月季RcPP2C24基因及其在调控植物耐旱性中的应用

月季rcpp2c24基因及其在调控植物耐旱性中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种月季rcpp2c24基因及其在调控植物耐旱性中的应用。


背景技术：

2.干旱是限制植物生长和生产力的主要环境因素，也是影响全球植物生长发育的最具破坏性的非生物胁迫之一。干旱通过影响植物光合作用、物质代谢、细胞膜损伤和激素积累从而限制植物生长，导致植物幼苗瘦弱、生长缓慢、成活率降低(张俊杰等，2023；董蕾和李吉跃，2013；杨倩等，2017；陈兰等，2022)。植物成苗时期受到严重干旱胁迫会使叶片凋零、落花落果，产量降低甚至死亡。因此，如何缓解干旱胁迫对植物带来的损伤以及提高植物的耐旱性已成为国内外学者的研究热点。
3.在生产上，缓解干旱胁迫的技术主要有物理途径、化学途径和生物学途径等3个方面(方紫雯，2021；张帆等，2022)。物理途径方面，通过升高co2浓度、增加空气湿度、适当添加紫外光和干旱锻炼等方法提高植物耐旱性(崔景会等，2022；崔寿广，2021；王海燕等，2015)；化学途径包含外施细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、褪黑素、阿魏酸、黄腐酸和甜菜碱等有机物质和外源钙和硅等无机物质提高植物耐旱性(李彩龙等，2022；蒋倩等，2022；方紫雯，2022；王永吉等，2022；刘卫星等，2022；何静等，2022)。生物学途径主要包含基因组修饰和转基因技术，它们已被用于培育过表达或敲除对植物生理至关重要的转基因的耐旱植物(mahmood et al.，2019)。
4.干旱引起的渗透胁迫会导致植物体内脱落酸(aba)的积累，它在植物的胁迫反应和耐性中起着举足轻重的作用(kazuo and kazuko，2013)。蛋白磷酸酶2c(pp2cs)是aba信号通路的核心组成部分之一，已有研究表明pp2c参与植物非生物胁迫响应，其在拟南芥、玉米、小麦和水稻等植物干旱胁迫中起着负调控的作用，将关键pp2c敲除后会增强植株的耐旱能力(he et al.，2021；baek et al.，2018；he et al.，2019；yu et al.，2022；kim et al.，2022)。综上，利用基因编辑技术改良植物耐旱性成为了行之有效的方法之一。然而高效的耐旱基因的分离成为限制基因工程在抗逆改良中应用的因素之一。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种月季rcpp2c24基因及其在调控植物耐旱性中的应用；本发明首先将rcpp2c24基因的核苷酸编码序列的克隆；表达载体的构建，然后将rcpp2c24基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后转入植物体(宿主烟草)内，得到rcpp2c24超量表达植株；沉默载体的构建，将rcpp2c24基因的部分片段整合到ptrv2沉默载体后瞬时转化月季花瓣，得到rcpp2c24基因沉默花瓣；对转基因烟草和基因沉默月季花瓣进行分子鉴定和表型观察，以评估该基因在调节植物耐旱性中的应用前景。
6.转基因烟草在干旱条件下耐旱性降低，而该基因沉默的月季花瓣耐脱水胁迫能力
提升。本发明为今后通过基因编辑技术沉默该基因增强植物耐旱性，缓解干旱对植物的伤害具有重要的参考意义。
7.为实现上述目的，本发明所设计一种月季rcpp2c24基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了一种上述基因编码的蛋白rcpp2c24，其氨基酸序列为seq id no.2所示。
9.本发明还提供了一种用于获得上述rcpp2c24基因的引物对，所述引物对为：
10.rcpp2c24正向引物：5
’‑
cgcggatccatggcggagatttgttacgg-3’，
11.rcpp2c24反向引物：
[0012]5’‑
gctctagactacgtgttgctcttaagattgacc-3’。
[0013]
获得上述rcpp2c24基因的方法如下：
[0014]
以月季
‘
月月粉’叶片cdna为模板和上述rcpp2c24基因的引物对，进行pcr扩增，纯化得到rcpp2c24基因；其中，pcr体系：
[0015][0016]
pcr的条件：
[0017][0018]
本发明还提供了一种用于获得上述rcpp2c24基因的沉默载体构建引物对，所述引物对为：
[0019]
rcpp2c24s正向引物：5
’‑
gctctagaatggcggagatttgttacgg-3’，
[0020]
rcpp2c24s反向引物：
[0021]5’‑
cggggtacccgtagtagtgaagattgttggcagtt-3’。
