣菌、石膏样犬小孢子菌都具有较强的抗性。
130.对细菌的抗性检测：
131.ac-1抗菌制剂对大肠杆菌没有抗性，对金黄色葡萄球菌及假中间葡萄球菌有较弱抗性。
132.具有代表性的对金黄色葡萄球菌的结果见图6。其他结果图未给出。在两外独立的实验中，ac-1抗真菌菌剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及假中间葡萄球菌没有抗性。
133.实施例6复合抗细菌及抗真菌制剂的制备
134.根据实施例1的方法，称取10g石榴皮，粉碎后，加入100ml去离子水，浸泡2小时后，用消解仪(板面温度调至130℃)消解30分钟，冷凉至室温，分装到50ml的离心管中，4000rpm，常温离心10-20min，弃去药渣，取上清液至新的离心管中，经活性炭(a805346-1kg，200目，1kg装，上海麦克林生化科技有限公司)和定性滤纸(新星牌，直径11cm，生产厂家)过滤，定容至100ml,此为石榴皮抗菌剂原液，密封，4℃保存待用，记作石榴皮抗菌原液。
135.将实施例3获得的枯草芽孢杆菌ac-1抗菌原液(浓缩5倍原液,5ml/ml)记作ac-1抗菌高浓缩原液。
136.取上述石榴皮抗菌原液10ml，加ac-1抗菌高浓缩原液10ml,加去离子水30ml,定容
至50ml(可按该比例放大)，获得复合抗菌原液(复合抗细菌、抗真菌及抗真菌制剂),该复合液含有石榴皮菌剂浓度为20mg/ml，含ac-1抗真菌菌剂1ml/ml。
137.实施例7复合抗菌制剂抗菌的测定
138.将上述复合抗菌原液(1
×
)、稀释2倍(2
×
)、稀释10倍(10
×
)，利用打孔法(见实施例2及实施例4)，检测对细菌大肠杆菌、假中间葡萄球菌、金黄色葡萄球菌抗菌活性，利用平板对峙法检测对红色毛鲜菌、犬小孢子菌、石膏样犬小孢子菌的抗性。
139.检测结果见图7-9。
140.从图7可以看出，配制的复合抗菌液原液(1
×
)、稀释2倍(2
×
)时，抗菌活性较强，稀释10倍(10
×
)仍有较弱的抗菌活性。
141.在另外独立的实验中，测定了上述复合抗菌液原液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及假中间葡萄球菌的mic，复合抗菌剂对大肠杆菌抗性的mic为0.78mg/ml(每毫升生药石榴皮的质量),对金黄色葡萄球菌的mic为0.195mg/ml(每毫升生药石榴皮的质量)，对假中间葡萄球菌的mic为0.195mg/ml(每毫升生药石榴皮的质量)。
142.说明石榴皮抗菌剂与ac-1抗菌剂复配，不影响石榴皮抗菌剂对大肠杆菌抗细菌活性，但能够使石榴皮抗菌剂对金黄色葡萄球菌及假中间葡萄球菌的抗菌活性增加。
143.图9结果表明，复合抗菌液对犬小孢子菌具有较强抗性，稀释10
×
(10倍)仍然具有较强抗性，稀释100
×
(100倍)仍具有一定活性(对峙效果不明显，但菌落直径变小)。
144.同时，我们在另外独立的实验中，将复合抗菌液原液及10
×
稀释液，用上述方法检测了其对红色毛鲜菌及石膏样犬小孢子菌的抗性，结果表明复合抗菌液原液及10
×
稀释液对红色毛鲜菌(图片未给出)及石膏样犬小孢子菌也具有较强抗性(图9)。
145.实施例8复合抗菌剂用于宠物猫砂长效抗菌的检测
146.将实施例5制备的复合抗菌剂与猫砂按1：25(40ml复合抗菌剂，1公斤猫砂，猫砂购自河北德牧宠物食品有限公司)的比例混匀作为新猫砂用于10只猫(北京希诺因生物科技有限公司，英短，1岁，公猫)的猫砂，每只猫1公斤。对照组10只猫(北京希诺因生物科技有限公司，英短，1岁，公猫)，不加复合抗菌剂，每只猫1公斤猫砂。72小时后取猫砂(表面2-5毫米猫砂)，每个猫取3份，每份约1-2克。利用lb平板法(参考gb/t 26428-2010的实验方法)，测定猫砂细菌含量，结果见表1。
147.表1复合抗菌剂对猫砂含菌量的影响
148.组别猫砂含菌量(平均值
±
sd/g)说明实验组3.03
×
105±
1.05
×
104***p＜0.01对照组7.3
×
106±
3.26
×
104149.从表1结果可以看出，复合抗菌液对正在使用的猫砂具有显著长效抗菌作用(72小时)。
150.实施例9复合抗菌剂用于宠物猫猫毛护理
151.1)动物仍然为喂养实验10只猫(北京希诺因生物科技有限公司，英短，1岁，公猫)，每个单独饲养。
152.2)洗护部位：两侧肩部。
