一种快速鉴定葡萄病毒感染导致砧穗嫁接不亲和的方法

1.本发明属于葡萄嫁接技术领域，尤其针对葡萄病毒感染导致砧穗嫁接不亲和的快速评价方法。


背景技术：

2.葡萄是遭受病毒病害最严重的果树作物之一，目前已鉴定超过70种葡萄病毒，其中葡萄卷叶病毒(glrav-1和glrav-3)和葡萄属病毒(gva)是传播蔓延最广泛的两类病毒，在世界葡萄主产区均流行感染，且二者通常是复合感染，加剧了病害的症状。葡萄病毒感染降低植株营养生长量、生长活力和寿命，抑制光合作用，延迟果实成熟，并最终导致果实产量下降和质量降低。
3.病毒感染除了影响葡萄植株的营养生长、果实的产量和品质外，病毒感染还导致砧穗嫁接不亲和，其不亲和程度与砧木的选择有关，从症状轻微到植株死亡，不亲和严重的砧穗组合定植后5年内死亡率高达90％。病毒感染导致的嫁接不亲和在不同的砧穗组合和生长环境中其症状表现程度不一致。当接穗嫁接到对病毒敏感的砧木后，植株定植后3个月致死，1年内死亡率可达90％；当接穗嫁接到对病毒不敏感的砧木后，植株死亡率降低，最迟定植5年内植株死亡，死亡率最低为20％左右。因此，在不同的生长环境及使用不同的砧木，病毒感染导致的嫁接植株死亡率在20％-90％，死亡时间从定植3个月-5年内。病毒感染导致的嫁接植株陆续死亡给果园管理造成极大不便，因此，尽早筛选出病毒感染导致的嫁接不亲和的植株有利于果园提早补苗，方便后期统一管理，减少病毒感染造成的经济损失。
4.在先前的嫁接研究中，通过绿枝嫁接的方式感染病毒的接穗嫁接到无毒砧木，在温室环境内约3-6个月嫁接植株表现病毒症状，但嫁接植株一般致死需要更久的时间；而利用硬枝嫁接的方式，感染glrav-1和gva的接穗嫁接到不同类型的砧木上，定植于田间后，嫁接植株在1-3年内陆续死亡，嫁接到freedom砧木上最高死亡率92％，嫁接到砧木st.george上死亡率仅为22％。使用传统的绿枝嫁接和硬枝嫁接无法快速的筛选出受病毒感染影响导致的嫁接不亲和植株，且由于绿枝嫁接和硬枝嫁接需要的周期长、占据空间大，间接增加了检测成本，损害了生产效益。因此，生产上目前亟需一种能够快速检测葡萄病毒感染导致到砧穗嫁接不亲和的嫁接技术，使得嫁接不亲和的植株尽早筛选出来，降低后期的管理成本，增加生产收益。
5.通过上述分析，现有嫁接技术对筛选葡萄病毒感染导致的砧穗嫁接不亲和存在的问题及缺陷为：
6.(1)检测周期过长。无论是绿枝嫁接还是硬枝嫁接针对不同的砧穗组合其筛选周期从3-6个月到3-5年不等。过长的检测周期严重影响了果园后期的统一化管理。
7.(2)检测成本高。绿枝嫁接和硬枝条需要在温室操作，嫁接后需要在雾室进行萌芽、生根等复活步骤，植株成活后需要在温室或者苗圃内栽植，并需要配备相关设备及人员进行管理。全程操作占用大量人力、设备、土地等资源，提高检测成本，损害生产效益。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速鉴定葡萄病毒感染导致砧穗嫁接不亲和的方法。
9.本发明是这样实现的，利用试管嫁接的技术，将感染病毒的组培苗作为接穗，嫁接到不同品种砧木组培苗。嫁接4周后，通过对嫁接植株的营养生长、嫁接部位的愈合程度、嫁接植株的病毒含量等3方面生长指标进行综合评价，判断嫁接植株是否存在病毒感染导致的砧穗不亲和。
10.在本发明的前期试验中，选用
‘
品丽珠’作为接穗，其中包括健康的
‘
品丽珠’、感染葡萄卷叶病毒-1(glrav-1)的
‘
品丽珠’和感染葡萄属病毒a(gva)的
‘
品丽珠’，砧木选取国内外常用4种砧木作为对照，其中freedom和101-14对病毒敏感，st.george和axr1对病毒抗性较好。试验过程中采用3种嫁接方法，包括试管嫁接、绿枝嫁接和硬枝嫁接，其中试管嫁接本试验的重点研究对象，绿枝嫁接和硬枝嫁接是作对照。因此，每一种嫁接方法共有3(接穗)x 4(砧木)＝12个嫁接组合，3种嫁接方法，共计36个嫁接处理，每一个嫁接处理直冲做30个重复，取用平均值来做统计分析，比较其营养生长、组织愈合及病毒含量等指标。试验具体操作如下：
11.(一)试管嫁接
12.组培室内前期备好试验材料，取继代8周苗龄的组培苗，切取2cm带有一个腋芽的茎段，去掉叶片，底部削成v字尖端形作为接穗；切取2-3cm长茎段，去掉叶片也腋芽，顶端削成v字开口作为砧木；将接穗下端插入砧木上端的v字形开口，用硅胶软管套住嫁接部位使其牢固，然后将嫁接植株接种到正常培养基上，放入组培室正常条件下培养。全程操作均在无菌环境下进行，所有器具使用签均进行灭菌处理。嫁接4周后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
13.(二)绿枝嫁接