[0022]
获得rcpp2c24基因沉默区域片段的方法如下：
[0023]
以上述获得rcpp2c24基因片段为模板和上述rcpp2c24s基因的引物对，进行pcr扩增，纯化得到rcpp2c24s基因沉默区域片段；其pcr扩增方法和体系同上述方法和体系。
[0024]
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述rcpp2c24基因的植物表达载体，其中，所述植物表达载体为pcambia2300s。
[0025]
上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：
[0026]
将目的片段导入克隆载体18t中，然后进行将含目的基因的克隆载体rcpp2c2418t和pcambia2300s用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切进行酶切，再将得到的目的片段连接到酶切过的pcambia2300s载体上即得到重组表达载体pcambia2300s-rcpp2c24。
[0027]
本发明还提供了一种重组沉默载体，所述重组沉默载体含有上述rcpp2c24基因的植物沉默载体，其中，所述植物表达载体为ptrv2。
[0028]
上述重组沉默载体的构建方法，包括以下步骤：
[0029]
将基因沉默片段导入克隆载体18t中，然后进行将含基因沉默片段的克隆载体rcpp2c24s18t和ptrv2用xbaⅰ和kpnⅰ双酶切进行酶切，再将得到的目的片段连接到酶切过的ptrv2载体上即得到重组沉默载体ptrv2-rcpp2c24s。
[0030]
本发明还提供了一种含有上述的重组表达载体或者上述的重组沉默载体的宿主细胞，所述宿主细胞为农杆菌gv3101。
[0031]
下述各项之一在调控植物耐旱性中的应用，它包括：
[0032]
(1)上述的rcpp2c24基因；
[0033]
(2)上述的重组表达载体和上述的重组沉默载体；
[0034]
(3)上述的宿主细胞。
[0035]
作为优选方案，所述植物为烟草或月季。
[0036]
下述各项之一在培育耐旱性的新植物品种中的应用，它包括：
[0037]
(1)上述的rcpp2c24基因；
[0038]
(2)上述的重组表达载体和上述的重组沉默载体；
[0039]
(3)上述的宿主细胞。
[0040]
本发明的有益效果：
[0041]
本发明基因命名为rcpp2c24。通过构建超量表达载体pcambia2300s-rcpp2c24导入到烟草中，得到转基因烟草。转基因烟草相较于对照烟草耐旱性降低。通过构建沉默载体ptrv2-rcpp2c24s导入到月季花瓣中，得到月季基因沉默花瓣相较于对照花瓣耐脱水胁迫能力提高。rcpp2c24基因为我们通过植物基因工程的手段调控植物的耐旱能力提供了分子生物学基础。该基因的应用将有助于增强植株的抗旱性，提高作物产量，改善植物品质，培育性状优良新品种。
[0042]
综上所述：本发明可以通过基因编辑技术增强植物的耐旱性，减轻植物的受伤害程度，提高植物的品质和观赏性。
附图说明
[0043]
图1为原始植物超量表达载体pcambia2300s结构示意图(载体大小为11630bp)；
[0044]
图2为原始植物沉默载体ptrv2结构示意图(载体大小为9663bp)；
[0045]
图3为月季
‘
月月粉’失水胁迫处理后不同组织中rcpp2c24基因表达情况图；
[0046]
图中：a为
‘
月月粉’失水迫处理后叶片中rcpp2c24基因表达情况图；
[0047]
b为
‘
月月粉’失水迫处理后根中rcpp2c24基因表达情况图。
[0048]
图4为野生型烟草和本发明rcpp2c24转基因烟草耐旱性分析图；
[0049]
图中：a为野生型和rcpp2c24转基因烟草干旱处理前后表型图；
[0050]
b为野生型和rcpp2c24转基因烟草中目的基因表达检测结果图；
[0051]
c为野生型和rcpp2c24转基因烟草干旱处理前后叶片含水量检测图；
[0052]
d为野生型和rcpp2c24转基因烟草干旱处理前后相对电导率检测图；
[0053]
e为野生型和rcpp2c24转基因烟草干旱处理前后叶片中mda含量检测图。
[0054]
图5为月季瞬时沉默rcpp2c24花瓣耐脱水胁迫能力检测图；
[0055]
图中：a为月季花瓣瞬时沉默rcpp2c24基因表型分析图；
[0056]
b为月季对照和rcpp2c24沉默花瓣中目的基因检测结果图；
[0057]
c为月季对照和rcpp2c24沉默花瓣脱水胁迫处理后花瓣圆盘的相对有效面积图；
[0058]
图6为表达载体pcambia2300s-rcpp2c24构建图(插入片段大小为1203bp)。
[0059]
图7为沉默载体ptrv2-rcpp2c24s构建图(插入片段大小为436bp)。
