一种恒山黄芪的质量评价模型及质量评价方法

1.本发明属于原料药质量评价技术领域，具体涉及一种恒山黄芪的质量评价模型及质量评价方法。


背景技术：

2.恒山黄芪是山西道地药材，因主产于恒山山脉及周边而得名，是中国优质黄芪的代名词。市场上恒山黄芪多为蒙古黄芪，多年生长且具有自交不亲和特性，受此影响现阶段恒山黄芪的良种选育工作较为滞后，遗传资源依然较为混乱。因此，从现有恒山地区生长的黄芪中初步寻找农艺性状、有效成分含量、基因表达量间的相关性，对黄芪优良品种的选育具有重要意义。
3.目前，诸多学者对黄芪农艺性状与有效成分含量的相关研究多集中于根部性状与根部有效成分含量的相关性分析，而对于更深层次的根部农艺性状、有效成分含量、合成有效成分的酶基因表达量之间的相关性研究，鲜有报道。lindermayr c等发现4cl基因家族可以参与植物的生长和发育；宋东亮等发现4cl基因可以参与木质素的代谢，木质素是一种酚类聚合物，主要参与次生细胞壁的构成，在次生细胞壁中以高度交联的形式存在，可以增强植物的机械支持能力；赵莹等发现4cl基因可以参与根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷等黄酮类成分的合成。因此，本领域期待更加多元化的对恒山黄芪的质量进行有效评价，为恒山黄芪的良种选育及广泛栽培提供技术支持。


技术实现要素：

4.为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种恒山黄芪的质量评价模型，所述质量评价模型基于恒山黄芪的农艺性状、有效成分含量、合成有效成分的酶基因表达量对恒山黄芪进行多元化质量评价，可有效表达恒山黄芪的质量特征；
5.本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于农艺性状、有效成分含量、合成有效成分的酶基因表达量等特征进行恒山黄芪质量评价的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明所述的一种恒山黄芪的质量评价模型，包括如下质量评价指标：
7.(a)恒山黄芪根部的农艺性状指标；
8.(b)恒山黄芪中有效成分的含量；
9.(c)恒山黄芪中有效成分合成酶基因的表达量。
10.具体的，所述恒山黄芪的质量评价模型，所述恒山黄芪根部的农艺性状指标包括所述恒山黄芪的根长、根重、根粗值。
11.具体的，所述恒山黄芪的质量评价模型，所述恒山黄芪的有效成分包括毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素以及黄芪甲苷。
12.具体的，所述恒山黄芪的质量评价模型，所述恒山黄芪中有效成分合成酶基因包括合成酮类成分关键酶基因和/或合成皂苷类成分关键酶基因；
13.优选的，所述合成酮类成分关键酶基因包括：4cl基因、i3’h基因、chr基因、chi基因、ifs基因、pal基因、c4h基因、chs基因、iomt基因和/或ucgt基因；
14.优选的，所述合成皂苷类成分关键酶基因包括：hmgs基因、hmgr1基因、hmgr2基因、hmgr3基因、mk基因、mvd基因、idi基因、pmk基因、fps基因、ss基因、se基因、cas基因和/或aact基因。
15.本发明还公开了一种恒山黄芪的质量评价方法，包括按照所述质量评价模型中的指标对所述恒山黄芪进行检测的步骤。
16.具体的，所述恒山黄芪的质量评价方法，包括如下步骤：
17.(1)对所述恒山黄芪的农艺性状指标进行检测；
18.(2)对所述恒山黄芪中的有效成分含量进行检测；
19.(3)对所述恒山黄芪中有效成分合成酶基因的表达量进行检测；
20.(4)分别对所述恒山黄芪的农艺性状指标、有效成分含量及有效成分合成酶基因的表达量进行相关性分析。
21.具体的，所述恒山黄芪的质量评价方法，所述步骤(2)中，所述恒山黄芪中的有效成分含量检测的步骤采用hplc-uv/elsd法进行检测；
22.优选的，所述hplc-uv/elsd检测步骤条件包括：
23.色谱柱waters c
18 symmetry；
24.柱温25
±
5℃；
25.流速1.0ml/min；
26.进样体积10μl；
27.检测波长260nm；
28.流动相为乙腈(a)-0.2％甲酸水(b)；
29.洗脱采用二元梯度洗脱模式：0-5min，2.2％-2.3％ a，5-10min，2.3％-2.4％ a，10-14min，2.4％-9.0％ a，14-23min，9.0％-12.0％ a，23-30min，12.0％-19.3％ a，30-38min，19.3％-24.3％ a，38-45min，24.3％-28.8％ a，45-47min，28.8％-29.2％ a，47-55min，29.2％-29.3％ a，55-56min，29.3％-30.0％ a，56-57.5min，30.0％-34.0％ a，57.5-58.5min，34.0％-40.0％ a，58.5-66.5min，40.0％-40.0％ a，66.5-70.0min，40.0％-60.0％ a，70.0-75.0min，60.0％-60.0％ a；
30.蒸发光散射检测器参数：蒸发温度75℃，气体流量2.5ml/min，信号增益3，采样频率20hz。
31.具体的，所述恒山黄芪的质量评价方法，所述步骤(3)中，采用实时荧光定量pcr法对所述恒山黄芪中有效成分合成酶基因的表达量进行检测；
32.优选的，不同目标基因选用的引物包括：
33.pal-f：catcaaatctctctggcagtaggaa；
34.pal-r：agttcacatcttggttatgctgctc；
35.c4h-f：aacaaagtgagggatgaaattgaca；
