一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物、试剂盒及应用的制作方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物、试剂盒及应用。


背景技术：

2.鱼类线粒体基因组dna包括：1个主要的非编码区(d-loop)、1个轻链复制起始区(o l)、2个核糖体rna基因(12rrna和16s rrna)、22个转运rna基因(trna)以及13个蛋白质编码基因。鲷科(sparidae)隶属于硬骨鱼纲(osteichthyes)、鲈形目(perciformes)、鲈亚目(percoidei)。目前已报道世界有34属133种，广泛分布于大西洋、印度洋和太平洋的温带至热带水域。鲷科鱼类肉质鲜美、营养丰富,经济价值较高，在中国乃至世界海洋渔业资源中占据重要地位。许多种类是名贵经济鱼类和重要的海水养殖对象,如黄鳍棘鲷(acanthopagrus latus(houttuyn,1782))、平鲷[rhabdosargussarba(1775)]等。近年来,随着人工繁育技术的成功，中国鲷科鱼类的养殖面积不断扩大，养殖品种也不断增加。
[0003]
由于黄鳍棘鲷和平鲷在形态学特征上有很多相似之处，尤其在鱼苗阶段，很难通过肉眼对其进行区分，这给苗种场的鱼苗筛选和管理带来很多不便。目前cn115094145a公开了一种黄鳍棘鲷snp标记及其筛选方法以及cn109055571a公开了黄鳍棘鲷微卫星标记的特异性引物及应用，但这两个专利主要用于黄鳍棘鲷的家系鉴定、种群遗传结构、遗传育种、亲子鉴定等。此外cn103131762a公开了一种鉴定平鲷的分子生物学方法，但是该引物仅适用于鉴别平鲷，而不适用其他鲷科鱼类的分子鉴定，且该引物设计采用其它鱼类通用引物和平鲷特异性引物相结合的方式。因此，研发一种能够同时快速、有效的鉴别区分两种鲷科鱼类的方法，对于水产养殖中的鲷科鱼类物种鉴定具有重要意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物及试剂盒。
[0005]
本发明的目的还在于提供一种鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的方法。
[0006]
本发明的最后一个目的在于提供上述引物、试剂盒和方法在鉴别黄鳍棘鲷和平鲷中的应用。
[0007]
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物，所述引物为引物1或引物2，所述引物1包括正向引物1f和反向引物1r，所述正向引物1f的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述反向引物1r的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述引物2包括正向引物2f和反向引物2r，所述正向引物2f的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述反向引物2r的核苷酸序列如seq id no：4所示。
[0008]
具体的：
[0009]
引物1的核苷酸序列包含一正向引物1f和一反向引物1r，核苷酸序列分别为：
[0010]
正向引物1f：tctatggtttgcagagttgc；
[0011]
反向引物1r：attgaatcctgatggatggc。
[0012]
引物2的核苷酸序列包含一正向引物2f和一反向引物2r，核苷酸序列分别为：
[0013]
正向引物2f：aacaagcgaggacatcactg；
[0014]
反向引物2r：gatgttgcacgtggcgctca。
[0015]
本发明还提供一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的试剂盒，包括所述的引物。
[0016]
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的方法，包括以下步骤：以待测样品的基因组dna为模板，利用上述的引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物进行电泳，根据电泳结果判定待测样品为黄鳍棘鲷或平鲷。
[0017]
作为本发明一种优选的实施方式，采用引物1进行pcr扩增时，当电泳图谱显示出大小为477bp的目的条带，则鉴定为黄鳍棘鲷；其电泳图谱显示出大小为572bp的目的条带，则鉴定为平鲷。
[0018]
作为本发明另一种优选的实施方式，采用引物2进行pcr扩增时，当电泳图谱显示出大小为494bp的目的条带，则鉴定为黄鳍棘鲷，当电泳图谱显示出大小为1025bp的目的条带，则鉴定为平鲷。
[0019]
优选的，pcr扩增时，采用的pcr扩增体系包括：模板dna90～110ng、taq酶0.15μl、上下游引物各0.15μl，去离子水补齐至10μl。
[0020]
优选的，pcr扩增时，pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0021]
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述引物、试剂盒或方法在鉴别黄鳍棘鲷和平鲷中的应用。
[0022]
本发明具有以下优点：
[0023]
(1)本发明利用上述两对引物中的任意一对引物，采用pcr扩增的方法能够快速、有效的对两种鲷科鱼类进行鉴别，其反应稳定、重复性好；