14.取直径0.3-0.5cm粗的盆栽葡萄植株，剪取4-6cm的茎段带一个腋芽，叶片保留一半，底部削成v字尖端形作为接穗；在植株基部10cm处剪取上不，保留基部作为砧木，砧木基部腋芽全部去掉，砧木顶部削成v字开口；将接穗底部嵌入砧木顶部的v字开口，用封口膜将嫁接口缠绕固定，嫁接植株注意保湿，放在温室环境内培养。嫁接成活3个月后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
15.(三)硬枝嫁接
16.冬季修剪选取直接0.5-0.8cm粗细、腋芽饱满的枝条作为嫁接材料进行低温储存。待4-5周低温储存打破休眠后，剪取5-10cm长、带有一个饱满腋芽枝条作为接穗，剪取10-20cm长并去掉腋芽的茎段作为砧木；利用嫁接机器，将接穗底部和砧木顶端打成ω形状进行嵌套结合；让嫁接好的嫁接植株放入蛭石中在高温高湿条件下让嫁接部位愈合并砧木基部生根；待嫁接植株生根后移栽营养土中，让在温室内培养1-2个月，并择机移植到田间。嫁接植株移栽至田间1年后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
17.结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
18.第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发
明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
19.嫁接是葡萄的重要栽培、繁殖方式。选用合适的砧木能够抵抗土媒害虫，还能提高果实对环境的适应性，提高果实的产量和品质。葡萄病毒引起的嫁接不亲和性造成植株定植后陆续死亡，给生产造成严重损失。因此，建立一种技术能够快速可靠的筛选病毒感染造成的嫁接不亲和的植株对减少生产损失意义重大。与传统的绿枝嫁接和硬枝嫁接相比，本发明在试管嫁接的基础上，结合形态学、组织学和病毒学分析手段对病毒感染的嫁接植株进行生长分析，最快嫁接4周内可筛选出病毒感染造成的嫁接不亲和植株，与传统的绿枝嫁接(3-6个月)和硬枝嫁接(1-3年)相比，极大的缩短了筛选时间，可在嫁接植株定植田间前做好砧穗不亲和植株的筛选，减少了后期果园的管理成本，显著的增加经济效益。试验过程中的具体数据如下：
20.(一)嫁接植株成活率。对照接穗(健康
‘
品丽珠’)嫁接到4种健康砧木上(freedom、101-14、st.george和axr1)的成活率均》80％，感染glrav-1的接穗(lr131)嫁接到4种健康砧木上的成活率均》80％，与健康接穗的成活率没有显著差异，感染glrav-1和gva两种病毒的接穗(lr132)嫁接到4种健康砧木上成活率是0，所有嫁接植株全部死亡。
21.(二)嫁接植株的营养生长。对照接穗嫁接到4种健康砧木上，嫁接4周后接穗生长量约50-60mg干重；lr131嫁接到freedom和101-14上接穗的生长量低于对照，嫁接到st.george和axr1上接穗的生长量与对照没有显著差别。
22.(三)嫁接部位愈合程度。将不同嫁接组合的嫁接部位在嫁接4周后进行组织切片观察，对照接穗嫁接到4种砧木上，嫁接部位都完整愈合，接穗和砧木之间形成完整的维管系统；lr131接穗嫁接到4种砧木上，嫁接部位都完整愈合，接穗和砧木之间同样形成完整的维管系统，与对象没有显著区别；lr132嫁接到4种砧木上，嫁接植株死亡，嫁接部位没有完全愈合，仅有部分愈伤组织形成，接穗和砧木之间没有形成完整的维管连接系统，是嫁接植株死亡的直接原因。
23.(四)嫁接植株病毒含量的测定。对成活的嫁接植株进行病毒检测，对照接穗嫁接到4种砧木上成活4周后，砧木均未检测到病毒含量；lr131嫁接到4种砧木上成活4周后，砧木上均检测到病毒含量，且4种砧木的病毒含量差异不显著。病毒检测结果表明lr131接穗与砧木之间形成完整的维管组织，病毒能够从接穗转运至砧木，接穗与砧木没有产生病毒感染导致的嫁接不亲和性。
24.上述试验数据表明，病毒glrav-1与gva的复合感染能导致严重的砧穗嫁接不亲和，试管嫁接植株全部死亡；glrav-1单独感染不影响接穗与4种砧木(freedom、101-14、st.george和axr1)的嫁接亲和性。因此，本试验所用的试管嫁接及相关的指标检测方法能够有效的鉴别病毒感染导致的砧穗嫁接亲和性，而且是一种快速、高效、低成本的筛选病毒感染导致的嫁接不亲和的方法，在葡萄栽培生产具有极大的应用价值。
25.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
26.本发明在试验期间与传统的绿枝嫁接和硬枝嫁接进行了比较，通过数据比对，确定了本发明在鉴定葡萄病毒感染导致的嫁接不亲和具有以下优点：
27.(一)快速、灵敏、高效，检测周期短。本发明仅用4周时间通过对不同指标的检测分