36.c4h-r：ggattgccattcttagccttagtgt；
37.4cl-f：tgtccctcctattgttttggctatt；
38.4cl-r：ctttggggaatttagctctgacagt；
39.chs-f：ccttctttggatgctagacaagaca；
40.chs-r：cgaagacccaagagtttggttagtt；
41.chr-f：aaacaaggttacaggcattttgaca；
42.chr-r：ggaagaacgagatgaggatgatttt；
43.chi-f：atcgagtttttccaccaggatctac；
44.chi-r：atcatagtctccaacacagcctcag；
45.ifs-f：ccttcacctattggacaaacctctt；
46.ifs-r：cctggtattaaaggaagaagcctca；
47.iomt-f：tgagggaatggcaagtga；
48.iomt-r：cccagcaagttagcgaca；
49.i3’h-f：ggatgttaaagaagcgaagcaattt；
50.i3’h-r：atcaaacaatctcaacaaaggcaaa；
51.ucgt-f：gaactcgactctggaaagtgtgtgt；
52.ucgt-r：ggtgcataaatcttcaaaacctcag；
53.aact-f：ggtgagcggagagaaggcat；
54.aact-r：cgagtgctggagcggttgta；
55.hmgs-f：ccttcttcggcattgctttcatc；
56.hmgs-r：tcgagatcccggctttggta；
57.hmgr1-f：ccttcttcggcattgctttcatc；
58.hmgr1-r：actccggcagtggtttcctg；
59.hmgr2-f：gccggccaccataaacga；
60.hmgr2-r：cgacggagaagaagagggtgaa；
61.hmgr3-f：gccggccaccataaacga；
62.hmgr3-r：ggtcggcaattttcgatggtag；
63.mk-f：aacatgccgttgttcacgga；
64.mk-r：aactccaatgccgcatcgtt；
65.pmk-f：agatcacccggacaggaagga；
66.pmk-r：ccgcacatagcgatgacttcc；
67.mvd-f：taagggagatccgcgctcgt；
68.mvd-r：cagctgacgaagccagtcca；
69.idi-f：tgctggtgagggaggtttgaa；
70.idi-r：tcatgtcagcgacctcaccaa；
71.fps-f：cgaccggatgctggactaca；
72.fps-r：ccaaccaagagcactggcaa；
73.ss-f：aagcagatccctccggaacc；
74.ss-r：acagcgttgcgaagttcggt；
75.se-f：tggaacaaggaaccgtgacatct；
76.se-r：acaaagagaacgcctcaagttgga；
77.cas-f：tggagatttcccacagcagga；
78.cas-r：caagttgcggcatttggtgt；
79.18s rna-f：tgcagaatcccgtgaaccatc；
80.18s rna-r：aggcatcgggcaacgatatg。
81.具体的，所述恒山黄芪的质量评价方法，所述步骤(4)中，所述恒山黄芪的农艺性状指标、有效成分含量及有效成分合成酶基因的表达量的相关性包括：所述恒山黄芪的根粗、根长、根重三者之间两两呈现正相关，且与黄酮类成分含量呈负相关，与皂苷类成分含量呈正相关；所述恒山黄芪的根越粗，根中黄酮类成分含量越低，皂苷类成分含量越高，根中4cl、i3’h、hmgr1、mk、mvd、idi基因的表达量越高。
82.本发明还公开了所述质量评价模型或所述质量评价方法在恒山黄芪的质量评价领域的应用。
83.本发明所述恒山黄芪的质量评价模型，通过对所述恒山黄芪根部的农艺性状及有效成分的含量、黄酮及皂苷类成分合成的关键酶基因表达量进行测定，通过相关分析以探索恒山黄芪植株根部性状、有效成分含量及合成黄酮、皂苷类成分关键酶基因表达量间的相关性，从而为恒山黄芪的定向育种提供一定的理论参考。
84.本发明所述恒山黄芪的质量评价模型，本着供试品含量高易测量、对照品品质好易获取的基本原则，选定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷为本研究的考察指标，作为黄芪补益气血的重要药效物质基础，此5种成分在治疗多种复杂病症方面具有良好疗效，可以作为黄芪优劣评价的质量标志物。本发明所述评级方法为日后黄芪的选育提供一定的帮助，在以具有神经保护、抗氧化应激作用的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为选育目标时，可以将茎秆较细的黄芪视为优质黄芪，为恒山黄芪植株的选择、培育目标提供了科学依据。
85.本发明所述恒山黄芪的质量评价方法，通过对恒山黄芪农艺性状、主要有效成分含量、有效成分合成酶基因表达量进行测定，并对三者之间的相关性进行表征及分析。可以发现，恒山黄芪根部农艺性状之间，根粗、根长、根重三者两两间均呈正相关，且与恒山黄芪中黄酮类成分含量呈负相关，与皂苷类成分含量呈正相关；而随着根粗的递增，根中4cl、i3’h、hmgr1、mk基因的表达量呈显著性递增，mvd、idi基因的表达量有递增趋势但显著性不强或不具显著性。本发明所述恒山黄芪的质量评价方法可以看出，恒山黄芪的根越粗，根中黄酮类成分含量越低，皂苷类成分含量越高，根中4cl、i3’h、hmgr1、mk、mvd、idi基因的表达量越高，此6种基因可以作为调控恒山黄芪根粗与黄酮、皂苷类成分含量高低的“开关”，可以通过对恒山黄芪根中此6种基因的早期调控以实现植物根粗与有效成分含量双高的“最优解”，为恒山黄芪的优化育种提供技术支持。
