一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统

1.本发明属于双光子显微成像技术领域，尤其涉及一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统。


背景技术：

2.传统的双光子荧光显微成像系统使用高斯光束激发，在进行体积成像时需要进行z轴扫描而导致成像速度较慢，而贝塞尔光束具有独特的无衍射特性与自愈特性，无衍射性即在较长的传播距离内具有保持其横向光场分布的特性，自愈性即在传播过程遇到障碍物后，经过一段距离后可恢复其原有横向光场分布。因此，基于贝塞尔光束激发的双光子荧光显微成像具有长景深且受散射影响较小的特点，从而可以实现快速体积成像，对于稀疏标记的生物组织，可以达到传统高斯光束激发双光子显微成像几十倍的成像吞吐量，实现以二维帧速率进行体积成像。
3.然而，由于贝塞尔光束的中心光斑周围有一系列同心圆环即旁瓣，且能量占比高，会产生较强的背景从而降低成像的对比度。目前用于抑制贝塞尔光束旁瓣的方法主要有共焦线检测、高阶非线性效应、图像差分法以及光滴法等。贝塞尔光滴是利用两束不同na的同轴贝塞尔光束干涉形成驻波，从而达到抑制旁瓣的效果，从而解决贝塞尔光束激发的双光子荧光显微成像对比度低的问题。但是贝塞尔光滴在抑制旁瓣能量的同时会产生轴向光场分布明暗交替的现象，难以用于双光子荧光显微成像系统。


技术实现要素：

4.本发明提供一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，旨在解决目前双光子荧光显微成像系统无法解决采用贝塞尔光滴技术在抑制旁瓣能量的同时会产生轴向光场分布明暗交替的现象，影响双光子荧光显微成像系统观测结果的问题。
5.本发明是这样实现的，一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，应用于待测样品的显微成像，包括：
6.激发光源模块；激发光源模块利用偏振分束产生水平偏振态光束和垂直偏振态光束；
7.贝塞尔光滴调制模块，所述贝塞尔光滴调制模块将所述水平偏振态光束调制为由相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成的第一贝塞尔光滴；同时将所述垂直偏振态光束调制为由相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成的第二贝塞尔光滴；并将第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴合束后形成互补的贝塞尔光滴，产生第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴的傅里叶频谱并滤除其杂散光；
8.双光子显微成像模块，所述互补的贝塞尔光滴通过双光子显微成像模块聚焦至待测的样品实现点扫描，所述双光子显微成像模块收集样品经双光子激发后产生的后向散射荧光信号并将其转换为电压信号；
9.空间光调制器控制模块，所述空间光调制器控制模块与贝塞尔光滴调制模块电性
连接，计算并加载生成所述贝塞尔光滴调制模块上需要的相位图案；
10.信号采集/成像与同步控制模块，所述信号采集/成像与同步控制模块对中荧光信号输出与采集的同步控制，对得到的电压信号进行双光子强度图重构。
11.优选地，所述贝塞尔光滴调制模块包括：
12.第一空间光调制器和第二空间光调制器；所述水平偏振光经过第一空间光调制器产生第一贝塞尔光滴，所述垂直偏振态光经过第二空间光调制器产生第二贝塞尔光滴；
13.第二偏振分束器，不同偏振态的第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴经过第二偏振分束器合束得到轴向光场分布均匀的旁瓣受到抑制的贝塞尔光束，即互补的贝塞尔光滴；
14.第一傅里叶变换透镜及设于第一傅里叶变换透镜后焦面的第一掩模板；所述互补的贝塞尔光束经过第一傅里叶变换透镜得到傅里叶频谱并经过第一掩模板进行滤波；
15.第二光学4f系统，所述第二光学4f系统将经过滤波的傅里叶频谱传递到双光子显微成像模块。
16.优选地，所述双光子显微成像模块包括：xy点扫描装置、扫描透镜、套筒透镜、显微物镜、二向色镜、滤光片、聚焦透镜和光电倍增管，安放于xy点扫描装置下方的样品经过滤波的傅里叶频谱激发荧光信号并形成反向反射荧光信号，所述滤光片和聚焦透镜对反射的荧光信号进行滤波、聚焦，再由光电倍增管将感光面接收的荧光信号转化为电压信号输送至信号采集/成像与同步控制模块。