析即可得出病毒glrav-1与gva的复合感染能导致严重的砧穗嫁接不亲和，试管嫁接植株全部死亡；glrav-1单独感染不影响接穗与4种砧木(freedom、101-14、st.george和axr1)的结论，极大的缩短了检测周期。而绿枝嫁接在3个月内，glrav-1与gva的复合感染的嫁接植株仍具有20％的成活率，硬枝嫁接在6个月内，glrav-1与gva的复合感染的嫁接植株仍具有10％的成活率，这两种方法检测周期长，且检测结果干扰了数据的真实性，容易对生产造成误导。
28.(二)检测结果受外界因素影响小，检测结果可靠。试管嫁接是在人工控制的组培环境内进行，温度、光照、营养成分等影响生长的因素都可控，能够保持最大限度的稳定，因此检测结果受外界因素影响小，试验过程重的数据重复性高，结果更可靠。绿枝嫁接和硬枝嫁接属于室外操作，温室和田间的生长条件不稳定，易受气候及病虫害等自然因素影响，因此检测结果不稳定，易受干扰，试验数据也表明绿枝嫁接和硬枝嫁接的试验结果不如试管嫁接的试验结果稳定。
29.(三)人工耗费少，检测成本低。试管嫁接在室内操作，需用的人力、无力少，试验设备均是常规组培设备，无须单独配置，试验材料所占空间小，嫁接植株的各项指标检测容易，整个过程人工耗费少，检测成本低。绿枝嫁接和硬枝嫁接除准备材料的周期长之外，还需要雾室和温室等来控制生长条件，移栽至苗圃需要占用土地空间，嫁接成活后生长指标检测麻烦，检测成本远高于试管嫁接。
30.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
31.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
32.本发明对于大规模种种植的葡萄园具有极高的应用价值。葡萄是多年生果树，建园定植时选用正确的嫁接苗木直接影响未来10-20年的效益。在定植前利用本发明技术筛选具有良好嫁接亲和性的植株，可大大减少后期的果园管理成本，预期可减少500元/亩/年的管理成本，且提高后期果实产量和品质预计500元/亩/年，综合下来预期将提高收益1000元/亩/年.
33.(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
34.病毒感染导致的葡萄砧穗嫁接不亲和已经引起国内外的重视，但目前更多没有明确的办法能够早起筛除病毒感染造成的嫁接不亲和植株，只能在田间发现后再筛除、补苗，造成生产损失。本发明很好的解决了这一问题，在葡萄园定植之前，通过实验室的检测试验即可提前确定嫁接组合的亲和性，对生产给予关键指导。本发明很好的填补了国内外业内的技术空白。
35.(3)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
36.本发明很好的解决了生产上一直可望解决、但始终为获得成功的技术难题：如何在葡萄定植前快速、准确的鉴定嫁接植株是否具有良好的嫁接亲和性。
37.(4)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：
38.本发明是一种创新性的技术应用，而且具有很强的实用性，和传统技术具有显著差别，不存在克服技术偏见。
附图说明
39.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
40.图1是本发明实施例提供的快速鉴定葡萄病毒感染导致砧穗嫁接不亲和的方法流程图；
41.图2是本发明实施例提供3种嫁接方法试管嫁接(a-d)、绿枝嫁接(e-f)和硬枝嫁接(g-h)的操作示意图；
42.图3是本发明实施例提供的(a)试管嫁接、(b)绿枝嫁接和(c)硬枝嫁接在4种不同砧木上的成活率的影响示意图；每种砧木的接穗依次是健康
‘
品丽珠’、lr131和lr132；ns表示没有成活；不同的小写字母表示p《0.05水平的显著差异；
43.图4是本发明实施例提供的(a)试管嫁接、(b)绿枝嫁接和(c)硬枝嫁接植株成活后接穗的生长量。其中试管嫁接和绿枝嫁接接穗的生长量以嫁接部位以上植株的干重来评价；硬枝嫁接接穗的生长量以当年冬剪的剪枝量为依据；每种砧木的接穗依次是健康
‘
品丽珠’、lr131和lr132；ns表示没有成活；不同的小写字母表示p《0.05水平的显著差异；
44.图5是本发明实施例提供的试管嫁接中感染病毒的接穗lr131嫁接后对嫁接植株(a)接穗萌芽和(b)砧木生根的影响。每种砧木的接穗依次是健康
‘
品丽珠’和lr131；不同的小写字母表示p《0.05水平的显著差异；
45.图6是本发明实施例提供的试管嫁接后1周嫁接部位愈合检测。(a)、(b)和(c)是健康
‘
品丽珠’嫁接部位的横切面的不同倍数观察；(d)、(e)和(f)是lr131嫁接部位的横切面的不同倍数观察；(g)、(h)和(i)是lr132嫁接部位的横切面的不同倍数观察；rt表示砧木组织；sc表示接穗组织；