具体实施方式
[0060]
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
[0061]
实施例1：分离rcpp2c24基因
[0062]
从月季
‘
月月粉’中分离获得rcpp2c24基因，其序列如seq idno.1所示，以月季
‘
月月粉’叶片cdna为模板扩增所需片段，其具体步骤如下：
[0063]
根据seq id no.1所示rcpp2c24序列设计rcpp2c24基因的引物对：
[0064]
rcpp2c24正向引物：5
’‑
cgcggatccatggcggagatttgttacgg-3’，
[0065]
rcpp2c24反向引物：
[0066]5’‑
gctctagactacgtgttgctcttaagattgacc-3’。
[0067]
并以月季
‘
月月粉’叶片提取的rna反转录后的cdna为模板和上述rcpp2c24基因的引物对进行pcr，
[0068]
pcr体系：
[0069]
10
×
buffer2μl10mm dntp0.4μl正向引物1μl反向引物1μltaq dna polymerase0.2μl模板1μlddh2o14.4μl合计20μl
[0070]
pcr的条件：
[0071][0072]
纯化得到扩增产物，即rcpp2c24基因；
[0073]
将扩增获得的rcpp2c24基因连入18-t载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因；将该克隆被命名为18-rcpp2c24质粒。
[0074]
实施例2：月季
‘
月月粉’失水胁迫处理后rcpp2c24基因表达情况检测
[0075]
参考huang等(2011)空气干旱处理的方法，将15株移栽下地生长一个月的
‘
月月粉’健壮植株从土中移出并洗净根部，置于放有清水的锥形瓶中培养1天后，再取出植株用滤纸吸干水分并置于干净滤纸上，脱水处理0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h。在处理时间点分别采集植株中上部嫩叶和根部组织。月季总rna提取方法采用ctab方法，提取失水胁迫处理后不同时间点的样品rna。使用takara反转录试剂盒进行反转录，具体步骤参见操作手册(rr047a，takara)。利用qrt-pcr方法检测rcpp2c24基因的表达情况。采用takara荧光定量pcr试剂盒(rr430a，takara)进行qrt-pcr反应，所使用仪器型号为abi quantstudio 3(applied biosystems，ca，usa)。每个样本进行三次技术重复，使用2
‑△△
ct
法计算相对表达量，并利用spss软件对原始数据进行统计分析。
[0076]
qrt-pcr反应的特异性引物序列为：
[0077]
qrcpp2c24-f：5
’‑
aagagaagggtaatctggtcaaa-3’；
[0078]
qrcpp2c24-r：5
’‑
tccgaacttggcgtcagg-3’。
[0079]
选用rcgapdh基因作为内参基因，引物序列为：
[0080]
qgapdh-f：5
’‑
tgaagggtggtgccaagaa-3’；
[0081]
qgapdh-r：5
’‑
aaggggagcaagacagttgg-3’。
[0082]
实时荧光定量检测发现，月季叶片中rcpp2c24基因的表达水平虽然随着失水胁迫处理时间的增加出现升高和降低的波动，但是在失水胁迫处理2h后，该基因表达水平相较于初始0h整体呈升高趋势，在处理10h时该基因表达水平相较于初始0h升高17倍(图3a)；根中rcpp2c24基因的表达水平呈先升高再降低的趋势，其整体表达水平也是相较于未处理时间点均显著性升高，在处理6h时该基因表达水平相较于初始0h升高20倍(图3b)。综上表明，rcpp2c24基因受失水胁迫诱导表达，可能参与植物的失水胁迫响应过程。
[0083]
实施例3：rcpp2c24基因超量表达载体的构建，转化
[0084]
为了阐明该基因的功能，将该克隆的基因片段在烟草中超量表达，从转基因烟草表型观测和生理指标测定来验证其功能。具体步骤是：
[0085]
首先将实施例1中得到的阳性克隆18-rcpp2c24质粒用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切回收目的片段；同时，用同样的方法酶切超量表达载体pcambia2300s(图1)。酶切完毕，用包含rcpp2c24基因的酶切片段和酶切的pcambia2300s(图1)载体做连接反应，转化大肠杆菌dh5α(大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司)。通过pcr扩增筛选阳性克隆，获得转化载体，将其命名为pcambia2300s-rcpp2c24(图6)。
