miR-252b及其靶标基因SSE1在制备白蚁免疫抑制剂及其应用

mir-252b及其靶标基因sse1在制备白蚁免疫抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及绿色生物防治技术领域，具体涉及白蚁体内mir-252b及其靶标基因sse1在制备白蚁免疫抑制剂，提高白蚁生物防治效果中的应用。


背景技术：

2.白蚁作为一种全球性的害虫，广泛分布于世界各地。其危害范围很广，能够对房屋建筑、水库堤坝、农业作物以及山林果树等造成严重危害。杀虫剂是一种见效快，使用方便且不受地域季节限制的化学农药，因而长年以来被人们广泛使用。但是由于其长期使用，一些白蚁已经产生了抗药性，需要使用更多的农药进行防治。而许多种化学农药会严重污染农产品、大气、水质和土壤，并会对有益生物造成危害，同时可以通过食物链进入人体，危害人群健康。因此迫切需要开发出可替代、生态友好和可持续的新型农药。
3.昆虫病原真菌如绿僵菌（metarhizium）、白僵菌（beauveria）和拟青霉（paecilomyces）可以有效克服杀虫剂抗性，无污染，且与人体无害，是一种很有前景的害虫生物防治制剂。这些生防菌可以产生大量的孢子或分生孢子，这些孢子散布在昆虫周围，通过附着、萌发、芽管延伸、菌丝侵入这四个阶段感染宿主。分生孢子首先被动地附着与体壁，并在适宜的条件下开始萌发，通过菌丝尖端的机械压力并分泌几丁质酶来破坏体壁，进入宿主体腔。侵入血腔的菌丝转化为单细胞芽生孢子，利用昆虫体内的营养快速繁殖，并分泌毒素抑制昆虫免疫以便促进侵染，进而导致昆虫死亡。宿主死亡后菌丝就会沿着虫体的气门间隙和各环节间膜穿透体壁向外生长，产生新的分生孢子，开始新一轮的感染。然而作为社会性昆虫的白蚁，其独特的社会免疫体系可以在个体与群体水平上有效的抵抗病原真菌的侵染。这将阻碍生防菌最大限度的发挥效果。为了克服这一困难，需要开发出以害虫免疫系统为靶标的免疫抑制剂，从而降低害虫的免疫力，使其更易受病原物的侵染或是提高其杀虫剂易感性。
4.microrna是一种在生物体内高度保守的，由20～30个核苷酸组成的小分子非编码rna，能够引发的基因沉默现象。rnai制剂本身是一种一段单链或双链的rna分子，可通过多种方式进入昆虫体内，从而可以实现免疫相关基因的沉默，达到降低昆虫免疫力的效果。如今，rnai广泛应用于多种昆虫基因功能研究中，如鳞翅目、蜚蠊目、同翅目和半翅目等，可以用于防治多种目的农业害虫。本发明拟以白蚁的mir-252b及其靶标基因sse1来制备免疫抑制剂，以便降低白蚁抵抗病原菌侵染能力，增强其对生防菌的易感性，从而提高防治效果。因此，本发明基于mir-252b序列设计合成mir-252b模拟物（一种双链小rna），发现白蚁取食该模拟物后免疫相关基因被显著抑制，被绿僵菌感染后死亡率也显著上升。此外，本发明基于免疫基因sse1序列设计合成sse1dsrna，利用rnase iii将sse1dsrna消化成效果更强的sse1sirna，发现白蚁取食sse1sirna后，免疫相关基因sse1被显著沉默，其免疫力显著下降，更易被绿僵菌侵染致死。因而，基于mir-252b及其靶标基因sse1制备的免疫抑制剂可以有效提高白蚁生防效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供mir-252b及其靶标基因sse1的序列，和mir-252b模拟物以及sse1sirna在抑制白蚁免疫力，促进生防菌杀灭白蚁效果中的应用。
6.两种用于制备白蚁免疫抑制剂的dna序列，即mir-252b及其靶标基因sse1，其特征在于，dna序列来源于黑胸散白蚁全转录组数据库，mir-252b的dna序列为seq id no:1，sse1的dna序列为seq id no: 2。
7.一种制备mir-252b模拟物的方法，步骤如下：（1）根据mir-252b序列seq id no: 1设计成4条单链dna，4条单链dna分别为：正义链1为seq id no: 3，正义链2为seq id no: 4，反义链1为seq id no: 5和反义链2为seq id no: 6；（2）正义链1与正义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-252b正义链dna模板；反义链1与反义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-252b反义链dna模板；（3）将mir-252b正义链dna模板与反义链dna模板等量混合，通过t7体外转录系统获得mir-252b模拟物。
8.一种制备sse1sirna的方法，步骤如下：（1）根据sse1序列seq id no: 2设计2条扩增引物，分别为上游引物为seq id no: 7和下游引物为seq id no: 8，通过pcr扩增获得sse1基因片段，片段序列为seq id no:9；（2）根据sse1基因片段seq id no: 9设计含转录增强子和t7启动子的特异性引物，上游引物为seq id no: 10，下游引物为seq id no: 11，通过pcr扩增获得sse1dsrna模板，序列为seq id no: 12；（3）利用sse1dsrna模板seq id no: 12，通过t7体外转录系统获得sse1dsrna，随后利用rnase iii将sse1dsrna消化成作用效果更强的sse1sirna。
