一种大黄酸纳米乳凝胶及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种大黄酸纳米乳凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.骨关节炎是由多种因素引起的关节软骨纤维化、皲裂、溃疡、脱失而导致的关节疾病。据世界卫生组织调查研究显示，目前全世界骨关节病患者已超过4亿。我国的骨关节炎患者超过人口总数的10％，多达1亿以上，且发病率随年龄增加而增高。骨关节炎疾病多发于中老年人，且女性多于男性。骨关节炎疾病早期由于受累关节疼痛、僵硬，患者活动能力受到影响，生活质量随之下降。随着病情持续发展，可能会导致关节功能丧失而致残，患者会失去工作能力，生活将无法自理，所以，骨关节炎素有“致残杀手”之称。炎症是导致骨关节炎疼痛的原因之一。疼痛能够引起血压升高、心动过速、心律失常，也能够让人呼吸急促、血糖升高，严重时可以使人休克，一些长期的慢性疼痛还可导致恐惧、失眠、焦虑等一系列的心理改变。在高原或寒冷的情况下更容易得关节炎，寒冷和空气稀薄会导致关节损伤的进一步加重。
3.针对骨关节炎的抗炎镇痛，目前常用的治疗方法包括非药物治疗、药物治疗和手术治疗，其中非药物治疗和药物治疗是目前应用最多，也是有效的控制病情发展的主要手段。目前，用于治疗骨关节炎的市售首选药物是双醋瑞因胶囊，其主要成分是大黄酸的乙酰化物，口服吸收率较大黄酸高。然而，双醋瑞因胶囊口服后经过消化系统的首过效应，相当部分又转化为大黄酸和糖化产物，导致其口服生物利用度较低。相关研究显示代谢产物大黄酸也具有良好的抗炎作用，是双曲瑞因治疗关节炎的主要活性代谢产物。而且，双醋瑞因或其活性代谢产物大黄酸全身分布，不但导致关节炎症部位的药物浓度较低，不能起到良好的治疗作用，而且会分布到其他组织引起不良反应，譬如口服后引起轻微的腹泻。另外，关节炎症的治疗周期较长，每日口服双醋瑞因胶囊导致患者的顺应性差，甚至导致漏服药物，达不到有效的治疗预期。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种安全、高效和使用方便的大黄酸纳米乳凝胶及其制备方法和应用，以期解决市售骨关节炎首选治疗药物-双醋瑞因胶囊口服吸收率和生物利用度较低、产生腹泻等不良反应的问题，具体包括以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种大黄酸纳米乳凝胶，该凝胶包括大黄酸纳米乳和凝胶基质，其中大黄酸纳米乳由以下重量份和体积份的组分组成：丙二醇单辛酸酯9%-13%、大黄酸4.5%-6.5%、油酸1%、聚氧乙烯40氢化蓖麻油11%-13%、二乙二醇单乙基醚11%-13%，余量为去离子水；凝胶基质由以下重量份和体积份的组分组成：卡波姆940 0.8%-1.2%、泊洛沙姆188 0.1%-0.3%、甘油7%-9%、薄荷油0.1%，余量为去离子水。
5.为了进一步实现发明，所述大黄酸纳米乳和凝胶基质的重量比为1:1。
6.为了进一步实现发明，所述聚氧乙烯40氢化蓖麻油和乙二醇单乙基醚的重量比为1:1。
7.第二方面，本发明提供了一种大黄酸纳米乳凝胶的制备方法，采用的技术方案包括如下步骤：s1、制备大黄酸纳米乳：将大黄酸和油酸加入丙二醇单辛酸酯，振摇溶解，即得混合油相；将聚氧乙烯40氢化蓖麻油于35℃-40℃下加热至熔融后，加入二乙二醇单乙基醚，搅拌混合，即得混合乳化剂；将混合油相加入到混合乳化剂中，充分混合均匀，在持续搅拌中逐滴加入去离子水，直至外观呈澄清透明的液体且不再浑浊，即得大黄酸微乳；对得到的大黄酸微乳进行超声处理15min-30min后，即得大黄酸纳米乳溶液；s2、制备凝胶基质：将卡波姆940和泊洛沙姆188分散在去离子水中，完全溶胀后，加入甘油和薄荷油，混合均匀，最后加入naoh，将上述聚合物溶液的ph调整到中性，得到凝胶基质；s3、制备大黄酸纳米乳凝胶：将大黄酸纳米乳和凝胶基质均匀混合，研磨均一，外观呈黄色透明的半固体胶状物，用naoh调节系统至ph 6.0-7.0，即得大黄酸纳米乳凝胶。
8.为了进一步实现发明，s1中所述超声处理的功率为150w-250w。