46.图7是本发明实施例提供的试管嫁接后4周嫁接部位愈合检测。(a)、(b)和(c)是健康
‘
品丽珠’嫁接部位的横切面的不同倍数观察；(d)、(e)和(f)是lr131嫁接部位的横切面的不同倍数观察；(g)、(h)和(i)是lr132嫁接部位的横切面的不同倍数观察；rt表示砧木组织；sc表示接穗组织；
47.图8是本发明实施例提供的试管嫁接后8周嫁接部位愈合检测。(a)、(b)和(c)是健康
‘
品丽珠’嫁接部位的横切面的不同倍数观察；(d)、(e)和(f)是lr131嫁接部位的横切面的不同倍数观察；(g)、(h)和(i)是lr132嫁接部位的横切面的不同倍数观察；rt表示砧木组织；sc表示接穗组织；
48.图9是本发明实施例提供的试管嫁接成活植株的病毒含量。接穗lr131嫁接到4种不同砧木上嫁接(a)1周，(b)4周和(c)8周后的砧木病毒含量。c
t
值代表反转录水平的相对含量，黑色代表glrav-1,红色代表内参基因，ntc表示没有反转录的对照；不同的小写字母表示p《0.05水平的显著差异；
具体实施方式
49.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于
限定本发明。
50.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速鉴定葡萄病毒感染导致砧穗嫁接不亲和的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
51.如图1所示，本发明实施例提供的快速鉴定葡萄病毒感染导致砧穗嫁接不亲和的方法包括以下步骤：
52.s101，准备嫁接试验需要的接穗和砧木材料；
53.s102，分别进行三种嫁接试验：试管嫁接、绿枝嫁接和硬枝嫁接；
54.s103，对嫁接植株的成活率、生长状况进行评估；
55.s104，植株嫁接部位的愈合情况进行组织学分析；
56.s105，成活嫁接植株的砧木病毒含量检测；
57.s106，评价不同嫁接方法对植株嫁接亲和性的筛选效果。
58.本发明实施例提供的
‘
品丽珠’3种病毒感染作为接穗嫁接到4种不同砧木上进行试验。试管嫁接的材料取自正常培养的组培苗，培养条件为24
±
2℃的恒温条件下，光照周期为16小时光照，8小时黑暗，培养基配方为2.2g/l ms粉末+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，调节ph＝5.8，在121℃高压灭菌20min；绿枝嫁接的材料生长在4l的花盆中并装满等比例的的珍珠石/蛭石/泥炭，温室温度设定为30℃/20℃昼夜，光周期维持在16h，并补充照明；用于硬枝嫁接的枝条从商业葡萄园种采集。冬季修剪时收集休眠枝条，4℃保存并打破休眠直到使用。本发明实施例提供的试管嫁接包括：组培室内前期备好试验材料，取继代8周苗龄的组培苗，切取2cm带有一个腋芽的茎段，去掉叶片，底部削成v字尖端形作为接穗；切取2-3cm长茎段，去掉叶片也腋芽，顶端削成v字开口作为砧木；将接穗下端插入砧木上端的v字形开口，用硅胶软管套住嫁接部位使其牢固，然后将嫁接植株接种到正常培养基上，放入组培室正常条件下培养。全程操作均在无菌环境下进行，所有器具使用签均进行灭菌处理。
59.本发明实施例提供的绿枝嫁接包括：取直径0.3-0.5cm粗的盆栽葡萄植株，剪取4-6cm的茎段带一个腋芽，叶片保留一半，底部削成v字尖端形作为接穗；在植株基部10cm处剪取上不，保留基部作为砧木，砧木基部腋芽全部去掉，砧木顶部削成v字开口；将接穗底部嵌入砧木顶部的v字开口，用封口膜将嫁接口缠绕固定，嫁接植株注意保湿，放在温室环境内培养。
60.本发明实施例提供的硬枝嫁接包括：冬季修剪选取直接0.5-0.8cm粗细、腋芽饱满的枝条作为嫁接材料进行低温储存。待4-5周低温储存打破休眠后，剪取5-10cm长、带有一个饱满腋芽枝条作为接穗，剪取10-20cm长并去掉腋芽的茎段作为砧木；利用嫁接机器，将接穗底部和砧木顶端打成ω形状进行嵌套结合；让嫁接好的嫁接植株放入蛭石中在高温高湿条件下让嫁接部位愈合并砧木基部生根；待嫁接植株生根后移栽营养土中，让在温室内培养1-2个月，并择机移植到田间。
61.本发明实施例提供的试管嫁接的嫁接亲和性评估包括：嫁接4周后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
62.本发明实施例提供的绿枝嫁接的嫁接亲和性评估包括：嫁接成活6个月后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