9.一种含mir-252b模拟物或者sse1sirna的白蚁免疫抑制剂产品。
10.一种抑制白蚁免疫力的方法，将mir-252b模拟物或者sse1sirna的白蚁免疫抑制剂与白蚁食物、饵剂混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，实现抑制白蚁免疫力；食物、饵剂为纸片、木块、木屑、木粉或者含纤维素为主要成分的制品；混合方式为浸润、涂抹、或注入。
11.mir-252b模拟物或者sse1sirna免疫抑制剂作为活性成分的白蚁生物防治产品。
12.mir-252b模拟物或者sse1sirna免疫抑制剂协同生防真菌制备得到的防治白蚁的产品，所述的生防真菌包括如绿僵菌、白僵菌或拟青霉之类的具有杀虫功能的虫生真菌。
13.一种白蚁的生物防治方法，通过喂食mir-252b模拟物或者sse1sirna免疫抑制剂抑制白蚁免疫力，随后利用孢子悬浮液感染白蚁，感染方式包括注射、点滴、涂抹、喷洒。
14.一种制备孢子悬浮液的方法，步骤如下：（1）向水中加入表面活性剂如吐温、曲拉通以及其他能够降低物品表面张力的产品，浓度为0.01-5%；（2）利用小勺、小刀以及其他能够进行刮取操作的工具刮取固体培养基表面的真菌分生孢子或者利用离心方法沉淀液体培养基中的真菌芽生孢子；（3）利用水或者加入表面活性剂的水溶液冲刷刮取或者沉淀的真菌孢子，涡旋震荡，制备孢子悬浮液；综上所述，mir-252b模拟物和sse1sirna能够有效抑制白蚁免疫能力，显著提高了
金龟子绿僵菌对白蚁的防治效果。
15.本发明有以下4个明显的优点：1.生防菌的侵染力和昆虫免疫能力很大程度上影响生物防治的效果，mir-252b以及sse1直接作用于昆虫免疫能力，因而在提高生物防治效果方面更具针对性；2.mir-252b能够有效抑制多种免疫相关基因的表达；3.mir-252b模拟物和sse1sirna均为小分子双链rna，制备简单，效率更高，对环境友好，对人畜安全；4. mir-252b模拟物和sse1sirna能够通过喂食进入白蚁体内发挥作用，使用方法简单；5.与金龟子绿僵菌结合使用，mir-252b模拟物和sse1sirna能够显著提高生防菌对白蚁的杀灭效果，具有良好的应用前景。
附图说明
16.图1：mir-252b模拟物和sse1sirna的凝胶电泳图。
17.图2：mir-252b模拟物对白蚁体内免疫相关基因表达的影响。mir-252b模拟物对a.phosphoenolpyruvate carboxykinase [gtp]基因，b.sse1（heat shock protein homolog sse1）基因，c.serine/threonine-protein phosphatase 5基因，d.atp-binding cassette sub-family c member 5基因，e.cathepsin b-like cp2基因和f.abc transporter h family member 2基因的抑制作用。
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图3：mir-252b模拟物对染菌白蚁存活率的影响。
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图4：mir-252b模拟物为活性成分的纳米药剂对染菌白蚁的存活率的影响。
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图5：sse1sirna对白蚁体内免疫基因sse1表达的影响。
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图6：sse1sirna对染菌白蚁存活率的影响。
具体实施方式
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实施例1 mir-252b模拟物的制备过程根据黑胸散白蚁体内mir-252b的序列seq id no: 1设计成4条单链dna，分别为：正义链1为seq id no: 3，正义链2为seq id no: 4，反义链1为seq id no: 5和反义链2为seq id no: 6。将2微升100 μm的正义链1与2微升100 μm的正义链2混合，进行退火pcr获得mir-252b正义链模板。将2微升100 μm的反义链1与2微升100 μm的反义链2混合，进行退火pcr获得mir-252b反义链模板。随后将2.5微升上述mir-252b正义链模板与2.5微升mir-252b反义链模板混合，利用20微升t7体外转录系统获得mir-252b模拟物。稀释原溶液并进行凝胶电泳检测（图1的左图）。
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实施例2 mir-252b模拟物对白蚁体内基因表达的影响将70微克mir-252b模拟物溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将70微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食2天后，利用rt-qpcr技术检测处理组和对照组白蚁体内免疫相关基因的表达量。如图2所示，与对照组相比，mir-252b模拟物显著抑制白蚁体内免疫相关基因的表达（p《0.05, wilcoxon test）。