[0024]
(2)与线粒体基因组dna条形码测序技术相比，本发明方法具有更好的直观性；
[0025]
(3)与传统的形态学鉴定技术相比，本发明方法具有检测准确性高、客观性强的特点；
[0026]
(4)本发明提供的引物或试剂盒在鉴别两种鲷科鱼类或制备用于鉴别两种鲷科鱼类的试剂盒中具有广泛的应用前景。
附图说明
[0027]
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0028]
图1为实施例3中采用引物对1对黄鳍棘鲷和平鲷的pcr扩增产物电泳结果图，其中左边1-12为12个黄鳍棘鲷acanthopagrus latus样品，右边1-12为12个平鲷rhabdosargussarba样品；
[0029]
图2为实施例3中采用引物对2对黄鳍棘鲷和平鲷的pcr扩增产物电泳结果图，其中左边1-12为12个黄鳍棘鲷acanthopagrus latus样品，右边1-12为12个平鲷rhabdosargussarba样品。
具体实施方式
[0030]
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。除非特别说明，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。
[0031]
实施例1
[0032]
首先鉴定黄鳍棘鲷和平鲷的dna差异序列，并设计扩增引物和电泳。具体的步骤包括：
[0033]
(1)利用soapdenovo软件将黄鳍棘鲷或平鲷二代基因组测序数据组装为contig序列，或利用canu2.2(默认参数)将黄鳍棘鲷或平鲷三代基因组测序数据组装为contig序列。
[0034]
(2)单拷贝直系同源序列检测，采用blastn(版本2.13.0)比对软件，设定最大相似性为1e-50
，最小比对长度为1000bp的条件下，对黄鳍棘鲷和平鲷进行相互比对。要求黄鳍棘鲷比对到平鲷时，黄鳍棘鲷序列唯一比对到平鲷的某一条序列，同时也要求平鲷的对应序列相应的比对回黄鳍棘鲷所对应的序列，互为双向最优比对。满足上述条件的，被定义为单拷贝直系同源序列。
[0035]
(3)对定义为单拷贝直系同源序列的黄鳍棘鲷和平鲷的序列对，采用mafft或muscle等多序列比对软件，进行多序列比对。选择两侧为保守序列(建议保守序列长度大于100bp，且保守序列相似性大于90％)，中间为片段长度差异的序列为鉴定序列。
[0036]
(4)在分子标记的保守区，采用primer5软件设计特异性引物。
[0037]
(5)引物特异性验证，采用blastn比对策略，将设计好的引物比对回基因组序列，比对为默认参数，若唯一比对到目标序列区段，则用于后续的分子标记开发。
[0038]
最终筛选得到的引物为引物1或引物2，引物1包括正向引物1f和反向引物1r，正向引物1f的核苷酸序列如seq id no：1所示，反向引物1r的核苷酸序列如seq id no：2所示；引物2包括正向引物2f和反向引物2r，正向引物2f的核苷酸序列如seq id no：3所示，反向引物2r的核苷酸序列如seq id no：4所示。
[0039]
具体的：
[0040]
引物1的核苷酸序列包含一正向引物1f和一反向引物1r，核苷酸序列分别为：
[0041]
正向引物1f：tctatggtttgcagagttgc(seq id no：1所示)；
[0042]
反向引物1r：attgaatcctgatggatggc(seq id no：2所示)。
[0043]
引物2的核苷酸序列包含一正向引物2f和一反向引物2r，核苷酸序列分别为：
[0044]
正向引物2f：aacaagcgaggacatcactg(seq id no：3所示)；
[0045]
反向引物2r：gatgttgcacgtggcgctca(seq id no：4所示)。
[0046]
也可以将上述引物开发成试剂盒使用。
[0047]
接着以12个黄鳍鲷以及12个平鲷的基因组dna为模板，利用上述引物1或引物2进行pcr扩增，将产物电泳，根据电泳结果验证样品的鲷科鱼类类型。
[0048]
pcr扩增时，采用的pcr扩增体系包括：模板dna90～110ng、taq酶0.15μl、上下游引物各0.15μl，去离子水补齐至10μl。
[0049]
pcr扩增时，pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0050]
如图1所示(左边序号1-12代表12个黄鳍鲷个体，右边序号1-12代表12个平鲷的个体)，采用引物1进行pcr扩增时，当电泳图谱显示出大小约为477bp的目的条带(seq id no：5所示)，则鉴定为黄鳍棘鲷；其电泳图谱显示出大小约为572bp的目的条带(seq id no：6所示)，则鉴定为平鲷。
[0051]
引物1扩增黄鳍棘鲷的目的条带序列如下：
[0052]
tctatggtttgcagagttgcgccgtaaacattaattttggtaagtgggc
[0053]
tgcttaagtcaatgtgaagtatatagccaaaatgctatggtaacagtttcaa
[0054]
ccaaaaacaaacaaaagaaaagggtaaaatatttctcctgatcttgttaat
[0055]
cttatacangagtctcgatgtaattttctttactttactgtattgaatattaca
[0056]
gttttctgctgtaccaacccaatttccctagaggggcattaaggtttaatca
[0057]