附图说明
86.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
87.图1为标准品溶液(a)和样品溶液(b)的hplc-uv/elsd图；其中，1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷，2-芒柄花苷，3-毛蕊异黄酮，4-芒柄花素，5-黄芪甲苷；
88.图2为恒山黄芪有效成分含量与农艺性状的相关性热图；
89.图3为合成黄酮类成分关键酶基因表达量与根粗的相关分析结果；
90.图4为合成皂苷类成分关键酶基因表达量与根粗的相关分析结果。
具体实施方式
91.本发明如下实施例中，涉及的设备包括：
92.数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司、hh-s6)；
93.药典筛(绍兴市上虞圣超仪器设备有限公司、四目)；
94.烘箱(上海博迅、hpx-9162mbe)；
95.万能粉碎机(红景天工贸、de-100g、de-50g)；
96.超声波清洗机(宁波新芝生物、sb25-12dtdn)；
97.高效液相色谱仪(e2695-2998，美国waters)；
98.蒸发光散射检测器(上海通微、um5800plus)；
99.空气泵(上海通微、uma-10lp)；
100.waters c
18
色谱柱(250*4.6mm*5μm，序列号：03313027214053，美国waters公司)；
101.实时荧光定量pcr仪(bio-rad公司，型号：cfx96
tm
real-time system)；
102.电子天平(赛多利斯,bsa223s)；
103.高速离心机(thermo fisher scientific,pico21)；
104.超微量紫外分光光度计(thermo fisher scientific,nanodrop one)；
105.pcr仪(bio-rad,c1000 touch
tm thermal cycler)；
106.电泳仪电源(bio-rad,powerpac
tm universal)；
107.凝胶成像仪(天能,tanon 3500r)。
108.本发明如下各实施例中，涉及的试剂包括：
109.甲酸、乙腈(oceanpak，色谱纯)；
110.毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(上海融禾，20633-67-4)；
111.芒柄花素对照品(上海融禾，485-72-3)，纯度均≥98％；
112.毛蕊异黄酮对照品(上海融禾，20575-57-9)，纯度均≥98％；
113.芒柄花苷对照品(上海融禾，486-62-4)，纯度均≥98％；
114.黄芪甲苷对照品(上海融禾，84687-43-4)，纯度均≥98％；
115.柱式多糖多酚植物rna提取试剂盒(索莱宝，r2060)；
116.通用反转录试剂盒(m-mlv)(索莱宝，rp1105)；
117.tb premix ex taq
tmⅱ(tli rnaseh plus)(takara，rr820a)。
118.实施例1样品前处理
119.本实施例中采用的恒山黄芪由课题组成员于2022年6月前往浑源采集，均为5年生仿野生蒙古黄芪astragalus membranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao，合计45株，经山西省食品药品检验所鉴定为豆科植物蒙古黄芪astragalus membranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao正品，保存于山西中医药大学黄芪资源产业化及产业国际化协同创新中心生物样本库。
120.将采集到的恒山黄芪去除泥沙、芦头，并测定根粗、根长等农艺性状指标。根据测量结果，将根粗》1.33cm的15株归为“粗”组、1.12cm》根粗》1.33cm的15株归为“中”组、根粗《1.12cm的15株归为“细”组。
121.分别取斩口下0-2cm处木质部外层与韧皮部内层嫩质纤维各1-2mm分装并冻存，待用；其余药材流水冲洗，于55℃烘箱进行烘干，切段后用万能粉碎机粉碎，过筛(四号药典筛)，待用。
122.实施例2农艺性状测量
123.本实施例中，针对上述实施例1中处理后的黄芪样本进行农艺性状数据的测量。其中，测量所述黄芪的根长为根部斩口处至根末端距离，根粗为斩口下3.5cm处直径，地根重为根部斩口至根末端部分质量。记录各株黄芪的根长和根粗数据，结果见下表1。
124.表1 45株黄芪的农艺性状测定结果表
125.[0126][0127]
实施例3有效成分含量测定
[0128]
本实施例中，针对上述实施例1中处理后的黄芪样本进行有效成分含量的检测，检测成分包括毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、黄芪甲苷，具体测定方法采用hplc法检测。
[0129]
溶液的制备
[0130]
混合对照品溶液的制备：精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷各7.5mg、3.7mg、2.5mg、1.2mg至5ml棕色容量瓶，并用甲醇溶解定容至刻度线，混匀，即得。取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加入80％甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