[0024]
实施例3 mir-252b模拟物对染菌白蚁死亡率的影响将70微克mir-252b模拟物溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将70微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食2天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分，放回3.5厘米培养皿中继续培养10天。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。如图3所示，与对照组[lt
50
: 6.085 (5.606-6.610)]相比，处理组[lt
50
: 3.748 (3.018-4.479)]染菌白蚁死亡率显著升高（χ2= 10.450, p《0.01, kaplan
–
meier method），表明mir-252b模拟物能够提高生防菌杀灭白蚁的能力。
[0025]
实施例4 mir-252b模拟物为活性成分的纳米药剂对染菌白蚁死亡率的影响利用entranster
tm-in vivo纳米转染试剂盒，参考说明书并略微进行修改，首先使用无酶水稀释10微升纳米颗粒原液到40微升，然后使用无酶水稀释50微克mir-252b模拟物到30微升，最后将两种稀释液混合，立即斡旋30秒，室温静置10分钟，制备成mir-252b模拟物为活性成分的纳米药剂，待用。采用相同的方法，将mir-252b模拟物替换为gfpsirna，制备成对照纳米药剂，待用。
[0026]
将上述50微克mir-252b模拟物为活性成分的纳米药剂滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将上述50微克gfpsirna的对照纳米药剂滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食2天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分，放回3.5厘米培养皿中继续培养10天。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。如图4所示，与对照组[lt
50
: 5.964 (4.133-12.507)]相比，处理组[lt
50
: 4.528 (2.619-6.383)]染菌白蚁死亡率显著升高（χ2= 7.480, p《0.01, kaplan
–
meier method），表明mir-252b模拟物为活性成分的纳米药剂能够提高生防菌杀灭白蚁的能力。
[0027]
实施例4 sse1sirna的制备过程根据黑胸散白蚁体内sse1的dna序列seq id no: 2，设计2条扩增引物，上游引物为seq id no: 7和下游引物为seq id no: 8，通过pcr扩增获得pepck基因片段，片段序列为seq id no: 9。根据sse1基因片段seq id no: 9设计含转录增强子和t7启动子的特异性引物，上游引物为seq id no: 10，下游引物为seq id no: 11，通过pcr扩增获得sse1dsrna模板。随后利用1微克sse1dsrna模板，通过20微升t7体外转录系统获得sse1dsrna。最后利用100微升rnaseiii体系将100微克sse1dsrna消化20分钟，酶剪切成作用效果更强的sse1sirna。稀释原溶液并进行凝胶电泳检测（图1的右图）。
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实施例5 sse1sirna对白蚁免疫相关基因sse1表达的影响将30微克sse1sirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5 cm的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作
为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将30微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食1天后，利用rt-qpcr技术检测处理组和对照组白蚁体内免疫相关基因sse1的表达量。如图5所示，与对照组相比，sse1sirna显著抑制sse1基因的表达（p《0.05, wilcoxon test）。
[0029]
实施例6 sse1sirna对染菌白蚁死亡率的影响将30微克sse1sirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5 cm的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将30微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食1天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分，放回3.5厘米培养皿中继续培养10天。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。如图6所示，与对照组[lt