[0086]
通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法，将pcambia2300s-rcpp2c24导入到野生型烟草中，经过侵染、共培养、筛选得到具有抗性的转化苗，再通过生根、练苗、移栽等常规步骤，得到转基因植株。
[0087]
上述遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：
[0088]
1)试剂和溶液缩写
[0089]
培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤)；naa(naphthalene acetic acid，萘乙酸)；kan(kanamycin，卡那霉素)；cef(cefotaxime，头孢霉素)。
[0090]
2)用于烟草遗传转化的培养基配方
[0091]
表1列出了的烟草遗传转化的培养基的成分及其用量。
[0092]
表1转基因烟草的相关培养基设计
[0093][0094]
农杆菌侵染烟草组织及抗性苗获得：
[0095]
a.剪取野生型烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成1cm
×
1cm大小小块，放入无菌烧杯中；
[0096]
b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡8min；
[0097]
c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如表1所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃；
[0098]
d.三天后，将叶片转入如表1所述的出芽选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行抗性芽的筛选分化，培养温度为28℃；
[0099]
e.抗性芽形成后，将其切下，转入如表1所述的壮苗选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行抗性苗的筛选，培养温度为28℃；
[0100]
f.将筛选得到的抗性苗转入表1所述的生根选择培养基上使其生根，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx,光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，培养温度为28℃。
[0101]
实施例4：rcpp2c24基因沉默载体的构建，转化
[0102]
为了进一步解析该基因的功能，利用vigs技术在月季花瓣中对rcpp2c24基因进行沉默，利用花瓣圆盘的膨胀面积来确定该基因在月季花瓣脱水中的潜在作用。具体步骤是：
[0103]
1)沉默载体构建：
[0104]
首先以实施案例1中获得的rcpp2c24基因cds全长片段为模板，利用基因沉默片段rcpp2c24s引物对进行pcr扩增所需基因沉默片段。
[0105]
rcpp2c24s正向引物：5
’‑
gctctagaatggcggagatttgttacgg-3’,
[0106]
rcpp2c24s反向引物：
[0107]5’‑
cggggtacccgtagtagtgaagattgttggcagtt-3’；
[0108]
其中pcr扩增体系和扩增条件同上述实施例1中rcpp2c24基因cds全长片段的扩增体系和条件。
[0109]
将rcpp2c24基因沉默片段rcpp2c24s导入克隆载体18t中，然后进行将含rcpp2c24基因沉默片段rcpp2c24s的克隆载体rcpp2c24s18t和ptrv2(图2)同时用xbaⅰ和kpnⅰ进行双酶切。酶切完毕，将得到的rcpp2c24基因沉默片段rcpp2c24s和酶切过的ptrv2载体做连接反应，转化大肠杆菌dh5α。通过pcr检测阳性克隆，获得转化载体，将其命名为ptrv2-rcpp2c24s(图7)。
[0110]
2)月季花瓣瞬时转化：
[0111]
通过农杆菌介导的月季花瓣瞬时遗传转化方法，将ptrv2-rcpp2c24s导入到月季花瓣中，经过侵染、共培养，得到rcpp2c24基因沉默的月季花瓣。
[0112]
上述月季花瓣瞬时转化的主要步骤如下所述：
[0113]
分别将含ptrv1、ptrv2和ptrv2-rcpp2c24s质粒的农杆菌培养至od
600
值在1.8以上。然后室温5000rpm离心20min集菌，用重悬液(10mm mgcl2、200mm乙酰丁香酮和10mm mes，ph5.6)重悬菌体，使其最终od
600