[0131]
供试品溶液的制备：黄酮类有效成分及黄芪甲苷的供试品溶液的制备方法按2020年版中国药典一部所示方法制备。
[0132]
参考文献报道，将恒山黄芪根部冲洗干净，55℃烘箱烘干，切段，粉碎，过四号筛，取恒山黄芪粉末1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定质量，加热回流4h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0133]
色谱条件
[0134]
色谱柱waters c
18 symmetry(批号：0331302721)；
[0135]
柱温25
±
5℃；
[0136]
流速1.0ml/min；
[0137]
进样体积10μl；
[0138]
检测波长260nm；
[0139]
流动相为乙腈(a)-0.2％甲酸水(b)；
[0140]
洗脱采用二元梯度洗脱模式：0-5min，2.2％-2.3％ a，5-10min，2.3％-2.4％ a，10-14min，2.4％-9.0％ a，14-23min，9.0％-12.0％ a，23-30min，12.0％-19.3％ a，30-38min，19.3％-24.3％ a，38-45min，24.3％-28.8％ a，45-47min，28.8％-29.2％ a，47-55min，29.2％-29.3％ a，55-56min，29.3％-30.0％ a，56-57.5min，30.0％-34.0％ a，57.5-58.5min，34.0％-40.0％ a，58.5-66.5min，40.0％-40.0％ a，66.5-70.0min，40.0％-60.0％ a，70.0-75.0min，60.0％-60.0％ a；
[0141]
蒸发光散射检测器参数：蒸发温度75℃，气体流量2.5ml/min，信号增益3，采样频率20hz。
[0142]
本实施例中，所述对照品溶液以及样本溶液的hplc-uv/elsd图谱分别见图1中(a)-(b)所示，其中，谱图中各峰表示：1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷，2-芒柄花苷，3-毛蕊异黄酮，4-芒柄花素，5-黄芪甲苷。
[0143]
实施例4方法学考察
[0144]
本实施例中，针对上述实施例3中对黄芪有效成分检测的方法进行方法学考察。
[0145]
线性与范围
[0146]
使用1ml移液管精密吸取混合对照品储备液0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml于5个5ml量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度线，即得5个梯度系列浓度的混合对照品溶液。进样测定并以峰面积值为纵坐标(y)，以浓度为横坐标(x)构建回归方程，结果见下表2。
[0147]
表2各成分线性关系
[0148]
成分回归方程r线性范围/(μg/ml)毛蕊异黄酮葡萄糖苷y＝25020x+718820.999525.2-252芒柄花苷y＝43519x+954400.999519.2-192毛蕊异黄酮y＝148675x+2558970.99974-40芒柄花素y＝67203x+455470.99967.2-72
[0149]
精密度试验
[0150]
取对照品溶液1份连续进样6次，色谱条件同实施例3，记录各测定峰的峰面积。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷6次进样后峰面积的rsd值分别为0.43％、0.41％、0.43％、0.37％，表明仪器精密度良好。
[0151]
重复性试验
[0152]
按实施例3所示方法制备6个hyq-19样品供试品溶液，进样测定，记录并计算待检色谱峰峰面积的rsd值。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷的rsd值各为1.84％、2.15％、2.64％、2.34％，表明该方法的重复性良好。
[0153]
稳定性试验
[0154]
分别于0、2、4、6、8、12h按实施例3中方法进样并计算hyq-19样品各待测色谱峰峰面积的rsd值，发现hyq-19样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷峰面积的rsd值各为0.25％、0.38％、2.23％、0.51％，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
[0155]
加样回收率试验
[0156]
精密称定已知含量的黄芪样品9份，按样品中有效成分含量的50％、100％、150％精密加入混合对照品溶液，每个质量浓度重复3次，按实施例3所示方法制备供试品溶液，进
样测定并计算各待测峰峰面积的rsd值，计算回收率并取平均值，结果如表3所示。可见，rsd值均小于5％，故准确性良好。
[0157]
表3黄芪根部四种有效成分加样回收率的计算结果
[0158][0159]
利用上述方法对前述45株黄芪的有效成分进行检测，结果如下表4所示。
[0160]
表4 45株黄芪的有效成分含量测定结果表
[0161]
[0162][0163]
实施例5黄芪有效成分含量及农艺性状指标的统计学分析
[0164]
本实施例采用spss 26.0进行统计描述与各因素间的相关性分析，originpro 2022与graphpad prism 9.5.0作图。
[0165]