17.优选地，所述空间光调制器控制模块包括：用于计算并加载生成所述贝塞尔光滴调制模块中的空间光调制器上需要的相位图案的控制器，所述控制器与贝塞尔光滴调制模块电性连接。
18.优选地，所述水平偏振光经过第一空间光调制器产生第一贝塞尔光滴，第一空间光调制器加载的相位图案是空间光调制器控制模块通过计算得出两个同心圆环经过逆傅里叶变换得到的，以产生两束不同na的贝塞尔光束，干涉后形成旁瓣受到抑制的驻波，即所述的第一贝塞尔光滴，其轴向光场分布呈现明暗交替。
19.优选地，所述空间光调制器控制模块选取旁瓣抑制效果最佳时对应的内外径之比，在两个同心圆环之间引入相位差将其经过傅里叶逆变换得到相位差的相位图案加载到第一空间光调制器上以生成第一贝塞尔光滴。
20.优选地，所述垂直偏振光经过第二空间光调制器产生第二贝塞尔光滴，第二空间光调制器加载的相位图案是空间光调制器控制模块通过计算得出两个的同心圆环经过逆傅里叶变换得到的，以产生两束不同na的贝塞尔光束，干涉后形成旁瓣受到抑制的驻波，即所述的第二贝塞尔光滴，其轴向光场分布呈现明暗交替；
21.优选地，所述空间光调制器控制模块选取相同两个同心圆环之间引入相位差将其经过傅里叶逆变换得到相位差的相位图案加载到第二空间光调制器上以生成第二贝塞尔光滴。。
22.优选地，所述激发光源模块包括：超快激光器，用于产生超快激光；第一光学4f系统，用于进行准直与扩束；第一半波片，用于调节激光的线偏振方向；第一偏振分束器，用于将激光分束为水平偏振态光束和垂直偏振态光束。。
23.优选地，所述xy点扫描装置11为双检流式振镜组或共振式振镜搭配检流式振镜。
24.与现有技术相比，本技术实施例主要有以下有益效果：
25.本发明所提供的互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统通过贝塞尔光滴调制模块中的第一空间光调制器和第二空间光调制器生成两束不同na的同轴贝塞尔光束并同时引入不同的相位差，让相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成贝塞尔光滴与相位差的同轴双贝塞尔光束在轴向光场分布上产生偏移，以得到互补的贝塞尔光滴，用于激发双光子荧光显微成像系统，实现生物体组织快速、高对比度和高空间分辨率的体积成像。
附图说明
26.图1是本发明提供的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统的控制流程图。
27.图2是本发明提供的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统的结构示意图。
28.附图标记说明：
29.101、激发光源模块；1、超快激光器；2、第一光学4f系统；3、第一半波片；4、第一偏振分束器；
30.102、贝塞尔光滴调制模块；5、第一空间光调制器；6、第二空间光调制器；7、第二偏振分束器；8、第一傅里叶变换透镜；9、第一掩模板；10、第二光学4f系统；
31.103、双光子显微成像模块；11、xy点扫描装置；12、扫描透镜；13、套筒透镜；14、显微物镜；16、二向色镜；17、滤光片；18、聚焦透镜；19、光电倍增管；
32.104、空间光调制器控制模块；20、控制器；
33.105、信号采集/成像与同步控制模块；21、多功能采集卡与处理器；
34.15、样品。
具体实施方式
35.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术；本技术的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本技术的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。
36.在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本技术的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
37.本发明实施例提供了一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，如图1-图2所示，所述一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统包括：
38.激发光源模块101；激发光源模块101利用偏振分束产生水平偏振态光束和垂直偏振态光束；
39.贝塞尔光滴调制模块102；所述贝塞尔光滴调制模块102将所述水平偏振态光束调制为由相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成的第一贝塞尔光滴；同时将所述垂直偏振态光束调制为由相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成的第二贝塞尔光滴；并