50
: 6.085 (5.606-6.610)]相比，处理组[lt
50
: 4.513 (4.191-4.959)]染菌白蚁死亡率显著提高（χ2= 14.401, p《0.01, kaplan
–
meier method），表明sse1sirna能够显著提高生防菌杀灭白蚁的能力。

技术特征：
1.两种用于制备白蚁免疫抑制剂的dna序列，即mir-252b及其靶标基因sse1，其特征在于，dna序列来源于黑胸散白蚁全转录组数据库，mir-252b的dna序列为seq id no:1，靶标基因sse1的dna序列为seq id no:2。2.根据权利要求1所述的mir-252b的dna序列制备mir-252b模拟物，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据mir-252b序列seq id no:1设计成4条单链dna，4条单链dna分别为：正义链1为seq id no: 3，正义链2为seq id no: 4，反义链1为seq id no:5和反义链2为seq id no:6；（2）正义链1与正义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-252b正义链dna模板；反义链1与反义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-252b反义链dna模板；（3）将mir-252b正义链dna模板与反义链dna模板等量混合，通过t7体外转录系统获得mir-252b模拟物。3.根据权利要求1所述的sse1序列seq id no:2制备sse1 sirna，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据sse1序列seq id no:2设计2条扩增引物，分别为上游引物为seq id no:7和下游引物为seq id no:8，通过pcr扩增获得sse1基因片段，片段序列为seq id no: 9；（2）根据sse1基因片段seq id no:9设计含转录增强子和t7启动子的特异性引物，上游引物为seq id no:10，下游引物为seq id no:11，通过pcr扩增获得sse1 dsrna模板，序列为seq id no: 12；（3）利用sse1 dsrna模板seq id no:12，通过t7体外转录系统获得sse1 dsrna，随后利用rnase iii将sse1 dsrna消化成作用效果更强的sse1 sirna。4.一种含权利要求1所述的mir-252b模拟物或者sse1 sirna的白蚁免疫抑制剂产品。5.一种抑制白蚁免疫力的方法，其特征在于，将如权利要求1所述中的含mir-252b模拟物或者sse1 sirna的白蚁免疫抑制剂与白蚁食物、饵剂混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，实现抑制白蚁免疫力。6.根据权利要求5所述的抑制白蚁免疫力的方法，其特征在于，食物、饵剂包括纸片、木块、木屑、木粉或者含纤维素为主要成分的制品；混合方法包括浸润、涂抹、或注入。7.一种含权利要求1所述的mir-252b模拟物或者sse1 sirna免疫抑制剂为活性成分的白蚁生物防治产品。8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，mir-252b模拟物或者sse1 sirna免疫抑制剂协同生防真菌制备得到的防治白蚁的产品，所述的生防真菌包括如绿僵菌、白僵菌或拟青霉之类的具有杀虫功能的虫生真菌。9.一种白蚁的生物防治方法，其特征在于，步骤如下：（1）利用水或加入表面活性剂的水溶液收集生防真菌孢子，制备生防真菌孢子悬浮液；（2）通过注射、点滴、涂抹、或喷洒的方法感染取食免疫抑制剂的白蚁，进而提高生防真菌杀灭白蚁的效果。10.根据权利要求9所述的白蚁的生物防治方法，其特征在于，步骤（1）中所述的表面活性剂包括吐温、曲拉通，表面活性剂的浓度为0.01-5%。

技术总结
本发明公开了miR-252b及其靶标基因SSE1在制备白蚁免疫抑制剂中的应用，miR-252b及其靶标基因SSE1，其双链RNA能够显著抑制白蚁免疫力，增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁的效果。所述的miR-252b及其靶标基因SSE1序列均来源于黑胸散白蚁全转录组数据库。基于miR-252b序列设计并合成miR-252b模拟物。白蚁取食miR-252b模拟物后，免疫相关基因表达被显著抑制。利用绿僵菌感染取食miR-252b模拟物的白蚁，白蚁死亡率显著上升。基于SSE1序列设计并合成SSE1 dsRNA，利用RNase III将SSE1 dsRNA消化成作用效果更强的SSE1 siRNA。白蚁取食SSE1 siRNA后，免疫相关基因SSE1表达量显著下降。利用绿僵菌感染取食SSE1 siRNA后的白蚁，发现白蚁死亡率显著上升。这表明miR-252b及其靶标基因SSE1能够显著提高白蚁生物防治效果。SSE1能够显著提高白蚁生物防治效果。SSE1能够显著提高白蚁生物防治效果。


技术研发人员：汤清波 刘龙 冯怡颖 杨淑芳 张元臣 黄求应 孙龙龙
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/8/9