将上述45株黄芪的有效成分含量及农艺性状指标进行描述统计，结果如表5所示，恒山黄芪有效成分含量与农艺性状的相关性热图见附图2，方格中系数为相关性系数，系数越大，表明相关性越强。
[0166]
表5黄芪有效成分含量及农艺性状指标测定结果的描述统计表
[0167]
成分最小值最大值均值标准偏差变异系数
毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.0310.4060.1510.0910.605芒柄花苷0.0080.1110.0310.0210.668毛蕊异黄酮0.0010.0040.0020.0010.278芒柄花素0.0000.0020.0010.0011.333黄芪甲苷0.0120.3850.1970.0970.489根长33.00079.00056.52211.0300.195根重0.0050.2450.0540.0460.850根粗0.1342.7041.3110.4370.333
[0168]
由表5所示结果可见，本发明所采集的45株黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量分布在0.031％-0.406％的范围内，芒柄花苷含量分布在0.008％-0.111％的范围内，毛蕊异黄酮含量分布在0.001％-0.004％的范围内，芒柄花素含量分布在0.000％-0.002％的范围内，黄芪甲苷含量分布在0.012％-0.385％的范围内。芒柄花素变异系数最大，为1.333；而根长变异系数最小，为0.195。
[0169]
如图2所示结果，恒山黄芪的大部分农艺性状与黄酮类成分呈负相关，与皂苷类成分呈正相关，在农艺性状与黄酮类成分的相关性中，仅根粗与芒柄花苷含量呈正相关。黄芪的根越粗，则根长越长，根越重，与此同时，芒柄花苷含量与黄芪甲苷含量越高，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素含量越低。
[0170]
实施例6合成黄酮、皂苷类成分关键酶基因表达量的检测
[0171]
本实施例中，针对上述实施例1中处理后的黄芪样本进行合成黄酮、皂苷类成分关键酶基因表达量的检测。其中，合成黄酮类成分关键酶基因包括pal、c4h、4cl、chs、chr、chi、ifs、iomt、i3’h、ucgt基因；合成皂苷类成分关键酶基因包括aact、hmgs、hmgr1、hmgr2、hmgr3、mk、pmk、mvd、idi、fps、ss、se、cas基因。
[0172]
参照柱式多糖多酚rna提取试剂盒说明书对根部样品的总rna进行提取，所用引物序列见下表6，均由上海生工生物合成。提取完毕后进行采用超微量紫外分光光度计对rna的纯度、浓度进行检测，对符合要求的rna进行电泳检测。
[0173]
表6引物信息表
[0174]
[0175][0176]
取合格的rna样品参照通用反转录试剂盒(m-mlv)试剂盒说明书进行cdna合成并混样，取cdna 2μl加入前、后引物各1μl，荧光染剂12.5μl，灭菌水补齐至25μl，3次生物学重复，实时荧光定量pcr仪检测并用2-δδct
法定量，qpcr的反应程序为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，扩增40个循环。
[0177]
利用上述方法分别对45株黄芪中合成黄酮、皂苷类成分关键酶基因表达量进行测定，结果如下表7所示。
[0178]
表7 45株黄芪的基因表达量数据表
[0179]
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184][0185]
实施例7合成黄酮类成分关键酶基因表达量与根粗的相关统计学分析
[0186]
本实施例采用spss 26.0进行统计描述与各因素间的相关性分析，originpro 2022与graphpad prism 9.5.0作图。
[0187]
本实施例45株黄芪的合成黄酮类成分关键酶基因表达量与根粗的相关统计学结果见附图3。
[0188]
如图3所示结果，合成黄酮类成分的大部分关键酶基因的表达量与根的粗细有关，其中4cl、i3’h基因的表达量与根的粗细呈正相关，随着根粗的递增，根中4cl、i3’h基因的表达量呈显著性递增；chr、chi、ifs基因的表达量与根的粗细呈负相关，随着根粗的递增，此3种基因的表达量有递减趋势但显著性不强或不具显著性。
[0189]
实施例8合成皂苷类成分关键酶基因表达量与根粗的相关分析
[0190]
本实施例采用spss 26.0进行统计描述与各因素间的相关性分析，originpro 2022与graphpad prism 9.5.0作图。
[0191]
本实施例45株黄芪的合成皂苷类成分关键酶基因表达量与根粗的相关统计学结果见附图4。
[0192]
如图4所示结果，合成皂苷类成分的大部分关键酶基因的表达量与根的粗细有关，其中hmgr1、mk基因的表达量与根的粗细呈正相关，随着根粗的递增，此两种基因的表达量呈显著性递增；mvd、idi基因的表达量随根粗的递增有递增趋势但显著性不强或不具显著性；hmgr2基因的表达量与根的粗细呈负相关，根越粗，此基因的表达量越低。
[0193]
实施例9
[0194]
本实施例中，恒山黄芪样本于2021年10月采自浑源、应县、天镇，采用五点取样法采集，均为5年生仿野生蒙古黄芪astragalus membranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao，合计92株，经山西省食品药品检验所史献海主任药师鉴定为正品，保存于山西中医药大学黄芪资源产业化及产业国际化协同创新中心生物样本库。
[0195]