tatcctcgacataatactaatctaacattaagaaactaaaattaaacaaaaa
[0058]
tgaacaatttgatgatgataaccactgtgtatcaacatcaaatgaccagttt
[0059]
gaaacatgttaattgattctctctgcaggtcttgaaggtttgatagcgctgc
[0060]
tatttatatggcacaactgttcatttgctgacaaggacaaatcgccatccat
[0061]
caggattcaat(seq id no：5所示)。
[0062]
引物1扩增平鲷的目的条带序列如下：
[0063]
tctatggtttgcagagttgcgccgcacatattcattctggtgattggct
[0064]
tgcttaagtcaatgtaaaagtatatagccaaaatgctctggtaaacatttca
[0065]
accaaaaacaaacaaaagaaaaggctaaaatatttctcctgatcttgttaa
[0066]
ttctatacactagtctagaggtcattttcttccttttactgtattgagtattac
[0067]
agttttctgctgcaccaacccaatttccctaggggggtattaaggtttaatc
[0068]
atatcctcgatataatactaatgtagcatttagaaactaaaatcaagcaaaa
[0069]
atgaacaatgtgatgaccactgcgtatcatcatcaaatggccagtttaaaac
[0070]
ataatactaatatataatactaatgtagcatttagaaactaaaatcaagcaaa
[0071]
aatgaacaatgtgatgaccactgcgtatcatcatcaaatggccagtttaaa
[0072]
acatgttaatagattctctctgcaggtcctgaaagtttgatagcgctgctat
[0073]
tcaactgctcatttgctgacaaggacaaatgatcgccatccatcaggattc
[0074]
aat(seq id no：6所示)。
[0075]
如图2所示(左边序号1-12代表12个黄鳍鲷个体，右边序号1-12代表12个平鲷的个体)，采用引物2进行pcr扩增时，当电泳图谱显示出大小约为494bp的目的条带(seq id no：7所示)，则鉴定为黄鳍棘鲷，当电泳图谱显示出大小约为1025bp的目的条带(seq id no：8所示)，则鉴定为平鲷。
[0076]
引物2扩增黄鳍棘鲷的目的条带序列如下：
[0077]
aacaagcgaggacatcactgcggtcggcagagaaaataatcagcacattc
[0078]
attgttaatataaacaagaatcatttgttacagccctctgagtcaaaggaac
[0079]
cttctgaaatctgaagtaccttgtatctttaatccaatctcaaacttaatagc
[0080]
acctttaaatcacacctgtattgatcaactcttggcttgtactattctgtaca
[0081]
tacttgttgttatatagatttgatcttccgagccgtttccatccataaatgat
[0082]
caaaaataaaaggtttatcattttaccgtttccagtgacatgagaatattaa
[0083]
ccttcgtgtgaatgtcatgtgatgttttcaacacacatgaagatacatacat
[0084]
ttctaaggaatgctggattgaatcagccggaataatgaaataacaggaggt
[0085]
cattttttgcagcgtgttagtggtgcagcttcgcttcagagcgctgacggg
[0086]
gaaaacgtgagcgccacgtgcaacatc(seq id no：7所示)。
[0087]
引物2扩增平鲷的目的条带序列如下：
[0088]
aacaagcgaggacatcactgcagtcgacagggagaataatcagcaca
[0089]
tcattgctcatataaataataagcgtttgttacaaccctaaaatcacactaa
[0090]
acggctggacaagtggaggttgctatttagggttaaaactgattactgatg
[0091]
tcctgacagtcacttcatattattcacataaaaatcaagagctgcactgagg
[0092]
tgtagctcctgtagttttagggctcgactgcgcttaatcatgaagtttactg
[0093]
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[0094]
aatttaaaaattgtaattgtcaccattcatatgaagccgaatgtgttactag
[0095]
ctgtccctgtttgcagtgtaaacatggacgtgcttacaactaaaactggat
[0096]
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[0097]
tgcaggtgaaggaaccgtctgaagttatccaagttatttttgacacgaaat
[0098]
gcttcctcattttatcatcttcaaccagaatctttggatttacacttttgggt