9.第三方面，本发明提供了一种上述方法制备获得的大黄酸纳米乳凝胶。
10.第四方面，本发明提供了一种上述第一方面和第三方面所述的大黄酸纳米乳凝胶作为防治骨性关节炎药物的应用。
11.本发明相较于现有技术的有益效果为：本发明改变传统治疗骨关节炎的首选治疗药物“双醋瑞因胶囊”的给药途径，直接将双曲瑞因的活性代谢产物-大黄酸（也是中药大黄的主要化学成分）制备成大黄酸纳米乳，再将大黄酸纳米乳高度分散在含有压敏胶的亲水凝胶材料当中，制备大黄酸纳米乳凝胶；根据临床需要，可考虑进一步制成巴布剂或纳米乳凝胶、无纺布和护膝三件套装模式，从而有效克服双曲瑞因胶囊口服吸收率和生物利用度较低、产生腹泻等不良反应的不足，同时根据患病部位、肿痛区域面积和严重程度，灵活调节用药剂量和用药时间，以提高患者用药的顺应性，更好地实现临床治疗预期。
12.在本发明中，大黄酸为主药，丙二醇单辛酸酯为油相，聚氧乙烯-40-氢化蓖麻油为乳化剂，二乙二醇单乙基醚为助乳化剂，去离子水为水相；卡波姆940和泊洛沙姆188 为凝胶基质，去离子水为溶媒，甘油为保湿剂，薄荷油为防腐剂。
13.本发明能够解决市售骨关节炎首选治疗药物-双醋瑞因胶囊病变部位药物生物利用度低、产生腹泻等不良反应、用药频率高导致漏服药物等问题。
14.本发明采用纳米药物制剂技术和亲水凝胶外敷，有效解决大黄酸水溶性差、透皮能力弱、皮肤刺激性强且不易清洗等问题。
15.本发明的制备方法无需特殊设备，制备工艺简单、质量可控，易于大规模生产和转化。
16.本发明获得的凝胶对实验动物炎症模型和骨关节炎模型呈现出显著的防治效果，
并无明显副作用。
附图说明
17.以下附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
18.图1为不同因素与响应值相互作用的三维响应面图；图2为大黄酸纳米乳凝胶外观性状；图3为大黄酸纳米乳凝胶抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀效果；图4为大黄酸纳米乳凝胶抗冰醋酸致小鼠扭体反应实验结果；图5为大黄酸纳米乳凝胶抗热刺激致小鼠疼痛反应，其中a为治疗后30min，b为治疗后60min，c为治疗后90 min；图6为大黄酸纳米乳凝胶抗醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性结果；图7为敷用大黄酸纳米乳凝胶一周的小鼠血清生化指标，其中a为alt，b为ast，c为urea，d为crea，e为ast/alt，f为alb；图8为敷用大黄酸纳米乳凝胶一周的小鼠主要脏器病理学变化(n=8)；图9为关节炎模型大鼠治疗过程中的体重变化(n=6，其中a为治疗前，b为治疗一周后，c为治疗两周后，d为治疗三周后，e为治疗四周后；图10为关节炎模型大鼠治疗过程中的关节肿胀程度(n=6)，其中a为治疗前，b为治疗一周后，c为治疗两周后，d为治疗三周后，e为治疗四周后；图11为关节炎模型大鼠治疗过程中的足趾肿胀程度，其中a为治疗前，b为治疗一周后，c为治疗两周后，d为治疗三周后，e为治疗四周后；图12为大黄酸纳米乳凝胶对关节炎模型大鼠il-1β和no的影响(n=6)，其中a为il-1β，b为no；图13为不同剂量组大黄酸纳米乳凝胶对oa模型大鼠踝关节损伤的影响，其中a为模型组，b为正常对照组，c为大黄酸纳米乳凝胶低剂量组，d为大黄酸纳米乳凝胶中剂量组，e为大黄酸纳米乳凝胶高剂量组，f为双氯芬酸钠凝胶。
具体实施方式
19.下面具体实施例和实验例，对本发明做进一步阐释说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
20.实验例1纳米乳处方及超声乳化工艺的优化采用 box-behnken实验设计（bbd）结合响应面优化方法，以大黄酸纳米乳粒径（y1）、多分散指数/pdi（y2）及zeta电位（y3)为评价指标，选取对上述评价指标有明显影响的因素（辅料和超声工艺）进行综合分析，以得到最优处方和最佳制备工艺。这些因素包括混合油相的系统用量比（x1， 5-16%）、混合乳化剂的系统用量比（x2，15-30%）、超声时间（x3，10-40 min）、 超声功率（x4，65-260w）。因素水平表见表1，实验设计见表2。经design expert软件拟合数据，提示多元二次模型最适合拟合该数据。由表3可知，表明y1、y2和y3的模型p值均小于0.01，说明模型显著，也就是只有0.01%的概率会因噪声而发生。纳米乳粒
