一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的表达载体

1.本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种促进分泌表达的载体构建及其重组蛋白的表达方法。


背景技术：

2.大肠杆菌的遗传背景研究比较透彻，加之其容易培养，生长速度快，表达载体丰富、大规模培养工艺成熟、表达量高等特点，是应用最广泛的基因工程合成异源蛋白的原核表达系统。重组目的蛋白质高水平表达是工业化生产应用最重要的先决条件之一。
3.作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌，被内膜(又称质膜)和外膜隔开形成三个腔(compartment)：细胞质、周质和胞外，相应地，在大肠杆菌中表达的外源重组蛋白可定位于细胞质、周质空间或胞外培养基中。其中sec途径是大肠杆菌大多数蛋白质分泌至关重要的途径，涉及sec分泌系统的相关蛋白,由在细菌中相当保守的一些蛋白质组成。
4.近年发现的yebf蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽，大小为10.8kda，虽然其功能未知，但是yebf可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。
5.无论在生物体内还是体外进行蛋白质的折叠，二硫键的氧化形成在其折叠形成天然构象过程中发挥的重要作用。大肠杆菌的周质形成一个氧化的环境，其中一类折叠酶(foldases)—dsb家族蛋白质在蛋白质形成正确的二硫键的过程中发挥关键作用，从而使得大肠杆菌能保证新生多肽链在周质中能够及时并正确地折叠，避免由于蛋白质的错误折叠形成不正确的空间构象被蛋白酶降解，在重组蛋白的过量分泌表达过程中，利用sec途径中的相关转运蛋白或dsb家族与二硫键形成有关的辅助蛋白，加速重组蛋白跨细胞质膜分泌并及时形成正确的二硫键，最终提高重组蛋白的分泌表达水平在理论上成为可能。
6.目前在大肠杆菌中实现重组蛋白跨细胞质膜及外膜的细胞外分泌表达的成功案例较少，且已报道的细胞外分泌表达的水平都较低，离产业化的要求还有较大的距离。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题为：。
8.本发明的技术方案为：一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的表达载体，至少包含：
9.(1)目标蛋白编码序列和yebf蛋白编码序列，目标蛋白编码序列与yebf蛋白编码序列通过tev酶切识别位点编码序列连接；
10.(2)dsba和dsbc蛋白编码基因；
11.进一步地，还包含secm编码基因。
12.进一步地，所述表达载体不含laci基因。
13.进一步地，所述yebf蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，tev酶切识别位点的氨基酸序列为enlyfq，dsba蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示，dsbc蛋白氨基酸序列如
seq id no.3所示。
14.进一步地，所述dsba和dsbc蛋白编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
15.进一步地，所述secm的氨基酸序列如seq id no.4所示。
16.一种含有上述所述的表达载体的大肠杆菌。
17.一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的方法，将目标蛋白与yebf蛋白在大肠杆菌中融合表达，同时共表达dsba蛋白、dsbc蛋白。
18.进一步地，还同时共表达secm蛋白。
19.进一步地，目标蛋白与yebf融合蛋白、dsba蛋白、dsbc蛋白及secm蛋白通过同一表达质粒表达，所述表达质粒空载体为pet28b，且去除了laci基因。
20.secm蛋白的氨基酸序列：
21.vsgiltrwrqfgkryfwphlllgmvaaslglpalsnaaepnapakattrnhepsakvn fgqlalleantrrpnsnysvdywhqhairtvirhlsfamapqtlpvaeeslplqaqhlall dtlsalltqegtpsekgyridyahftpqakfstpvwisqaqgiragpqrlt(seq id no.4)
22.dsba蛋白的氨基酸序列：
23.mkkiwlalaglvlafsasaaqyedgkqyttlekpvagapqvleffsffcphcyqfeevlhisdnvkkklpegvkmtkyhvnfmggdlgkdltqawavamalgvedkvtvplfegvqktqtirsasdirdvfinagikgeeydaawnsfvvkslvaqqekaaadvqlrgvpamfvngkyqlnpqgmdtsnmdvfvqqyadtvkylsekk(seq id no.2)
24.dsbb蛋白的氨基酸序列：
25.mlrflnqcsqgrgawllmaftalaleltalwfqhvmllkpcvlciyercalfgvlgaaligaiapktplryvamviwlysafrgvqltyehtmlqlypspfatcdfmvrfpewlpldkwvpqvfvasgdcaerqwdflglempqwllgifiaylivavlvvisqpfkakkrdlfgr
26.dsbc蛋白的氨基酸序列：