[0099]
gaattgatccttctgaattcaattgaattctaagataagttatttgtcattca
[0100]
tcatttctttcctctttctttctttctttctttctttcttcatcttgtatcttta
[0101]
cacaaatttcaaacttcatatcacctttaaatcacacctgtattgatcaact
[0102]
cttggctcgtacgattctgtacatactgggtgttttatagcttagatcttccg
[0103]
agccatctccatccgtaagtgatcaaaaataaaaagtttcatcattttaccg
[0104]
tttccagcaacatgagaatattaactgtcgtgtgacattttcaacacacatg
[0105]
aagatatgtacatttctaaagaatcctctattgaatcagtcggaataatgaa
[0106]
attacagtaagtcattttttgcagcgtgttngtggtgcagcgtctcctcaga
[0107]
gcgctgacggggaaaacgtgagcgccacgtgcaacatc(seq id no：8所示)。
[0108]
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

技术特征：
1.一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物，其特征是：所述引物为引物1或引物2，所述引物1包括正向引物1f和反向引物1r，所述正向引物1f的核苷酸序列如seq id no：1所述，所述反向引物1r的核苷酸序列如seq id no：2所述；所述引物2包括正向引物2f和反向引物2r，所述正向引物2f的核苷酸序列如seq id no：3所述，所述反向引物2r的核苷酸序列如seq id no：4所述。2.一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的试剂盒，其特征是包括权利要求1中所述的引物。3.一种鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的方法，其特征是包括以下步骤：以待测样品的基因组dna为模板，利用权利要求1中的引物进行pcr扩增，将pcr扩增产物进行电泳，根据电泳结果判定待测样品为黄鳍棘鲷或平鲷。4.根据权利要求3所述的鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的方法，其特征是：采用权利要求1中的引物1进行pcr扩增时，当电泳图谱显示出大小为477bp的目的条带，则鉴定为黄鳍棘鲷；其电泳图谱显示出大小为572bp的目的条带，则鉴定为平鲷。5.根据权利要求3所述的鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的方法，其特征是：采用权利要求1中的引物2进行pcr扩增时，当电泳图谱显示出大小为494bp的目的条带，则鉴定为黄鳍棘鲷，当电泳图谱显示出大小为1025bp的目的条带，则鉴定为平鲷。6.根据权利要求3所述的鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的方法，其特征是：pcr扩增时，采用的pcr扩增体系包括：模板dna90～110ng、taq酶0.15μl、上下游引物各0.15μl，去离子水补齐至10μl。7.根据权利要求3所述的鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的方法，其特征是：pcr扩增时，pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50～60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。8.权利要求1所述引物或权利要求2所述试剂盒在鉴别黄鳍棘鲷和平鲷中的应用。9.权利要求3-8任一项所述方法在鉴别黄鳍棘鲷和平鲷中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物，所述引物为引物1或引物2，所述引物1包括正向引物1F和反向引物1R，所述正向引物1F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物1R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物2包括正向引物2F和反向引物2R，所述正向引物2F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物2R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明还公开了一种鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的试剂盒和方法，以及上述引物、试剂盒和方法在鉴别黄鳍棘鲷和平鲷中的应用。黄鳍棘鲷和平鲷中的应用。黄鳍棘鲷和平鲷中的应用。


技术研发人员：朱克诚 张殿昌 刘俊 张楠 郭华阳 刘宝锁 杨静文
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院南海水产研究所
技术研发日：2022.12.28
技术公布日：2023/8/9