径、pdi和zeta电位的失拟项p值均大于0.05，说明误差引起的影响不显著。三个响应值的r2均大于0.91，且与预测的r2值接近，提示模型预测效果好。调整后的r2值比预测值偏低，提示模型预测存在不可避免的误差。adeq precision反映模型的信噪比，评价模型预测的精密度，信噪比一般大于4为宜。三个响应值的adeq precision均大于4，表明模型预测精密度良好。y1、y2和y3的多元二次模型方程如下。
21.y1=317.931 +
ꢀ‑
36.2502
ꢀ×ꢀ
x1 +
ꢀ‑
11.0313
ꢀ×ꢀ
x2 +
ꢀ‑
6.18284
ꢀ×ꢀ
x3 + 1.04686
ꢀ×ꢀ
x4 + 0.17503
ꢀ×ꢀ
x1x2 + 0.506909
ꢀ×
x1x3+
ꢀ‑
0.0816783
ꢀ×
x1x4 + 0.0631111
ꢀ×ꢀ
x2x3 +
ꢀ‑
0.0106667
ꢀ×ꢀ
x2x4 + 0.00285299
ꢀ×
x3x4+1.62552
ꢀ×
x12+ 0.200126
ꢀ×ꢀ
x22+
ꢀ‑
0.00824074
ꢀ×
x32+
ꢀ‑
5.46132e-05
ꢀ×ꢀ
x42。
22.y
2 =
0.195965 +
ꢀ‑
0.0148758
ꢀ×ꢀ
x1 +
ꢀ‑
0.0173105
ꢀ×ꢀ
x2 + 0.00843822
ꢀ×ꢀ
x3 + 0.000501606
ꢀ×
x4 +-0.000745455
ꢀ×ꢀ
x1x2 + 0.000339394
ꢀ×ꢀ
x1x3 +
ꢀ‑
1.44522e-05
ꢀ×ꢀ
x1x4 + 8.88889e-06
ꢀ×ꢀ
x2x3 +
ꢀ‑
5.4359e-05
ꢀ×ꢀ
x2x4 +
ꢀ‑
1.7094e-05
ꢀ×ꢀ
x3x4+ 0.00205758
ꢀ×ꢀ
x12+ 0.000702074
ꢀ×ꢀ
x22+
ꢀ‑
0.000138926
ꢀ×ꢀ
x32+ 4.70655e-06
ꢀ×ꢀ
x42。
23.y
3 =-54.6419 + 0.44714
ꢀ×ꢀ
x1 + 1.7969
ꢀ×ꢀ
x2 + 1.46852
ꢀ×ꢀ
x3 + 0.139294
ꢀ×
x4 + 0.0857576
ꢀ×ꢀ
x1x2 +
ꢀ‑
0.0380303
ꢀ×ꢀ
x1x3+ 0.000918415
ꢀ×ꢀ
x1x4 + 0.0156
ꢀ×ꢀ
x2x3 +
ꢀ‑
0.0026735
ꢀ×ꢀ
x2x4 + 0.0010906
ꢀ×
x3x4 +
ꢀ‑
0.075708
ꢀ×ꢀ
x12+
ꢀ‑
0.069603
ꢀ×ꢀ
x22+
ꢀ‑
0.0272563
ꢀ×
x32+
ꢀ‑
0.00034295
ꢀ×ꢀ
x42。
24.表1 因素水平表表2 中心组合实验设计
表3 多元二次模型的方差分析
由图1可知，对于纳米乳粒径（y1），当混合乳化剂固定时，随着混合油相的增加，粒径先减小后减小；当混合油相不变时，随着混合乳化剂的增加，粒径先减小后增大（图1a）。在一定超声条件下，在超声时间和超声功率范围内，粒径随超声时间和超声功率的增加而减小；而超声时间过长则使粒径增大（图1b）。对于多分散指数（y2），当混合油相固定时，随着混合乳化剂的增加，粒径先减小后增大；而当混合乳化剂固定时，随着混合油相的增加，粒径增大（图1c）。适当的超声时间和超声功率可以得到粒径分布均匀的纳米乳给药体系，随着超声时间的延长和超声功率的增大，pdi反而增大（图1d）。对于zeta电位（y3），当混合乳化剂固定时，随着混合油相的增加，zeta电位降低；当混合油相固定时，随着混合乳化剂的增加，zeta电位减小（图1e）。当超声功率一定时，随着超声时间的增加，zeta电位先增大后减小（图1f）。通过期望函数分析，综合衡量三个响应值，得到了各影响因素的最佳组合，即混合油相11.09%，混合乳化剂22.96%，超声时间23.08 min，超声功率179.5 w。在最优条件下，平行制备了3批大黄酸纳米乳，以验证模型的有效性。三批样品的粒径、pdi和zeta电位分别为24.5