按照前述实施例2中方法及指标，测定92株恒山黄芪的根长、根重、地上生物量、茎粗、株高、根粗。株高为植物地上部分株顶端至植物基部距离，茎粗为植株基部直径，根长为根部斩口处至根末端距离，根粗为斩口下3.5cm处直径，地上生物量为地上部分质量(茎+叶)，根重为根部斩口至根末端部分质量。检测结果见下表8所示。
[0196]
表8 92株黄芪的农艺性状测定结果表
[0197]
[0198]
[0199][0200]
本实施例按照前述实施例3所述方法进行黄芪有效成分的测定，结果见下表9。
[0201]
表9 92株黄芪的有效成分含量测定结果表
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206][0207]
本实施例采用spss 26.0软件进行简单相关分析、逐步回归分析，锁定r2最高的回归方程进行进一步的通径分析，探索各有效成分含量与各农艺性状间的相关性。
[0208]
根据上述检测得到的黄芪有效成分含量及农艺性状指标的描述统计，测定结果见下表10。
[0209]
表10 92株恒山黄芪有效成分含量及农艺性状指标测定结果
[0210]
项目最小值最大值平均值标准偏差变异系数/％毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.0020.1280.0340.02572.150芒柄花苷0.0010.0540.0130.01076.920毛蕊异黄酮00.0260.0040.005126.770芒柄花素00.0100.0010.002151.420黄芪甲苷0.0220.2540.1170.05042.400根长17.000170.00068.77029.05042.240根重0.0050.2600.0810.06276.430地上生物量0.0010.2750.0290.039134.170茎粗0.2100.9700.4890.15631.800株高4.800145.00077.69333.04442.530根粗0.4303.1841.4940.46531.150
[0211]
可见，92株黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量分布在0.002％-0.128％的范围内，芒柄花苷含量分布在0.001％-0.054％的范围内，毛蕊异黄酮含量分布在0-0.026％的范围内，芒柄花素含量分布在0-0.010％的范围内，黄芪甲苷含量分布在0.022％-0.254％的范围内。其中，芒柄花素变异系数最大，为151.42％，根粗变异系数最小，为31.15％。
[0212]
根据上述测定的农艺性状与有效成分含量的结果进行相关性分析，结果如下表11所示。
[0213]
表11恒山黄芪根部各主要有效含量与各农艺性状的简单相关分析
[0214][0215][0216]
注：
*
p＜0.05表示相关性显著，
**
p＜0.01表示相关性极显著。
[0217]
可见，大部分农艺性状与苷类成分呈显著负相关，与苷元类成分呈显著正相关，在农艺性状与苷元类成分的相关性中，仅根长与毛蕊异黄酮含量呈负向作用。毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量与根重、地上生物量、株高、根粗、茎粗、根长呈显著负相关；根重与有效成分含量呈显著相关性的种类数目最多，可达3种，其余农艺性状与有效成分含量的呈显著相关性所涉及的化合物种类数目差异不大，分别为1-2种。茎粗、株高与根重、根粗均可建立显著正相关关系，而与根长无法建立相关性。
[0218]
根据上述测定的农艺性状与有效成分含量的结果进行逐步回归分析，以根中5种有效成分含量分别为因变量，分别用y1、y2、y3、y4、y5表示，其余变量为自变量(x)，建立逐步回归分析方程，结果如下表12所示。
[0219]
表12逐步回归分析方程汇总表
[0220]
成分回归方程r2毛蕊异黄酮葡萄糖苷y1＝0.016－0.019x
茎粗
+1.170x
毛蕊异黄酮
－3.393x
芒柄花素
+2.170x
芒柄花苷
0.825毛蕊异黄酮y2＝0.001+1.903x
芒柄花素
0.629芒柄花素y3＝0.001－0.04x
株高
+0.323x
毛蕊异黄酮
+0.067x
芒柄花苷
0.689芒柄花苷y4＝0.001+0.345x
株高
0.782
黄芪甲苷y5＝0.202+0.000367x
株高
－0.111x
茎粗
－0.039x
根粗
0.260
[0221]
由上述结果可知，当以毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为因变量，其他指标为自变量时，所构建的回归方程r2最大，为0.825；以黄芪甲苷含量为因变量，其他指标为自变量时，r2最小，仅有0.260。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为因变量时所构建的回归方程为例，根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量平均每增加1单位，茎粗平均减少0.019个单位，毛蕊异黄酮含量增加1.170个单位，芒柄花素含量减少3.393个单位，芒柄花苷含量增加2.170个单位，其余方程同理。
[0222]
在上述结果中，参数r2表示回归模型的解释程度，越大解释程度越高。因此，锁定r2值最高的回归方程，即y1＝0.016-0.019x
茎粗
+1.170x
毛蕊异黄酮
－3.393x
芒柄花素
+2.170x
芒柄花苷
(r2＝0.825)，进行更深一层的通径分析，结果见下表13所示。
[0223]
表13通径分析表
[0224][0225]