将第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴合束生成轴向光场分布互补的贝塞尔光滴，产生第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴的傅里叶频谱并滤除其杂散光；
40.双光子显微成像模块103；所述互补的贝塞尔光滴通过双光子显微成像模块103聚焦至样品15实现点扫描，所述双光子显微成像模块103收集样品15经双光子激发后产生的后向散射荧光信号并将其转换为电压信号；
41.空间光调制器控制模块104；所述空间光调制器控制模块104与贝塞尔光滴调制模块102电性连接，计算并加载生成所述贝塞尔光滴调制102模块中的空间光调制器上加载的相位图案；
42.信号采集/成像与同步控制模块105；信号采集/成像与同步控制模块105对中荧光信号输出与采集的同步控制，对得到的电压信号进行双光子强度图重构；
43.在本实施例中，所述贝塞尔光滴调制模块102包括：
44.第一空间光调制器5和第二空间光调制器6；所述水平偏振光经过第一空间光调制器5产生第一贝塞尔光滴，所述垂直偏振态光经过第二空间光调制器6产生第二贝塞尔光滴；
45.第二偏振分束器7，不同偏振态的第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴经过第二偏振分束器7合束得到轴向光场分布均匀的旁瓣受到抑制的贝塞尔光束，即互补的贝塞尔光滴；
46.第一傅里叶变换透镜8及设于第一傅里叶变换透镜8后焦面的第一掩模板9；所述互补的贝塞尔光束经过第一傅里叶变换透镜8得到傅里叶频谱并经过第一掩模板9进行滤波；
47.第二光学4f系统10，所述第二光学4f系统10将经过滤波的傅里叶频谱传递到双光子显微成像模块103；
48.在本实施例中，所述第一空间光调制器5和第二空间光调制器6采用现有技术结构中纯相位型空间光调制器，所述空间光调制器控制模块104加载的灰度相位图像会根据不同的灰度级在液晶分子上施加不同的电压，从而改变液晶分子的折射率以改变光程，达到调制光场的目的。
49.所述双光子显微成像模块103包括：xy点扫描装置11、扫描透镜12、套筒透镜13、显微物镜14、二向色镜16、滤光片17、聚焦透镜18和光电倍增管19，安放于xy点扫描装置11下方的样品15经过滤波的傅里叶频谱激发荧光信号并形成反向反射荧光信号，所述滤光片17和聚焦透镜18对反射的荧光信号进行滤波、聚焦，再由光电倍增管19将感光面接收的荧光信号转化为电压信号输送至信号采集/成像与同步控制模块105；双光子显微成像模块103采用现有技术手段；
50.所述空间光调制器控制模块104包括：控制器20，用于计算并加载生成所述贝塞尔光滴调制102模块中的空间光调制器上需要加载的相位图案；
51.所述信号采集/成像与同步控制模块105包括多功能采集卡与处理器21；所述多功能采集卡与处理器21控制载物台运动控制及所述双光子显微成像模块中物镜14的运动，并通过控制双光子显微成像模块103中的x和y扫描振镜11，多功能采集卡与处理器21对于双光子显微成像模块103中光电倍增管19荧光信号的采集与转换，同时实现上述信号输出与采集的同步控制；将光电倍增管19转换得到的电压信号进行双光子强度图重构；多功能采
集卡与处理器21采用的现有技术手段进行信号采集与输出；
52.作为本实施例中一种优选的实施方式，所述水平偏振光经过第一空间光调制器5产生第一贝塞尔光滴，第一空间光调制器5加载的相位图案是空间光调制器控制模块104通过计算得出相位差为的两个同心圆环经过逆傅里叶变换得到的，以产生两束不同na的贝塞尔光束，干涉后形成旁瓣受到抑制的驻波，即所述的第一贝塞尔光滴，其轴向光场分布呈现明暗交替；所述垂直偏振光经过第二空间光调制器6产生第二贝塞尔光滴，第二空间光调制器6加载的相位图案是空间光调制器控制模块104通过计算得出相位差为的两个同心圆环经过逆傅里叶变换得到的，以产生两束不同na的贝塞尔光束，干涉后形成旁瓣受到抑制的驻波，即所述的第二贝塞尔光滴，其轴向光场分布呈现明暗交替；
53.贝塞尔光束的特性与其傅里叶频谱即圆环的半径r紧密相关，其中心光斑半径可表示为：
[0054][0055]
贝塞尔光束的无衍射距离可表示为：
[0056][0057]
贝塞尔光束的有效数值孔径可表示为：
[0058][0059]
其中，λ为激光波长，f1为傅里叶变换透镜的焦距，w为入射到空间光调制器上的光束半径，f