27.mkkgfmlftllaafsgfaqaddaaiqqtlakmgikssdiqpapvagmktvltnsgvlyitddgkhiiqgpmydvsgtapvnvtnkmllkqlnalekemivykapqekhvitvftditcgychklheqmadynalgitvrylafprqgldsdaekemkaiwcakdknkafddvmagksvapascdvdiadhyalgvqlgvsgtpavvlsngtlvpgyqppkemkefldehqkmtsgk(seq id no.3)
28.yebf蛋白的氨基酸序列：
29.mgkrgaflglllvsacasvfahhhhhhannetsksvtfpkcegldaagiaasvkrdy qqnrvarwaddqkivgqadpvawvslqdiqgkddkwsvpltvrgksadihyqvsvdcka gmaeyqrr(seq id no.1)
30.metch蛋白的氨基酸序列：
31.hrhqgpifdtrpspfnpnqprpi
32.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
33.(1)本发明根据大肠杆菌分泌表达的特点，设计了一个yebf融合标签，可用于引导目的蛋白跨细胞质膜及外膜实现细胞外表达，同时在其c-末端设置tev酶的氨基酸识别位点，方便后续目的蛋白的回收与纯化，同时共表达dsb家族蛋白，可以明显提高目标蛋白的分泌表达量。
34.(2)通过dsb家族基因替换表达载体上的laci基因，可以无需添加诱导物，操作简便易行。
35.(3)通过将secm基因整合到表达载体共表达，可以进一步的提高目标蛋白胞外分
泌表达量。
附图说明
36.图1是sds-page检测重组蛋白的表达量结果图，图中：marker：蛋白marker；kda：蛋白分子量单位，千道尔顿；s1：目的蛋白在大肠杆菌中重组表达24h后的上清；s2：目的蛋白与dsbb共表达24h后收集的上清；s3：目的蛋白与dsba-dsbc共表达24h后收集的上清；s4：目的蛋白与dsba共表达24h后收集的上清；s5：目的蛋白与dsbc共表达24h后收集的上清。
37.图2为图1sds-page检测后，进行灰度分析融合蛋白表达量变化。
38.图3是sds-page检测重组蛋白的表达量结果图，marker：蛋白marker；其中s1与s2是表达载体pet28b-yebf-rs-metch的表达结果，s1：在大肠杆菌中重组表达24h后收集的上清；s2：与secm共表达24h后收集的上清。
39.图4为图3sds-page检测后，进行灰度分析融合蛋白表达量变化。
40.图5是进一步优化表达的sds-page图，marker：蛋白marker；其中1号为载体pet28b-yebf-rs-metch与pbad-dsba-dsbc载体共转化菌株，2号为pet28b-yebf-rs-metch载体上的laci基因被dsba-dsbc基因替换后转化菌株，s1：1号大肠杆菌中重组表达24h后收集的上清；s2：2号大肠杆菌中重组表达24h后收集的上清；w1：1号大肠杆菌中重组表达24h后收集的菌体；w2：2号大肠杆菌中重组表达24h后收集的菌体。
41.图6为图5sds-page检测后，进行灰度分析融合蛋白表达量变化。
42.图7为进一步优化后，构建的含有secm基因、dsb家族基因、目的融合蛋白基因的表达载体示意图。
43.图8为图7所构载体，优化表达的sds-page图，marker：蛋白marker；s1：原有融合蛋白载体在大肠杆菌中重组表达24h后收集的上清；s2：目的蛋白与dsba-dsbc在大肠杆菌中共表达24h后收集的上清；s3：图7所示载体在大肠杆菌中重组表达24h后收集的上清。
具体实施方式
44.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
45.实施例1pbad-dsba-dsbc辅助蛋白表达载体构建
46.(1)dsba-dsbc辅助蛋白基因的体外合成
47.分别扩增dsba与dsbc基因，利用pcr技术拼接dsba与dsbc，测序验证其序列正确。
48.dsba-dsbc的核苷酸序列如下所示：
49.atgaaaaagatttggctggcgctggctggtttagttttagcgtttagcgcatcggcggcgcagtatgaagatggtaaacagtacactaccctggaaaaaccggtagctggcgcgccgcaagtgctggagtttttctctttcttctgcccgcactgctatcagtttgaagaagttctgcatatttctgataatgtgaagaaaaaactgccggaaggcgtgaagatgactaaataccacgtcaacttcatgggtggtgacctgggcaaagatctgactcaggcatgggctgtggcgatggcgctgggcgtggaagacaaagtgactgttccgctgtttgaaggcgtacagaaaacccagaccattcgttctgcttctgatatccgcgatgtatttatcaacgcaggtattaaaggtgaagagtacgacgcggcgtggaacagcttcgtggtgaaatctctggtcgctcagcaggaaaaagctgcagctgacgtgcaattgcgtggcgttccggcgatgtttgttaacggtaaatatcagctgaatccgcagggtatggataccagcaatatggatgtttttgttcagcagtatgctgataca