63.本发明实施例提供的硬枝嫁接的嫁接亲和性评估包括：嫁接植株移栽至田间1年后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
64.为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
65.本发明在研发过程中，与传统发技术方法进行了充分的比对，多得的结论有强力的数据支撑。在试验过程中，从青岛平度大泽山商业葡萄园进行了取材、试验，因此，所得数据和结论都复合生产要求，具有应用实施例的效果。试验结果表明，本发明对严重影响嫁接亲和性的砧穗组合能够100％筛除，且在嫁接4周内即可获得结果，无论是筛选灵敏度还是筛选效率均远高于传统的绿枝嫁接和硬枝嫁接。
66.1.材料
67.本发明在试验过程中所用作接穗和砧木的所有植物材料均取自青岛大泽山商业葡萄园，选用
‘
品丽珠’作为接穗，其中包括健康的
‘
品丽珠’(作对照)、感染glrav-1(材料命名为lr131)的
‘
品丽珠’和复合感染glrav-1和gva
‘
品丽珠’(材料命名为lr132)，砧木选取国内外常用4种砧木作为对照，其中freedom和101-14对病毒敏感，st.george和axr1对病毒抗性较好。试管嫁接的材料取自正常培养的组培苗，培养条件为24
±
2℃的恒温条件下，光照周期为16小时光照，8小时黑暗，培养基配方为2.2g/l ms粉末+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，调节ph＝5.8，在121℃高压灭菌20min；绿枝嫁接的材料生长在4l的花盆中并装满等比例的的珍珠石/蛭石/泥炭，温室温度设定为30℃/20℃昼夜，光周期维持在16h，并补充照明；用于硬枝嫁接的枝条从葡萄园种采集。冬季修剪时收集休眠枝条，4℃保存并打破休眠直到使用。
68.2方法
69.2.1试管嫁接
70.组培室内前期备好试验材料，取继代8周苗龄的组培苗，切取2cm带有一个腋芽的茎段，去掉叶片，底部削成v字尖端形作为接穗；切取2-3cm长茎段，去掉叶片也腋芽，顶端削成v字开口作为砧木；将接穗下端插入砧木上端的v字形开口，用硅胶软管套住嫁接部位使其牢固，然后将嫁接植株接种到正常培养基上，放入组培室正常条件下培养。全程操作均在无菌环境下进行，所有器具使用签均进行灭菌处理。嫁接4周后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
71.2.2绿枝嫁接
72.取直径0.3-0.5cm粗的盆栽葡萄植株，剪取4-6cm的茎段带一个腋芽，叶片保留一半，底部削成v字尖端形作为接穗；在植株基部10cm处剪取上不，保留基部作为砧木，砧木基部腋芽全部去掉，砧木顶部削成v字开口；将接穗底部嵌入砧木顶部的v字开口，用封口膜将嫁接口缠绕固定，嫁接植株注意保湿，放在温室环境内培养。嫁接成活6个月后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。
73.2.3硬枝嫁接
74.冬季修剪选取直接0.5-0.8cm粗细、腋芽饱满的枝条作为嫁接材料进行低温储存。待4-5周低温储存打破休眠后，剪取5-10cm长、带有一个饱满腋芽枝条作为接穗，剪取10-20cm长并去掉腋芽的茎段作为砧木；利用嫁接机器，将接穗底部和砧木顶端打成ω形状进行嵌套结合；让嫁接好的嫁接植株放入蛭石中在高温高湿条件下让嫁接部位愈合并砧木基部生根；待嫁接植株生根后移栽营养土中，让在温室内培养1-2个月，并择机移植到田间。嫁接植株移栽至田间1年后，统计嫁接植株成活率、营养生长量、嫁接部位愈合程度和嫁接植
株的病毒含量。
75.2.4嫁接植株的成活率及营养生长调查
76.试管嫁接4周后，统计嫁接植株成活率、接穗生长量；嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量。绿枝嫁接3个月后，统计嫁接植株成活率、接穗生长量。硬枝嫁接植株移栽至田间1年后，统计嫁接植株成活率、接穗生长量。
77.2.5试管嫁接植株嫁接部位愈合程度检测
78.利用石蜡切片的方法对试管嫁接植株的嫁接部位的愈合进行了组织学观察。将嫁接部位固定18：1：1的50％乙醇/福尔马林/乙酸(faa固定液)24小时，随后在不同浓度的乙醇溶液种进行脱水，乙醇浓度从50％依次增加值，70％，85％，95％到100％，每个浓度中浸泡3小时。石蜡包埋后，用石蜡切片即机(徕卡rm 2235，徕卡，德国)获得切片(厚度5μm)，石蜡切片用1％甲苯胺蓝溶液染色10分钟后在显微镜下观察。
79.2.6试管嫁接植株的病毒检测