ob
为物镜有效焦距。
[0060]
贝塞尔光滴的特性与傅里叶频谱即同心圆环的内径与外径之比r2/r1紧密相关，r2/r1的值在0和1之间，当r2/r1＝1时，表现为标准的贝塞尔光束，即无旁瓣抑制效果；内外径之比r2/r1取决于对应的贝塞尔光滴旁瓣能量占比；
[0061]
空间光调制器控制模块104选取旁瓣抑制效果最佳时对应的内外径之比，所述r2/r1＝0.6，在两个同心圆环之间引入相位差将其经过傅里叶逆变换得到相位差的相位图案加载到第一空间光调制器5上以生成第一贝塞尔光滴；在相同的两个同心圆环之间引入相位差将其经过傅里叶逆变换得到相位差的相位图案加载到第二空间光调制器6上以生成第二贝塞尔光滴；
[0062]
作为本实施例中一种优选的实施方式，激发光源模块101包括：超快激光器1，用于产生超快激光；第一光学4f系统2，用于进行准直与扩束；第一半波片3，用于调节激光的线偏振方向；第一偏振分束器4，用于将激光分束为水平偏振态光束和垂直偏振态光束；
[0063]
在本实施例中，所述的超快激光器1可以为皮秒激光器或飞秒激光器，其本质为输出具有极高的瞬时功率的超短脉冲激光；
[0064]
作为本实施例中一种优选的实施方式，xy点扫描装置11可为双检流式振镜组或共振式振镜搭配检流式振镜；扫描透镜12与套筒透镜13，用于扩大激光光束使其充满物镜14入瞳面，并在样品15平面产生整个视场内固定尺寸的光斑；显微物镜14，用于使激发光束聚
焦；二向色镜16，用于透射激发光与反射反向散射荧光信号；滤光片17，用于进一步滤除掉荧光信号外的其他杂散光；聚焦透镜18，用于将发散的荧光信号聚焦到光电倍增管19的感光面；光电倍增管19，用于将感光面接收的荧光信号转化为电压信号；
[0065]
需要说明的是，对于前述的各实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可能采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，涉及的动作和模块并不一定是本发明所必须的。
[0066]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对发明的保护范围进行限制。显然，所描述的实施例仅仅是本发明部分实施例，而不是全部实施例。基于这些实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明所要保护的范围。尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域普通技术人员依然可以在不冲突的情况下，不作出创造性劳动对本发明各实施例中的特征根据情况相互组合、增删或作其他调整，从而得到不同的、本质未脱离本发明的构思的其他技术方案，这些技术方案也同样属于本发明所要保护的范围。

技术特征：
1.一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，包括：激发光源模块；激发光源模块利用偏振分束产生水平偏振态光束和垂直偏振态光束；贝塞尔光滴调制模块，所述贝塞尔光滴调制模块将所述水平偏振态光束调制为由相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成的第一贝塞尔光滴；同时将所述垂直偏振态光束调制为由相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成的第二贝塞尔光滴；并将第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴合束后形成互补的贝塞尔光滴，产生第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴的傅里叶频谱并滤除其杂散光；双光子显微成像模块，所述互补的贝塞尔光滴通过双光子显微成像模块聚焦至待测的样品实现点扫描，所述双光子显微成像模块收集样品经双光子激发后产生的后向散射荧光信号并将其转换为电压信号；空间光调制器控制模块，所述空间光调制器控制模块与贝塞尔光滴调制模块电性连接，计算并加载生成所述贝塞尔光滴调制模块上需要的相位图案；信号采集/成像与同步控制模块，所述信号采集/成像与同步控制模块对中荧光信号输出与采集的同步控制，对得到的电压信号进行双光子强度图重构。2.