±
3.2 nm、0.15
±
0.02和-20.9
±
1.26 mv，与预测值基本一致。大黄酸的纳米液滴粒径越小，多分散指数越低，zeta电位绝对值越高，有利于制剂的经皮通透性和稳定性。
25.大黄酸纳米乳处方及超声工艺：含有大黄酸和油酸的丙二醇单辛酸酯（11.09 %，w/w），其中大黄酸的溶解度为0.54 mg/ml、油酸（1.0 %，w/w），聚氧乙烯40氢化蓖麻油和二乙二醇单乙基醚 (1:1，w/w）为混合乳化剂（22.96 %，w/w），去离子水（65.96 %，w/w）。超声
功率179.5 w，超声时间23.08 min。
26.优化的大黄酸纳米乳制备方法：精密称取大黄酸和油酸，加入至处方量的丙二醇单辛酸酯，振摇溶解，即得混合油相（大黄酸和丙二醇单辛酸酯的混合物）；将聚氧乙烯40氢化蓖麻油于35-40℃加热融，再按质量比(1:1，w/w）与二乙二醇单乙基醚搅拌混合，即得混合乳化剂。将混合油相加入到混合乳化剂中，充分混合均匀，在持续搅拌中逐滴加入处方量的去离子水，直至外观呈澄清透明的液体且不再浑浊，即为大黄酸微乳。对大黄酸微乳于180w功率下超声处理23 min后，即得大黄酸纳米乳。
27.实验例2大黄酸纳米乳凝胶的处方筛选及制备1.凝胶基质的筛选1.1单一凝胶基质的筛选水性凝胶基质对皮肤基本无刺激，易于水洗，是一种性质稳定的半固体系统。分别将海藻酸钠、明胶、卡波姆 940、泊洛沙姆 188、cmc-na配制成为1.0 % （w/v）的水凝胶溶液，考察其延展性、黏度和澄明度，并以此作为评价指标，筛选凝胶基质。
28.延展性测定：称取100 mg水凝胶溶液涂布在洁净玻璃平板上，控制其宽度一致（均为5 cm），用玻璃棒推展，测量其连片的长度,凝胶连片面积越大，提示凝胶延展性越好。
29.粘度测定：采用ndj-1数字式粘度计测量。将适量凝胶置于50 ml聚乙烯试管中，控制转速为6.0 rpm，保证扭矩在20%-85%范围内，根据黏度大小选择不同转子，进行黏度测定。黏度较大者（10000-20000 cp），适宜用于凝胶基质。
30.澄明度检测：肉眼观察是否有异物或不溶性物质或块状物存在。透明均一为佳。
31.由表4可知，卡波姆940作为基质时，其粘性较强，延展性好，透明均一。因此，选择卡波姆940作为凝胶基质。
32.表4 不同类型基质的评价指标。
33.不同浓度凝胶基质性状的考察分别制备质量体积浓度为0.5%、0.85%、1.0%、1.5%的卡波姆940溶液。考察其延展性、黏度和澄明度，并以此作为评价指标，筛选凝胶基质。由表5可知，卡波姆浓度为1.5 % 时，其粘度过高；浓度为0.5% 时，其粘度过低；当其浓度为0.85-1.0 %时，其粘度适当，且1.0%卡波姆的延展性更好。故选择1.0%卡波姆。
34.表5 不同浓度卡波姆凝胶的评价指标
。
35.混合基质性状的考察以1.0%卡波姆为基础基质，加入其他辅料进一步改善凝胶的延展性。准确配制1.0%卡波姆水溶液，分别加入相当于0.2%的待选基质，完全溶解后，评价其澄明度、延展性和粘度。结果如表6所示。当1.0%卡波姆940和0.2%的泊洛沙姆188组合时，其延展性较1.0% 有所改善，黏度适中。因此凝胶基质选择1%卡波姆+0.2%泊洛沙姆188。
36.表6 不同组合凝胶基质的评价指标。
37.不同比例保湿剂的考察通常在外用水性凝胶基质中加入保湿剂。甘油的吸湿率高，保湿效果最好，成本低、安全性高、易获得，是一款性价比较高的保湿剂。分别向纳米乳凝胶中加入相当于5%、8%、10%、15%、20%（w/v）的甘油，评价其澄明度、延展性和粘度，结果如表7所示。当甘油比例为8% 时，混合凝胶基质透明度、延展性较好，黏度适中。因此，选择8%甘油作为保湿剂。
38.表7 添加不同比例甘油纳米乳凝胶的评价指标。