gtgaaatatctgtccgagaaaaaataatgaagaaaggttttatgttgtttactttgttagcggcgttttcaggctttgctcaggctgatgacgcggcaattcaacaaacgttagccaaaatgggcatcaaaagcagcgatattcagcccgcgcctgtagctggcatgaagacagttctgactaacagcggcgtgttgtacatcaccgatgatggtaaacatatcattcaggggccaatgtatgacgttagtggcacggctccggtcaatgtcaccaataagatgctgttaaagcagttgaatgcgcttgaaaaagagatgatcgtttataaagcgccgcaggaaaaacacgtcatcaccgtgtttactgatattacctgtggttactgccacaaactgcatgagcaaatggcagactacaacgcgctggggatcaccgtgcgttatcttgctttcccgcgccaggggctggacagcgatgcagagaaagaaatgaaagctatctggtgtgcgaaagataaaaacaaagcgtttgatgatgtgatggcaggtaaaagcgtcgcaccagccagttgcgacgtggatattgccgaccattacgcacttggcgtccagcttggcgttagcggtactccggcagttgtgctgagcaatggcacacttgttccgggttaccagccgccgaaagagatgaaagaattcctcgacgaacaccaaaaaatgaccagcggtaaataa(seq id no.5)
50.(2)表达载体pbad-dsba-dsbc的构建
51.使用ndei与hindiii分别酶切拼接片段dsba-dsbc与表达载体pbad24m，连接获得pbad-dsba-dsbc载体。
52.按照下表1与表2配制酶切体系(10μl)与连接体系，冰上操作，37℃酶切12h。
53.表1dna的酶切体系
[0054][0055]
按照tiangen公司dna纯化试剂盒说明书，纯化回收酶切后产物，使用takara的t4连接酶，按照摩尔数比1:2-1:4加入载体和需要连接的目的片段，按照下表(表2)配制连接体系(10μl)，冰上操作，16℃连接12h，菌落pcr、酶切鉴定，测序。
[0056]
表2dna体外连接体系
[0057][0058]
实施例2表达载体pet28b-yebf-rs-metch的构建
[0059]
(1)yebf-rs-metch基因的体外扩增
[0060]
利用重叠pcr分别扩增yebf与metch基因，同时在yebf基因的信号肽与成熟蛋白之间插入编码his-tag的序列，在metch基因的5’末端链接编码tev酶识别位点(rs)(enlyfq)序列。
[0061]
yebf-rs-metch的氨基酸序列如下：
[0062]
mgkrgaflglllvsacasvfahhhhhhannetsksvtfpkcegldaagiaasvkrd
[0063]
yqqnrvarwaddqkivgqadpvawvslqdiqgkddkwsvpltvrgksadihyqvsvdck
[0064]
agmaeyqrrpasggggagsefenlyfqhrhqgpifdtrpspfnpnqprpi
[0065]
其对应的核苷酸序列如下：
[0066]
atgggtaaaagaggggcgtttttagggctgttgttggtttctgcctgcgcatcagttttcgctcatcatcatcatcatcacgccaataatgaaaccagcaagtcggtcactttcccaaagtgtgaaggtctggatgctgccggaattgccgcgagcgtaaaacgtgattatcaacaaaatcgcgtggcgcgctgggcagatgatcaaaaaattgtcggtcaggccgatcccgtggcttgggtcagtttgcaggacattcagggtaaagatgataaatggtcagtaccgctaaccgtgcgtggtaaaagtgccgatattcattaccaggtcagcgtggactgcaaagcgggaatggcggaatatcagcgccgtccagcttctggtggaggtggtgcgggatccgaattcgaaaacctgtactttcagcaccgtcaccagggtccgatcttcgacacccgtccgtctccgttcaacccgaaccagccgcgtccgatctaa
[0067]
(2)表达载体pet28b-yebf-rs-metch的构建
[0068]
使用nco i和bamh i酶切pcr扩增的yebf基因；使用ecor i和hind iii酶切pcr扩增的yebf基因，酶切产物分别与表达载体pet28b连接，获得pet28b-yebf-rs-metch载体。
[0069]
酶切连接体系如上表1和表2所示。
[0070]
实施例3诱导辅助蛋白与目的蛋白在大肠杆菌中的共表达
[0071]
将上述构建的包含辅助蛋白(dsb家族基因)的pbad载体与表达载体pet28b-yebf-rs-metch共转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单个克隆，接种至液体lb培养基中培养过夜，按体积比1:100扩大培养至od
600
为0.5～0.7，分别加入终浓度为0.3mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)及0.3％的阿拉伯糖，于30℃诱导蛋白表达24h，在12000g、10min、4℃条件下离心去除菌体，获得表达重组蛋白的上清。
[0072]