153.3)实验之前需要用猫用香波清洗干净猫肩部区域。每只猫进行实验前，实验区域和对照区域处理成相近似的清洁状态，晾干。
154.4)左肩(无菌水涂布，用作对照组)；右肩(实验样品涂布，作为实验处理组)；涂布至同样大小区域内(边长为4厘米的方形区域)，使猫毛饱和湿润，涂布之后不需要清水再洗去。复合抗菌液用量约为6ml(请核实)
155.5)72h后取两侧肩部猫毛，同样大小区域内的猫毛，毛常温存放。
156.6)取剪下的猫毛500mg(请核实)，加无菌水50ml,室温(25℃)，200rpm摇2小时，用lb培养基测定溶液中细菌的含量。
157.7)测定结果见表2。
158.表2复合抗菌剂对宠物猫毛发含菌量的影响
159.组别猫毛含菌量(平均值
±
sd/g)说明对照组8.6
×
105cfu/g
±
1.15
×
103实验组1.02
×
104±
2.32
×
103***p＜0.01
160.从表2结果可以看出，复合抗菌液对猫毛具有显著的长效抗菌作用(72小时)。
161.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种中药制剂的制备方法，其特征在于，包括利用消解回流技术消解中药粉末；所述消解的温度为120-140℃，消解的时间为20-40分钟；所述中药为石榴皮、黄独中的一种或几种。2.根据权利要求1所述中药制剂的制备方法，其特征在于，先将中药粉末浸泡在水中1.5-2.5小时再消解；所述浸泡时料液比为10g:85-95ml；优选的，所述中药粉末为中药粉碎后过70-90目筛得到；优选的，将消解得到的消解混合液离心后取上清液；进一步优选的，所述离心的转速为3500-4500rpm,离心的时间为10-20min。3.一种抗菌剂，其特征在于，其由榴皮和/或黄独制备得到；优选的，利用权利要求1或2所述中药制剂的制备方法。4.石榴皮和/或黄独在以下任一项或几项中的应用：1)制备抗菌剂；优选的，包括利用权利要求1或2所述中药制剂的制备方法；2)抗细菌和/或真菌；优选的，细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌中的一种或几种。6.利用权利要求1或2所述中药制剂的制备方法制备得到艾草制剂在抗金黄色葡萄球菌中的应用。7.枯草芽孢杆菌ac-1、枯草芽孢杆菌ac-1发酵液、枯草芽孢杆菌ac-1代谢产物中的一种或几种在以下任一项或几项中的应用：1)制备抗菌剂；2)抗真菌；所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ac-1的保藏编号为cgmccno.26448；优选的所述真菌为犬小孢子菌、红色毛癣菌、石膏样犬小孢子菌中的一种或几种。8.一种复合抗菌剂，其特征在于，其原料包括枯草芽孢杆菌ac-1和石榴皮；所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ac-1的保藏编号为cgmccno.26448。9.权利要求8所述复合抗菌剂的制备方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述方法制备石榴皮制剂，利用石榴皮制剂制备所述复合抗菌剂。10.权利要求8所述复合抗菌剂在以下任一项中的应用：1)抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌中的一种或几种；2)抗犬小孢子菌、红色毛癣菌、石膏样犬小孢子菌中的一种或几种；3)减少宠物毛发上的菌；4)制备饲料添加剂、猫砂、宠物护理用品中的一种或几种；优选的，所述宠物护理用品为宠物清洁用品。

技术总结
本发明涉及抗菌技术领域，尤其涉及一种天然抗菌剂及其用途。本发明提供了中药石榴皮及枯草芽孢杆菌AC-1作为原料制备复合抗菌制剂的方法。该复合抗菌剂具有强抗革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌、假中间葡萄球菌、病原真菌红色毛鲜菌、犬小孢子菌和石膏样犬小孢子菌的特性。石膏样犬小孢子菌的特性。石膏样犬小孢子菌的特性。


技术研发人员：胡赞民 陈宇红 李倩如 贾青云 丁锦浩 范成明
受保护的技术使用者：中科爱宠生物科技（北京）有限公司
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/9