39.大黄酸纳米乳凝胶的制备实施例1一种大黄酸纳米乳凝胶的制备s1、制备大黄酸纳米乳：将大黄酸4.5mg和油酸1.0g加入丙二醇单辛酸酯9.0g，振摇溶解，即得混合油相；将聚氧乙烯40氢化蓖麻油12.0g于35℃下加热至熔融后，加入二乙二醇单乙基醚12.0g，搅拌混合，即得混合乳化剂；将混合油相加入到混合乳化剂中，充分混合均匀，在持续搅拌中逐滴加入去离子水至100g，直至外观呈澄清透明的液体且不再浑浊，即得大黄酸微乳；对得到的大黄酸微乳在150w-250w下进行超声处理15min后，即得大黄酸纳米乳溶液；
s2、制备凝胶基质：将卡波姆940 0.8g和泊洛沙姆188 0.3g分散在去离子水中，完全溶胀后，加入甘油9.0g和薄荷油0.1g，混合均匀，最后加入naoh，将上述聚合物溶液的ph调整到中性，得到凝胶基质；s3、制备大黄酸纳米乳凝胶：将大黄酸纳米乳100g和凝胶基质100g均匀混合，研磨均一，外观呈黄色透明的半固体胶状物，用naoh调节系统至ph 6.0-7.0，即得大黄酸纳米乳凝胶。
40.实施例2一种大黄酸纳米乳凝胶的制备s1、制备大黄酸纳米乳：将大黄酸6.0mg和油酸1.0g加入丙二醇单辛酸酯11.0g，振摇溶解，即得混合油相；将聚氧乙烯40氢化蓖麻油11.0g于40℃下加热至熔融后，加入二乙二醇单乙基醚11.0g，搅拌混合，即得混合乳化剂；将混合油相加入到混合乳化剂中，充分混合均匀，在持续搅拌中逐滴加入去离子水至100g，直至外观呈澄清透明的液体且不再浑浊，即得大黄酸微乳；对得到的大黄酸微乳在150w-250w下进行超声处理25min后，即得大黄酸纳米乳溶液；s2、制备凝胶基质：将卡波姆940 1.0g和泊洛沙姆188 0.2g分散在去离子水中，完全溶胀后，加入甘油8.0g和薄荷油0.1g，混合均匀，最后加入naoh，将上述聚合物溶液的ph调整到中性，得到凝胶基质；s3、制备大黄酸纳米乳凝胶：将大黄酸纳米乳100g和凝胶基质100g均匀混合，研磨均一，外观呈黄色透明的半固体胶状物，用naoh调节系统至ph 6.0-7.0，即得大黄酸纳米乳凝胶。
41.实施例3一种大黄酸纳米乳凝胶的制备s1、制备大黄酸纳米乳：将大黄酸6.5mg和油酸1.0g加入丙二醇单辛酸酯13.0g，振摇溶解，即得混合油相；将聚氧乙烯40氢化蓖麻油13.0g于40℃下加热至熔融后，加入二乙二醇单乙基醚13.0g，搅拌混合，即得混合乳化剂；将混合油相加入到混合乳化剂中，充分混合均匀，在持续搅拌中逐滴加入去离子水至100g，直至外观呈澄清透明的液体且不再浑浊，即得大黄酸微乳；对得到的大黄酸微乳在150w-250w下进行超声处理30min后，即得大黄酸纳米乳溶液；s2、制备凝胶基质：将卡波姆940 1.2g和泊洛沙姆188 0.1g分散在去离子水中，完全溶胀后，加入甘油7.0g和薄荷油0.1g，混合均匀，最后加入naoh，将上述聚合物溶液的ph调整到中性，得到凝胶基质；s3、制备大黄酸纳米乳凝胶：将大黄酸纳米乳100g和凝胶基质100g均匀混合，研磨均一，外观呈黄色透明的半固体胶状物，用naoh调节系统至ph 6.0-7.0，即得大黄酸纳米乳凝胶。
42.实验例4大黄酸纳米乳凝胶的理化性质1. 外观性状大黄酸纳米乳凝胶为均一的黄色透明半固体胶状，见图2。
43.2. ph平均ph值为5.80（皮肤表面平均ph 为5.8）。
44.3. 粒度将制备的凝胶置于洁净的载玻片上，涂成薄层，平行制备三批，在光学显微镜下观察，三片中均未检出大于180μm颗粒，符合《中国药典》2020版凝胶制剂质量规定。
45.4. 无菌及微生物限度取大肠埃希菌试验菌0.1 ml（含菌数100 cfu）和1 g供试品分别涂布于营养琼脂培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。生长的菌落大小、形态特征一致，且供试品培养基大肠埃希菌菌落数少于试验菌培养基。
46.取霉菌、酵母菌试验菌各0.1 ml（含菌数100cfu）和1 g供试品分别涂布于玫瑰红钠琼脂培养基上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。生长的菌落大小、形态特征一致，且供试品培养基大肠埃希菌菌落数少于试验菌培养基。