如权利要求1所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述贝塞尔光滴调制模块包括：第一空间光调制器和第二空间光调制器；所述水平偏振光经过第一空间光调制器产生第一贝塞尔光滴，所述垂直偏振态光经过第二空间光调制器产生第二贝塞尔光滴；第二偏振分束器，不同偏振态的第一贝塞尔光滴和第二贝塞尔光滴经过第二偏振分束器合束得到轴向光场分布均匀的旁瓣受到抑制的贝塞尔光束，即互补的贝塞尔光滴；第一傅里叶变换透镜及设于第一傅里叶变换透镜后焦面的第一掩模板；所述互补的贝塞尔光束经过第一傅里叶变换透镜得到傅里叶频谱并经过第一掩模板进行滤波；第二光学4f系统，所述第二光学4f系统将经过滤波的傅里叶频谱传递到双光子显微成像模块。3.如权利要求2所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述双光子显微成像模块包括：xy点扫描装置、扫描透镜、套筒透镜、显微物镜、二向色镜、滤光片、聚焦透镜和光电倍增管，安放于xy点扫描装置下方的样品经过滤波的傅里叶频谱激发荧光信号并形成反向反射荧光信号，所述滤光片和聚焦透镜对反射的荧光信号进行滤波、聚焦，再由光电倍增管将感光面接收的荧光信号转化为电压信号输送至信号采集/成像与同步控制模块。4.如权利要求3所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述空间光调制器控制模块包括：用于计算并加载生成所述贝塞尔光滴调制模块中的空间光调制器上需要的相位图案的控制器，所述控制器与贝塞尔光滴调制模块电性连接。5.如权利要求4所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述水平偏振光经过第一空间光调制器产生第一贝塞尔光滴，第一空间光调制器加载的相位图案是空间光调制器控制模块通过计算得出两个同心圆环经过逆傅里叶变换得到的，以产生两束不同na的贝塞尔光束，干涉后形成旁瓣受到抑制的驻波，即所述的第一贝塞尔光滴，其轴向光场分布呈现明暗交替。
6.如权利要求5所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述空间光调制器控制模块选取旁瓣抑制效果最佳时对应的内外径之比，在两个同心圆环之间引入相位差将其经过傅里叶逆变换得到相位差的相位图案加载到第一空间光调制器上以生成第一贝塞尔光滴。7.如权利要求6所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述垂直偏振光经过第二空间光调制器产生第二贝塞尔光滴，第二空间光调制器加载的相位图案是空间光调制器控制模块通过计算得出两个同心圆环经过逆傅里叶变换得到的，以产生两束不同na的贝塞尔光束，干涉后形成旁瓣受到抑制的驻波，即所述的第二贝塞尔光滴，其轴向光场分布呈现明暗交替。8.如权利要求7所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述空间光调制器控制模块选取相同两个同心圆环之间引入相位差将其经过傅里叶逆变换得到相位差的相位图案加载到第二空间光调制器上以生成第二贝塞尔光滴。9.如权利要求8所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述激发光源模块包括：超快激光器，用于产生超快激光；第一光学4f系统，用于进行准直与扩束；第一半波片，用于调节激光的线偏振方向；第一偏振分束器，用于将激光分束为水平偏振态光束和垂直偏振态光束。10.如权利要求9所述的一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，其特征在于，所述xy点扫描装置11为双检流式振镜组或共振式振镜搭配检流式振镜。

技术总结
本发明公开了一种互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统，包括：激发光源模块、贝塞尔光滴调制模块、双光子显微成像模块、空间光调制器控制模块以及信号采集/成像与同步控制模块；本发明所提供的互补贝塞尔光滴双光子显微成像系统通过贝塞尔光滴调制模块中第一空间光调制器和第二空间光调制器生成两束不同NA的同轴贝塞尔光束并同时引入不同的相位差，让相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成贝塞尔光滴与相位差的同轴双贝塞尔光束干涉形成的贝塞尔光滴在轴向光场分布上产生偏移，以得到互补的贝塞尔光滴，用于激发双光子荧光显微成像系统，实现生物体组织快速、高对比度和高空间分辨率的体积成像。高对比度和高空间分辨率的体积成像。高对比度和高空间分辨率的体积成像。


技术研发人员：刘丽炜 陈永强 李艳萍 屈军乐
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/8/9