80.试管嫁接1、4、8周后分别检测砧木部位的病毒感染状况。由于嫁接lr132的植株均为成活，因此只检测嫁接lr131的植株的glrav-1的病毒感染情况。rna的提取和cdna的合成进行参考takara的试剂盒说明操作，以葡萄18s核糖体rna作为内参基因，荧光定量试剂盒采用rr820a(takarabio，日本)。无模板和无反转录的作为对照，病毒的数量是通过阈值(ct)评估。
81.2.7实验设计及统计分析
82.所有试验均采用完全随机的设计。在3次独立的重复试验中，记录试管嫁接和绿枝嫁接植株的营养生长，每次重复至少检测20株。硬枝嫁接植株每个嫁接组合至少60个重复。每个时间点的石蜡切片至少10个重复样本进行组织学观察。取用平均值来做统计分析，比较其营养生长、组织愈合及病毒含量等指标。数据分析采用spss19(ibm，chicago，il，usa)软件进行统计分析。
83.3.结果
84.3.1嫁接成活率和营养生长量
85.在试管嫁接试验中，lr132接穗嫁接到4种砧木上的嫁接植株全部死亡的(见图3)，因此不对其进行病毒含量的检测。健康接穗和lr131接穗嫁接到4种砧木上的成活率接近，均为85％左右(见图3a)。在绿枝嫁接试验中，lr132嫁接到到freedom和101-14上时的存活率明显较低(见图3b)。然而，健康接穗和和lr131接穗嫁接到4种砧木上的成活率相似(见图3b)。在硬枝嫁接试验中，lr132和lr131接穗嫁接到st.george上成活率接近(约54％)，健康接穗、lr131和lr132嫁接到arx1砧木上时嫁接植株的成活率也接近(约41％)，但lr132接穗嫁接到freedom时植株全部死亡，在101-14上的成活率只有9％(图3c)。freedom、st.george、101-14和axr1分别表示砧木品种名称；小写字母a-e表示显著性差异分析，不同的字母表示在统计学上有显著性差异；ns表示没有成活；
86.lr131嫁接到freedom和101-14上，嫁接植株的生长量显著低于对照接穗，分别减少了24和21％(见图4)，但没有显著性差异；lr132接穗嫁接到freedom和101-14上接穗的生长量显著低于嫁接到st.george或axr1(见图4b)，分别为30.6％和44.2％。lr131与control和lr132在砧木st.george或axr1上的生长量无显著差异(见图3b)。在硬枝嫁接试验中，lr132接穗在101-14上的生长量与对照相比减少了81％，比lr131减少了56％；lr132在砧木
st.george或axr1上的生长量与lr131没有显著差别(见图4c)。freedom、st.george、101-14和axr1分别表示砧木品种名称；小写字母a-e表示显著性差异分析，不同的字母表示在统计学上有显著性差异；ns表示没有成活；
87.在试管嫁接试验中，与对照植株相比，lr131嫁接到freedom和101-14上，嫁接植株接穗的萌芽时间和砧木的生根时间均延迟中病毒对芽破裂时间的影响明显延迟(图5)，而lr131接穗在砧木在st.george和axr1上的萌芽和生根时间与对照相比没有显著差别(图5)。
88.3.2组织学观察
89.为了研究试管嫁接植株的愈合过程，对不同时期的嫁接部位进行解剖观察。由于同一接穗嫁接到不同砧木上的组织学发育没有明显差异，因此本发明只比较了不同接穗的影响(见图6～图8)。图6中rt表示砧木；sc表示接穗；健康接穗嫁接1周后，可以看到接穗和砧木之间的空隙充满薄壁细胞(图6a)，且细胞比正常细胞大，形成了致密的愈伤组织(图6b，c)。在同一时期，lr131的嫁接植株的接穗和砧木之间也出现可见的愈伤组织细胞(图6d～f)，尽管该组织的密度不如对照组观察到的(图6c，f)。与对照组相似，新形成的细胞已经开始分化，这表明接穗和砧木之间开始了连接(图6c，f)。lr132接穗嫁接1周后，接穗和砧木表面之间有明显的间隙(图6g)，只在接穗和砧木之间看到少量的薄壁细胞，不足以形成接穗和砧木连接(图6h，i)。freedom、st.george、101-14和axr1分别表示砧木品种名称；小写字母a-e表示显著性差异分析，不同的字母表示在统计学上有显著性差异；
90.试管嫁接4周后，健康接穗和砧木之间发现明显分化的组织(图7a)，典型的维管组织连接了接穗和砧木的韧皮部区域(图7b，c)。lr131接穗也发生类似的愈合过程(图7d-f)，分化细胞与接穗和砧木之间的早期维管连接已经建立(图7e，f)。lr132做接穗的嫁接植株，接穗和砧木之间可见明显的间隙(图7g)，观察到由砧木和接穗表皮细胞的不规则细胞组成的愈伤组织(图7h，i)。
91.试管嫁接8周后，健康接穗和lr131接穗的植株的嫁接部位建立连接接穗和砧木的完整维管束，形成完整的维管系统(图8a～f)。相比之下，在lr132作接穗的植株，在接穗和砧木之间可见愈伤组织的增殖(图8g～i)，但没有形成连接接穗和砧木的维管束(图8i)。
92.3.3病毒检测