47.铜绿假单胞菌检测：取供试品1 g，接种至胆盐乳糖培养基中，培养24 h。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养24 h,未检出铜绿假单胞菌。
48.取供试品1 g，接种至亚碲酸钠（钾）肉汤培养基中，培养24 h，取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养72 h。平板上无菌落生长，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
49.实验例4大黄酸纳米乳凝胶的抗炎活性1.大黄酸纳米乳凝胶抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验将体重(25
±
3g)的实验小鼠随机分为正常对照组(nc)、阴性/模型对照组(mc)、阳性对照组(双氯芬酸钠凝胶, 2.00g/kg)(pc)、大黄酸纳米乳凝胶（rh-ne/gel）组(0.66g/kg、1.32g/kg、1.98g/kg)和大黄酸混悬液组(rs)。实验期间，nc组只饲喂标准实验室食物；将pc和rh-ne/gel样品涂抹在脱毛皮肤上；mc组除大黄酸外，其余辅料均等量加入；rs组给予大黄酸混悬液口服。每天1次，连续服用7天。末次给药后1.5 h，将50 μl二甲苯滴于右耳廓诱导炎症反应。诱导45min后，割掉双耳，用打孔机从左右耳廓同一部位取圆形耳廓切片，称重。计算耳廓肿胀程度，比较组间差异。
50.耳廓肿胀程度(mg)=右耳重量-左耳重量..................(1)如图3所示，与空白组比较，阳性对照组、大黄酸混悬液，大黄酸纳米乳凝胶中、高剂量的耳廓肿胀度水平均明显降低(p《0.05)。实验表明，大黄酸纳米乳凝胶有一定的抗炎作用，且基本呈剂量依赖关系。
51.大黄酸纳米乳凝胶抗冰醋酸致小鼠扭体反应实验同“大黄酸纳米乳凝胶抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验”方法每天1次，连续服用7天。末次给药1.5 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸，剂量为10 ml/kg。记录小鼠在15分钟内的扭体次数。
52.如图4所示，与空白组比较，阳性对照组、大黄酸混悬液、大黄酸纳米乳凝胶各剂量
组的扭体次数水平均明显降低(p《0.01)。实验表明，大黄酸纳米乳凝胶具有一定的镇痛作用，且基本呈剂量依赖关系。
53.大黄酸纳米乳凝胶抗热刺激致小鼠疼痛反应实验用55
±
0.5℃热板筛选对热敏感的小鼠，将疼痛阈值在5-30 s内的合格小鼠随机分为7组。同“大黄酸纳米乳凝胶抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验”方法每天1次，连续服用7天。在末次给药后30、60、90 min记录小鼠的痛阈值，痛阈值增加百分率计算公式如下：疼痛阈值增加百分率(%) = (给药后疼痛阈值-给药前疼痛阈值)*100/给药前疼痛阈值如图5所示，与空白组比较，阳性对照组、大黄酸混悬液、大黄酸纳米乳凝胶中、高剂量组的痛阈提高百分率水平均明显提高(p《0.05)，大黄酸纳米乳凝胶低剂量组痛阈提高百分率差异无统计学意义(p》0.05)。实验可得，大黄酸纳米乳凝胶具有一定的镇痛作用，且基本呈剂量依赖关系。
54.大黄酸纳米乳凝胶抗冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性实验同“大黄酸纳米乳凝胶抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验”方法每天1次，连续服用7天。末次给药后1.5 h，尾静脉注射0.5%埃文斯蓝生理盐水溶液，剂量为10 ml /kg，然后腹腔注射0.6%醋酸，剂量为10 ml /kg。注射后20min处死小鼠，打开腹腔。用10ml生理盐水多次冲洗腔体，收集冲洗液离心。用紫外分光光度仪测定上清液的吸光度，吸光值越大，毛细管渗透性越强。