为0.9左右。然后按照ptrv1+ptrv2、ptrv1+ptrv2-rcpp2c24s组合方式将两种菌液混合后室温黑暗条件下放置4小时。
[0114]
收集月季花苞半开期的中间部位花瓣，在花瓣背面主花脉的底部或中部轻轻划出伤口并用1ml注射器缓慢注入相应菌液混合物，注射完的花瓣置于蒸馏水中，并放入8℃冰箱中黑暗条件下培养3天，3天后取出并用打孔器从花瓣中心切出直径1cm的圆盘。将花瓣圆盘重新放到蒸馏水中保存并置于23℃培养箱中培养1天。
[0115]
实施例5：转基因烟草rcpp2c24耐旱性检测
[0116]
将6周苗龄的对照和转基因烟草进行土壤干旱处理。处理前浇透水，待苗子吸饱水的第二天更换托盘，干旱处理15天后观察表型并进行处理前后的生理指标测定，然后复水1天后并拍照记录植株状态(图4a和4b)。相对含水量(relative water content，rwc)的测定参考sairam等(2002)的饱和称量法(图4c)；细胞膜透性(cell membrane permeability，cmp)的测定采用电导率法(图4d)；丙二醛(malondialdehyde，mda)含量的测定采用硫代巴比妥酸tba比色法(图4e)；其中，叶片相对电导率和mda含量测定方法参考李合生(2000)的《植物生理生化实验原理和技术》。对烟草进行干旱处理，结果发现转基因烟草相较于对照烟草，叶片相对含水量降低，相对电导率升高，mda含量升高，表明转基因烟草耐旱能力降低，受伤害程度增大，即超量表达该基因使转基因植株对干旱胁迫耐受性变差。
[0117]
实施例6：瞬时沉默月季花瓣rcpp2c24的耐失水胁迫能力检测
[0118]
将上述实施例4中获得的rcpp2c24基因沉默的月季花瓣圆盘置于滤纸上，脱水处理12h，然后浸没到蒸馏水中，并在24h复水期间间隔拍照并统计花瓣圆盘相对有效面积(图5a-c)。结果发现rcpp2c24基因沉默的月季花瓣圆盘在复水6h和12h的时候明显比对照更为舒展，花瓣圆盘有效面积显著高于对照。表明沉默rcpp2c24基因后，提高了月季花瓣的脱水耐受性，即该基因可能负调控月季花瓣的脱水耐受性。
[0119]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种月季rcpp2c24基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种权利要求1所述基因编码的蛋白rcpp2c24，其氨基酸序列为seq id no.2所示。3.一种用于获得权利要求1所述rcpp2c24基因的引物对，其特征在于：所述引物对为：rcpp2c24正向引物：5
’‑
cgcggatccatggcggagatttgttacgg-3’，rcpp2c24反向引物：5
’‑
gctctagactacgtgttgctcttaagattgacc-3’。4.一种用于获得权利要求1所述rcpp2c24基因的沉默载体构建引物对，其特征在于：所述引物对为：rcpp2c24s正向引物：5
’‑
gctctagaatggcggagatttgttacgg-3’，rcpp2c24s反向引物：5
’‑
cggggtacccgtagtagtgaagattgttggcagtt-3’。5.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体含有权利要求1所述rcpp2c24基因的植物表达载体，其中，所述植物表达载体为pcambia2300s。6.一种重组沉默载体，其特征在于：所述重组沉默载体含有权利要求1所述rcpp2c24基因的植物沉默载体，其中，所述植物表达载体为ptrv2。7.一种含有权利要求5所述的重组表达载体或者权利要求6所述重组沉默载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为农杆菌gv3101。8.下述各项之一在调控植物耐旱性中的应用，其特征在于：它包括：(1)权利要求1所述的rcpp2c24基因；(2)权利要求5所述的重组表达载体和权利要求5所述的重组沉默载体；(3)权利要求7所述的宿主细胞。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草或月季。10.下述各项之一在培育耐旱性的新植物品种中的应用，其特征在于：它包括：(1)权利要求1所述的rcpp2c24基因；(2)权利要求5所述的重组表达载体和权利要求5所述的重组沉默载体；(3)权利要求7所述的宿主细胞。

技术总结
本发明公开一种月季RcPP2C24基因及其在调控植物耐旱性中的应用；所述月季


技术研发人员：申玉晓 石力匀 邹金玉 李永华 王政 尚文倩 何松林 娄雪源 代挽玉 赵宗胜
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/8/9