由上表结果可知，4个自变量对根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的直接影响大小排序为芒柄花素含量》芒柄花苷含量》毛蕊异黄酮含量》茎粗，其中，茎粗对毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量无论从直接作用还是间接作用，最终都会对根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量起到负向作用，而芒柄花苷、芒柄花素无论直接作用还是间接作用最终均会对根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累起到正向作用。毛蕊异黄酮对根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累虽然具有正向的直接作用，但由于其他成分负向的影响作用较大，故毛蕊异黄酮的积累最终与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累呈负向相关。
[0226]
本实施例通过相关分析与回归模型构建对恒山黄芪主要有效成分含量与农艺性状间的相关关系及数量关系进行解析，初步阐释了各指标间的简单相关性及变化规律；通过通径分析的分解作用将简单相关系数分解为直接通径系数与间接通径系数，对各指标间的作用方式及大小进行了更深层次的明确。可见，恒山黄芪样本中，黄芪茎秆越粗、根越粗，根中黄芪甲苷含量越低，而且，除根粗与有效成分的相关关系之外，本发明还发现黄芪的地上部分茎秆越粗，根中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量越低，也是发明首次探索黄芪的农艺性状与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的关系，为恒山黄芪的资源化开发及利用提供了技术支持。
[0227]
综上，本发明通过对恒山黄芪根部主要有效成分含量和农艺性状、合成黄酮与皂苷类成分关键酶基因的表达量相关关系进行评价，可用于对恒山黄芪的质量等情况进行评价表征。本发明结果显示，黄芪根越粗，4cl基因表达量越高，黄酮类成分含量越低，故而可以推断4cl基因在黄芪中具有促进根径增长与合成黄酮的作用，且在此种作用中，促进根径生长的作用占主导地位。类似的，本发明还发现i3’h基因表达后所产生的效应与4cl基因的具有一致性，即i3’h基因的表达量越高，根越粗，黄酮类成分含量越低；hmgr1、mk、mvd、idi基因的表达效应与4cl基因的表达效应相似但有所不同：hmgr1、mk、mvd、idi基因的表达量越高，根越粗，根中皂苷类成分含量越高，预示着hmgr1、mk、mvd、idi基因的表达在引起根径
生长和合成皂苷的效应上具有协同性。
[0228]
因此，本发明筛选恒山黄芪根中4cl、i3’h、hmgr1、mk、mvd、idi基因是调控其根粗与黄酮、皂苷类成分含量高低的“开关”，通过对恒山黄芪根中此6种基因的早期调控，可以实现植物根粗与有效成分含量双高的“最优解”，并与其具体机制进行深层次的研究。
[0229]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种恒山黄芪的质量评价模型，其特征在于，包括如下质量评价指标：(a)恒山黄芪的根部农艺性状指标；(b)恒山黄芪中有效成分的含量；(c)恒山黄芪中有效成分合成酶基因的表达量。2.根据权利要求1所述恒山黄芪的质量评价模型，其特征在于，所述恒山黄芪的根部农艺性状指标包括所述恒山黄芪的根长、根重、根粗值。3.根据权利要求1或2所述恒山黄芪的质量评价模型，其特征在于，所述恒山黄芪的有效成分包括毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素以及黄芪甲苷。4.根据权利要求1-3任一项所述恒山黄芪的质量评价模型，其特征在于，所述恒山黄芪中有效成分合成酶基因包括合成酮类成分关键酶基因和/或合成皂苷类成分关键酶基因；优选的，所述合成酮类成分关键酶基因包括：4cl基因、i3’h基因、chr基因、chi基因、ifs基因、pal基因、c4h基因、chs基因、iomt基因和/或ucgt基因；优选的，所述合成皂苷类成分关键酶基因包括：hmgs基因、hmgr1基因、hmgr2基因、hmgr3基因、mk基因、mvd基因、idi基因、pmk基因、fps基因、ss基因、se基因、cas基因和/或aact基因。5.一种恒山黄芪的质量评价方法，其特征在于，包括按照权利要求1-4任一项所述质量评价模型中的指标对所述恒山黄芪进行检测的步骤。6.根据权利要求5所述恒山黄芪的质量评价方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对所述恒山黄芪的农艺性状指标进行检测；(2)对所述恒山黄芪中的有效成分含量进行检测；(3)对所述恒山黄芪中有效成分合成酶基因的表达量进行检测；(4)分别对所述恒山黄芪的农艺性状指标、有效成分含量及有效成分合成酶基因的表达量进行相关性分析。7.根据权利要求6所述恒山黄芪的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述恒山黄芪中的有效成分含量检测的步骤采用hplc-uv/elsd法进行检测；优选的，所述hplc-uv/elsd检测步骤条件包括：色谱柱waters c
18 symmetry；柱温25
±