55.如图6所示，与空白组比较，阳性对照组、大黄酸混悬液、大黄酸纳米乳凝胶各剂量组的吸光度均明显降低(p《0.05)。实验表明，大黄酸纳米乳凝胶具有一定的抗炎作用，且基本呈剂量依赖关系。
56.血清生化和组织病理学同“大黄酸纳米乳凝胶抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验”方法每天1次，连续服用7天。末次给药后，每只小鼠眼眦采集血液，放入不加抗凝剂的微离心管中，以14000 g离心12 min获得血清。采用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、尿素(尿素)、肌酐(crea)、白蛋白(alb)等生化指标。同时取心、肝、脾、肺、肾及脱毛皮肤，4%多聚甲醛固定，苏木精-伊红(h&e)染色，评估组织病理学变化。
57.由图7可知，与mc组相比，m-rna组和h-rna组血清alb水平明显升高，pc组血清alb水平降低。此外，rs组和rh-ne/gel组在三个剂量下alt和ast水平均略有升高，但与pc组比较无统计学差异。其他生化指标无明显变化。rh-ne/gel升高血清白蛋白水平的原因可能是由于炎性介质如组胺、缓激肽和前列腺素的释放，这些介质容易增加血管组织对白蛋白的通透性。
58.由图8可知，与空白对照组比较，各给药组主要脏器组织未见明显病理改变，组织特有的微结构正常，细胞形态完整。组织结构上无明显差异。
59.实验例5大黄酸纳米乳凝胶抗木瓜酶所致大鼠关节炎治疗实验1.木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎模型的制备适应性喂养1周后，在造模前1天，将大鼠左后足膝关节以下的大鼠毛发去除，分别于第1天、第4天、第7天在左后足足底皮肤皮下注射0.1 ml 4%木瓜蛋白酶生理盐水。微伤肢体注射后不固定，活动自如，建立大鼠骨关节炎模型（oa）。
60.骨关节炎的治疗将大鼠雌雄随机分为正常对照组(nc)、阴性/模型对照组(mc)、阳性对照组(双氯芬酸钠凝胶, 0.25 g/kg) (pc)和rh-ne/gel低、中、高剂量组(0.25g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg)。除正常对照组注射等量生理盐水外，mc组于大鼠左后脚脱毛皮肤涂布溶媒，其他关节炎模型组于大鼠左后脚脱毛皮肤涂抹所测样品，每日1次，连续4周。每日观察各组大鼠的摄食量、活动量、毛颜色、尿、粪量。每周测量造模前后大鼠体重。分别在造模前、给药前和给药后每周测量脚踝宽度，计算关节膨胀度。分别在造模前、给药前和给药后每周测量脚趾肿胀量，计算脚趾肿胀度。
61.关节肿胀程度(mm) = 炎症后脚踝宽度(给药后)-炎症前脚踝宽度脚趾肿胀程度(mm)=发炎后(给药后)踝关节以下容积-发炎前踝关节以下容积连续给药4周后，取大鼠腹主动脉采血，分离血清。严格按照试剂盒说明书，采用elisa法分别测定血清中il-1β和no含量。采集血液后，解剖左后踝关节，10%甲醛固定，10% edta减计算，常规包埋，切片，h&e染色后观察组织病理学变化。
62.实验结果显示，在实验期间，各组间在食物摄入量、活动量、发色、大便和尿液方面没有显著差异。同一实验阶段大鼠体重无显著差异（图9）。
63.在大鼠oa模型经双氯芬酸钠凝胶和rh-ne/ gel处理前，oa组大鼠关节直径(mm)显著高于nc组(p《0.001)，提示木瓜蛋白酶注射液可引起大鼠关节肿胀，炎症反应可能参与oa的发生。如图10所示，与mc组、pc组和rh-ne/gel组相比，3个剂量组给药后关节肿胀程度显著降低(p《0.001)，且随着给药时间的增加，关节肿胀程度不断改善，抗关节肿胀效果基本呈剂量依赖性。
64.如图11所示，与nc组比较，治疗前各组大鼠模型肿胀程度差异有统计学意义(p《0.001)，证明成功建立大鼠oa模型。给药后，与mc组相比，pc组和rh-ne/gel 3个剂量组大鼠足趾肿胀程度明显减轻，且随着给药时间的增加，足趾肿胀程度持续改善。抗足趾肿胀作用呈剂量依赖性。以上结果表明rh-ne/gel可以减轻木瓜蛋白酶引起的足趾肿胀程度。