93.从嫁接后1周开始，对所有试管嫁接的砧木进行病毒传播测试(见图9)。在所有用lr131嫁接的砧木中，4种砧木在嫁接1周后，rt-qpcr可检测到glrav-1(见图9a)。嫁接后4周和8周也发现了类似的结果，4种砧木之间的病毒数量没有显著差异(见图9b，c)。试管嫁接8周，ct数值低于第1周，说明glrav-1在砧木中的积累量有所增加(见图9)。freedom、st.george、101-14和axr1分别表示砧木品种名称；小写字母a-e表示显著性差异分析，不同的字母表示在统计学上有显著性差异；
94.4.讨论
95.本发明采用3种嫁接方法，2种病毒株系和4种不同的砧木来评估病毒感染导致的嫁接不亲和性。结果表明，lr131(glrav-1感染)和lr132(glrav-1和gva混合感染)对试管嫁接的存活率和营养生长有不同的影响。lr132感染对试管嫁接成活的影响最大，所有lr132作接穗试管嫁接均死亡。砧木st.george和axr1对病毒感染的耐受性高于freedom和101-14号，前者表现出更高的存活率和更多的生长量。在本发明中，glrav1和gva复合感染对试管
嫁接的愈合影响要比单一感染grlav-1大得多。因此，可利用试管嫁接研究和筛选砧木对病毒感染引起的嫁接不亲和植株。对嫁接植株的营养生长测量结果发现，病毒感染对砧木freedom和101-14的影响均高于st.george和axr1。本发明的结果发现，lr131嫁接到freedom和101-14上延迟了接穗的萌芽和砧木的生根，并发现病毒在嫁接后7天内从接穗传播到砧木。本发明的组织学观察显示，lr131作接穗对试管嫁接的愈合没有显著影响，但lr132阻止了愈合过程，导致所有试管嫁接的死亡。本发明的结果显示，7天后在lr131作接穗的试管嫁接植株，嫁接部位已经可见清晰而致密的愈伤组织。基于植物病毒通过植物细胞间的胞间连丝短距离传播的理论，形成的愈伤组织也使得病毒能够从接穗传递到砧木上。lr132作接穗，虽然嫁接8周后接穗和砧木之间有少量可见的愈伤组织，但不足以建立成功的连接，导致所有lr132试管嫁接死亡。
96.通过比较三种嫁接方法，本发明发现glrav-1和gva复合感染比glrav-1单独感染对嫁接植株的破坏性更大；在试管嫁接中，glrav-1和gva复合感染的接穗嫁接到4种砧木上均造成严重的嫁接不亲和，而glrav-1单独感染嫁接到4种会有一定生长影响，但不会造成致死的嫁接不亲和；砧木st.george和axr1相比freedom和101-14具有更强的病毒抗性。
97.5.结论
98.本发明的结果显示，与绿枝嫁接、硬枝嫁接的结果相比，试管嫁接接产生了类似的测试结果。但与绿枝嫁接和硬枝嫁接相比，试管嫁接更灵敏和高效，且操作简单，成本低，配合嫁接后的成活率、营养生长及组织愈合检测可以作为一种嫁接亲和性检测的技术，在生产上具有极大的应用价值。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种快速鉴定葡萄病毒感染导致砧穗嫁接不亲和的方法，其特征在于，葡萄嫁接亲和性的快速评价方法包括：分别采用试管嫁接、绿枝嫁接和硬枝嫁接的方法将对照组
‑‑
健康
‘
品丽珠’、lr131和lr132嫁接到不同的砧木上；通过试管嫁接、绿枝嫁接和硬枝嫁接3种方法嫁接植株的成活率、营养生长、组织愈合及病毒含量进行分析，进而确定试管嫁接移为最佳的快速评价嫁接亲和性的方法。2.如权利要求1所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，准备嫁接试验需要的接穗和砧木材料；步骤二，分别进行三种嫁接试验：试管嫁接、绿枝嫁接和硬枝嫁接；步骤三，对嫁接植株的成活率、生长状况进行评估；步骤四，植株嫁接部位的愈合情况进行组织学分析；步骤五，成活嫁接植株的砧木病毒含量检测；步骤六，评价不同嫁接方法对植株嫁接亲和性的筛选效果。3.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤一中，品丽珠’3种病毒感染作为接穗嫁接到4种不同砧木上进行试验。试管嫁接的材料取自正常培养的组培苗，培养条件为24
±