通过sds-page检测重组蛋白的表达量情况，如图1和2所示，共表达辅助蛋白(dsb家族蛋白)，可明显提高目的蛋白yebf-rs-metch的表达量。
[0073]
实施例4诱导转运蛋白与目的蛋白在大肠杆菌中的共表达
[0074]
将构建的包含secm基因的pbad载体与pet28b-yebf-rs-metch表达载体共转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单个克隆，接种至液体lb培养基中培养过夜，按体积比1:100扩大培养至od
600
为0.5～0.7，加入终浓度为0.3mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，于30℃诱导表达24h，在12000g、10min、4℃条件下离心去除菌体，获得表达重组蛋白的上清。
[0075]
通过sds-page检测重组蛋白的表达量情况，如图3和图4所示，携带sec系统的相关转运蛋白基因的pbad载体与pet28b-yebf-rs-metch载体的共表达，明显优于对照pet28b-yebf-rs-metch单转化菌株。
[0076]
实施例5辅助蛋白基因替换pet载体的laci基因的共表达
[0077]
将dsba-dsbc替换pet28b-yebf-rs-metch载体上的laci基因，转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单个克隆，接种至液体lb培养基中培养过夜，按体积比1:100扩大培
养至od
600
为0.5～0.7，于30℃表达24h，在12000g、10min、4℃条件下离心去除菌体，获得表达重组蛋白的上清。
[0078]
通过sds-page检测重组蛋白的表达量情况，如图5、图6所示，dsba-dsbc基因替换载体pet28b-yebf-rs-metch laci基因的表达量，与pbad-dsba-dsbc/pet28b-yebf-rs-metch共转化菌株没有明显差别，替换laci基因后，目的蛋白的表达无需添加诱导物，更加便捷。
[0079]
在以上实验的基础上，将同样可提高目的蛋白表达量的secm基因整合到载体相应位置，获得如图7所示载体，该表达载体可进一步提高目的蛋白的细胞外分泌表达量，同时无需诱导物诱导，操作简便易行，优化后的表达情况如图8所示。
[0080]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的表达载体，其特征在于，至少包含：(1)目标蛋白编码序列和yebf蛋白编码序列，目标蛋白编码序列与yebf蛋白编码序列通过tev酶切识别位点编码序列连接；(2)dsba和dsbc蛋白编码基因。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，还包含secm蛋白编码基因。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体不含laci基因。4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述yebf蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，tev酶切识别位点的氨基酸序列为enlyfq，dsba蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示，dsbc蛋白氨基酸序列如seq id no.3所示。5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述dsba和dsbc蛋白编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。6.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述secm蛋白氨基酸序列如seq id no.4所示。7.一种含有权利要求1-6任一项所述的表达载体的大肠杆菌。8.一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的方法，其特征在于，将目标蛋白与yebf蛋白在大肠杆菌中融合表达，同时共表达dsba蛋白、dsbc蛋白。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还同时共表达secm蛋白。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，目标蛋白与yebf融合蛋白、dsba蛋白、dsbc蛋白及secm蛋白通过同一表达质粒表达，所述表达质粒空载体为pet28b，且去除了laci基因。

技术总结
本发明公开了一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的表达载体，至少包含：(1)目标蛋白编码序列和YebF蛋白编码序列，目标蛋白编码序列与YebF蛋白编码序列通过TEV酶切识别位点编码序列连接；(2)DsbA、DsbC和SecM蛋白编码基因。本发明根据大肠杆菌分泌表达的特点，设计了一个YebF融合标签，可用于引导目的蛋白跨细胞质膜及外膜实现细胞外表达，同时在其C-末端设置TEV酶的氨基酸识别位点，方便后续目的蛋白的回收与纯化，同时共表达Dsb家族蛋白与SecM蛋白，可以明显提高目标蛋白的分泌表达量。量。量。


技术研发人员：王声斌 林梓煌 牛放 王志鹏 赵芙蓉 彭阳选
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/9