65.如图12所示，与nc组相比，oa模型组大鼠血清中il-1β的平均水平显著升高(p《0.001)。与mc组比较，pc组和rh-ne/gel 3个剂量组oa模型大鼠血清中il-1β和no水平均显著降低(p《0.001)，提示rh-ne/gel可抑制oa模型大鼠血清中il-1β和no炎性因子的升高，且其抗炎作用呈剂量依赖性。no、il-1β是滑膜液和关节中最重要的炎症因子之一，通过抑制蛋白多糖和胶原合成诱导软骨基质降解。no可诱导细胞内信号转导和炎症基因激活。上述结果提示大黄酸纳米乳凝胶可通过抑制il-1β和no炎性因子水平升高从而对抗骨关节炎的作用。
66.如图13所示，正常对照组踝关节结构清晰，未见明显炎症改变(图13b)。模型对照组滑膜细胞轻度增殖，细胞数量增多(黑色箭头，图13a)，滑膜结缔组织内可见个别淋巴细胞浸润；胫骨表面偶见包膜，软骨表面被结缔组织覆盖(绿色箭头，图13a)。各治疗组大鼠左踝关节滑膜组织均未见炎症细胞浸润(图13c、13d、13e、13f)。结果表明，双氯芬酸钠凝胶和大黄酸纳米乳凝胶均对木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎有治疗作用。

技术特征：
1.一种大黄酸纳米乳凝胶，其特征在于该凝胶包括大黄酸纳米乳和凝胶基质，其中大黄酸纳米乳由以下重量份和体积份的组分组成：丙二醇单辛酸酯9%-13%、大黄酸4.5%-6.5%、油酸1%、聚氧乙烯40氢化蓖麻油11%-13%、二乙二醇单乙基醚11%-13%，余量为去离子水；凝胶基质由以下重量份和体积份的组分组成：卡波姆940 0.8%-1.2%、泊洛沙姆188 0.1%-0.3%、甘油7%-9%、薄荷油0.1%，余量为去离子水。2.如权利要求1所述大黄酸纳米乳凝胶，其特征在于：所述大黄酸纳米乳和凝胶基质的重量比为1:1。3.如权利要求1所述大黄酸纳米乳凝胶，其特征在于：所述聚氧乙烯40氢化蓖麻油和乙二醇单乙基醚的重量比为1:1。4.制备权利要求1-3中任一项所述大黄酸纳米乳凝胶的方法，其特征在于包括如下步骤：s1、制备大黄酸纳米乳：将大黄酸和油酸加入丙二醇单辛酸酯，振摇溶解，即得混合油相；将聚氧乙烯40氢化蓖麻油于35℃-40℃下加热至熔融后，加入二乙二醇单乙基醚，搅拌混合，即得混合乳化剂；将混合油相加入到混合乳化剂中，充分混合均匀，在持续搅拌中逐滴加入去离子水，直至外观呈澄清透明的液体且不再浑浊，即得大黄酸微乳；对得到的大黄酸微乳进行超声处理15min-30min后，即得大黄酸纳米乳溶液；s2、制备凝胶基质：将卡波姆940和泊洛沙姆188分散在去离子水中，完全溶胀后，加入甘油和薄荷油，混合均匀，最后加入naoh，将上述聚合物溶液的ph调整到中性，得到凝胶基质；s3、制备大黄酸纳米乳凝胶：将大黄酸纳米乳和凝胶基质均匀混合，研磨均一，外观呈黄色透明的半固体胶状物，用naoh调节系统至ph 6.0-7.0，即得大黄酸纳米乳凝胶。5.如权利要求1所述大黄酸纳米乳凝胶，其特征在于：s1中所述超声处理的功率为150w-250w。6.如权利要求4-5中任一项所述制备方法获得的大黄酸纳米乳凝胶。7.如权利要求1-3中任一或权利要求6所述大黄酸纳米乳凝胶作为防治骨性关节炎药物的应用。

技术总结
本发明公开了一种大黄酸纳米乳凝胶及其制备方法和应用，凝胶的大黄酸纳米乳由丙二醇单辛酸酯、大黄酸和油酸等成分组成，凝胶基质由卡波姆940、泊洛沙姆188和甘油等成分组成，公开了该凝胶的制备方法，以及将获得的大黄酸纳米乳凝胶应用于制备防治骨性关节炎药物。本发明得到的大黄酸纳米乳凝胶能够有效克服双曲瑞因胶囊口服吸收率和生物利用度较低、产生腹泻等不良反应的不足，同时根据患病部位、肿痛区域面积和严重程度，灵活调节用药剂量和用药时间，以提高患者用药的顺应性，更好地实现临床治疗预期。临床治疗预期。


技术研发人员：史彦斌 康生福 王元龙 王海娇
受保护的技术使用者：甘南百草生物科技开发有限公司
技术研发日：2023.02.21
技术公布日：2023/8/9