2℃的恒温条件下，光照周期为16小时光照，8小时黑暗，培养基配方为2.2g/lms粉末+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，调节ph＝5.8，在121℃高压灭菌20min；绿枝嫁接的材料生长在4l的花盆中并装满等比例的的珍珠石/蛭石/泥炭，温室温度设定为30℃/20℃昼夜，光周期维持在16h，并补充照明；用于硬枝嫁接的枝条从商业葡萄园种采集；冬季修剪时收集休眠枝条，4℃保存并打破休眠直到使用。4.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤二中的微移植包括：从8周大的植株上切除2cm茎段，并切除叶片；准备接穗，保留丰满的节点，节点包括侧面和休眠的芽，并将片段的基部切成一个锥形的“v”形；砧木部分是通过从片段上去除所有的芽，并在片段的顶部进行垂直切割；将“v”形接穗插入砧木的垂直切口中，并使用消毒的硅酮管固定接枝连接，微移植物在相同的条件下在半强度质谱上培养。5.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤二中试管嫁接包括：组培室内前期备好试验材料，取继代8周苗龄的组培苗，切取2cm带有一个腋芽的茎段，去掉叶片，底部削成v字尖端形作为接穗；切取2-3cm长茎段，去掉叶片也腋芽，顶端削成v字开口作为砧木；将接穗下端插入砧木上端的v字形开口，用硅胶软管套住嫁接部位使其牢固，然后将嫁接植株接种到正常培养基上，放入组培室正常条件下培养；全程操作均在无菌环境下进行，所有器具使用签均进行灭菌处理。6.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤二中的绿枝嫁接包括：取直径0.3-0.5cm粗的盆栽葡萄植株，剪取4-6cm的茎段带一个腋芽，叶片保留一半，底部削成v字尖端形作为接穗；在植株基部10cm处剪取上不，保留基部作为砧木，砧木基部腋芽全部去掉，砧木顶部削成v字开口；将接穗底部嵌入砧木顶部的v字开口，用封口膜将嫁接口缠绕固定，嫁接植株注意保湿，放在温室环境内培养。7.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤二中的硬枝嫁接包括：冬季修剪选取直接0.5-0.8cm粗细、腋芽饱满的枝条作为嫁接材料进行低温储存；待4-5周低温储存打破休眠后，剪取5-10cm长、带有一个饱满腋芽枝条作为接穗，剪取10-20cm长并去掉腋芽的茎段作为砧木；利用嫁接机器，将接穗底部和砧木顶端打成ω形状
进行嵌套结合；让嫁接好的嫁接植株放入蛭石中在高温高湿条件下让嫁接部位愈合并砧木基部生根；待嫁接植株生根后移栽营养土中，让在温室内培养1-2个月，并择机移植到田间。8.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤三中的嫁接植株的成活率及营养生长调查包括：试管嫁接4周后，统计嫁接植株成活率、接穗生长量；嫁接部位愈合程度和嫁接植株的病毒含量；绿枝嫁接3个月后，统计嫁接植株成活率、接穗生长量。硬枝嫁接植株移栽至田间1年后，统计嫁接植株成活率、接穗生长量。9.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤四中的嫁接部位愈合组织学分析，包括利用石蜡切片的方法对试管嫁接植株的嫁接部位的愈合进行了组织学观察；将嫁接部位固定18：1：1的50％乙醇/福尔马林/乙酸(faa固定液)24小时，随后在不同浓度的乙醇溶液种进行脱水，乙醇浓度从50％依次增加值，70％，85％，95％到100％，每个浓度中浸泡3小时；石蜡包埋后，用石蜡切片即机(徕卡rm 2235，徕卡，德国)获得切片(厚度5μm)，石蜡切片用1％甲苯胺蓝溶液染色10分钟后在显微镜下观察。10.如权利要求2所述的葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，其特征在于，步骤五中的嫁接植株病毒含量检测，包括试管嫁接1、4、8周后分别检测砧木部位的病毒感染状况。由于嫁接lr132的植株均为成活，因此只检测嫁接lr131的植株的glrav-1的病毒感染情况。rna的提取和cdna的合成进行参考takara的试剂盒说明操作，以葡萄18s核糖体rna作为内参基因，荧光定量试剂盒采用rr820a(takara bio，日本)；无模板和无反转录的作为对照，病毒的数量是通过阈值(ct)评估；步骤六中的嫁接植株病毒含量检测，包括所有试验均采用完全随机的设计。在3次独立的重复试验中，记录试管嫁接和绿枝嫁接植株的营养生长，每次重复至少检测20株。硬枝嫁接植株每个嫁接组合至少60个重复；每个时间点的石蜡切片至少10个重复样本进行组织学观察；取用平均值来做统计分析，比较其营养生长、组织愈合及病毒含量等指标；数据分析采用spss19(ibm，chicago，il，usa)软件进行统计分析。

技术总结
本发明属于葡萄嫁接技术领域，公开了一种鉴定葡萄嫁接亲和性的快速评价方法，分别采用试管嫁接、绿枝嫁接和硬枝嫁接的方法将对照组(健康


技术研发人员：崔振华 杜航 张锐 赵玫 刘庚森 冷翔鹏 战良 马春晖
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：2023.03.08
技术公布日：2023/8/9