5℃；流速1.0ml/min；进样体积10μl；检测波长260nm；流动相为乙腈(a)-0.2％甲酸水(b)；洗脱采用二元梯度洗脱模式：0-5min，2.2％-2.3％a，5-10min，2.3％-2.4％a，10-14min，2.4％-9.0％a，14-23min，9.0％-12.0％a，23-30min，12.0％-19.3％a，30-38min，19.3％-24.3％a，38-45min，24.3％-28.8％a，45-47min，28.8％-29.2％a，47-55min，29.2％-29.3％a，55-56min，29.3％-30.0％a，56-57.5min，30.0％-34.0％a，57.5-58.5min，34.0％-40.0％a，58.5-66.5min，40.0％-40.0％a，66.5-70.0min，40.0％-60.0％a，70.0-75.0min，60.0％-60.0％a；蒸发光散射检测器参数：蒸发温度75℃，气体流量2.5ml/min，信号增益3，采样频率
20hz。8.根据权利要求6或7所述恒山黄芪的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用实时荧光定量pcr法对所述恒山黄芪中有效成分合成酶基因的表达量进行检测；优选的，不同目标基因选用的引物包括：pal-f：catcaaatctctctggcagtaggaa；pal-r：agttcacatcttggttatgctgctc；c4h-f：aacaaagtgagggatgaaattgaca；c4h-r：ggattgccattcttagccttagtgt；4cl-f：tgtccctcctattgttttggctatt；4cl-r：ctttggggaatttagctctgacagt；chs-f：ccttctttggatgctagacaagaca；chs-r：cgaagacccaagagtttggttagtt；chr-f：aaacaaggttacaggcattttgaca；chr-r：ggaagaacgagatgaggatgatttt；chi-f：atcgagtttttccaccaggatctac；chi-r：atcatagtctccaacacagcctcag；ifs-f：ccttcacctattggacaaacctctt；ifs-r：cctggtattaaaggaagaagcctca；iomt-f：tgagggaatggcaagtga；iomt-r：cccagcaagttagcgaca；i3’h-f：ggatgttaaagaagcgaagcaattt；i3’h-r：atcaaacaatctcaacaaaggcaaa；ucgt-f：gaactcgactctggaaagtgtgtgt；ucgt-r：ggtgcataaatcttcaaaacctcag；aact-f：ggtgagcggagagaaggcat；aact-r：cgagtgctggagcggttgta；hmgs-f：ccttcttcggcattgctttcatc；hmgs-r：tcgagatcccggctttggta；hmgr1-f：ccttcttcggcattgctttcatc；hmgr1-r：actccggcagtggtttcctg；hmgr2-f：gccggccaccataaacga；hmgr2-r：cgacggagaagaagagggtgaa；hmgr3-f：gccggccaccataaacga；hmgr3-r：ggtcggcaattttcgatggtag；mk-f：aacatgccgttgttcacgga；mk-r：aactccaatgccgcatcgtt；pmk-f：agatcacccggacaggaagga；pmk-r：ccgcacatagcgatgacttcc；mvd-f：taagggagatccgcgctcgt；mvd-r：cagctgacgaagccagtcca；idi-f：tgctggtgagggaggtttgaa；idi-r：tcatgtcagcgacctcaccaa；fps-f：cgaccggatgctggactaca；fps-r：ccaaccaagagcactggcaa；ss-f：aagcagatccctccggaacc；ss-r：acagcgttgcgaagttcggt；se-f：tggaacaaggaaccgtgacatct；se-r：acaaagagaacgcctcaagttgga；cas-f：tggagatttcccacagcagga；cas-r：caagttgcggcatttggtgt；18s rna-f：tgcagaatcccgtgaaccatc；18s rna-r：aggcatcgggcaacgatatg。9.根据权利要求6-8任一项所述恒山黄芪的质量评价方法，其特征在于，所述步骤(4)
中，所述恒山黄芪的农艺性状指标、有效成分含量及有效成分合成酶基因的表达量的相关性包括：所述恒山黄芪的根粗、根长、根重三者之间两两呈现正相关，且与黄酮类成分含量呈负相关，与皂苷类成分含量呈正相关；所述恒山黄芪的根越粗，根中黄酮类成分含量越低，皂苷类成分含量越高，根中4cl、i3’h、hmgr1、mk、mvd、idi基因的表达量越高。10.权利要求1-4任一项所述质量评价模型或权利要求5-9任一项所述质量评价方法在恒山黄芪的质量评价领域的应用。

技术总结
本发明属于原料药质量评价技术领域，具体涉及一种恒山黄芪的质量评价模型及质量评价方法。本发明所述恒山黄芪的质量评价模型及质量评价方法，通过对所述恒山黄芪根部的农艺性状及有效成分的含量、黄酮及皂苷类成分合成的关键酶基因表达量进行测定，通过相关分析以探索恒山黄芪植株根部性状、有效成分含量及合成黄酮、皂苷类成分关键酶基因表达量间的相关性，从而为恒山黄芪的定向育种提供一定的理论参考。参考。参考。


技术研发人员：柴智 樊慧杰 高建平 马存根
受保护的技术使用者：山西中医药大学
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/9