一种基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条及检测新型冠状病毒受体结合区蛋白的方法

sars-cov-2rbd真核表达载体，转染至hek293细胞，ni-nat柱纯化表达培养基上清，bca试剂盒测定纯化蛋白浓度，sds-page、elisa测定表达rbd蛋白的纯度及生物学活性。
7.根据rbd蛋白的空间结构，选用针对rbd蛋白不同表位的供体微球-单域重链抗体w、受体微球-单域重链抗体q，优化密码子，构建原核表达载体，转化bl21(de3)，ni-nat柱纯细胞破碎上清，bca试剂盒测定纯化蛋白浓度，sds-page、elisa测定所表达的单域重链抗体的纯度及生物学活性。其中的单域重链抗体w、q序列分别为：seq id no:1、seq id no:2。
8.取一定量的供体/受体微球稀释于至mes溶液中，使用edc/nhs活化微球表面的羧基；投入单域重链抗体w、q，使得单域重链抗体w、q分别偶联至供体/受体表面；bsa封闭多余位点，保存液重悬制备的纳米探针，4℃保存。
9.试纸条由nc膜、样品垫、结合垫、吸水垫、pvc底板组成；nc膜放置真空干燥箱烘干，将nc膜粘贴于底板上，样品垫压结合垫、结合垫压nc膜、吸水垫压nc膜约2-6mm，真空干燥箱烘干；将制备的受体微球-单域重链抗体q、抗his单克隆抗体分别划线于检测线与质控线，烘干后，按照试纸条的尺寸切割试纸条，将供体微球-单域重链抗体w点加于结合垫，4℃备用。
10.pbs缓冲液将制备rbd蛋白稀释成不同浓度的，投入一定浓度pbst，吸取一定体积rbd稀释蛋白点样于试纸条的样品垫上，将试纸条静置一段时间后；在365nm紫外灯照射下，观察t、c线检测结果，评估试纸条的检测灵敏度。
11.进一步的，上述步骤1)和2)中，真核表达载体的转染方法为脂质体转染法，原核表达载体的转化方法为钙转法。
12.进一步的，上述步骤3)中，mes浓度为0.01-0.1m；edc/nhs浓度为1-20mg/ml；bsa的浓度为1-3％。
13.进一步的，上述步骤4)中，切割试纸条的尺寸为4-6
×
60-100mm；检测线与质控线的间距为2-6mm；检测线上受体微球-单域重链抗体q划线浓度为0.1-1mg/ml；质控线上抗his单克隆抗体的浓度为0.1-1mg/ml；供体微球-单域重链抗体w浓度为0.1-1mg/ml。
14.进一步的，上述步骤5)中，rbd蛋白的稀释浓度为0.01-1000ng/ml；pbst的浓度为0.01-0.1％；稀释样品的点样体积为30-100μl。
15.有益效果：
16.1、相比新型冠状病毒检测金标准-rt-pcr法，本发明提供的荧光层析试纸条灵敏度高、操作检测、检测速度快、可适用多场景检测，在新型冠状病毒的人群大规模筛查中具有广阔的应用前景。
17.2、相比传统的双单抗夹心法检测大分子蛋白，本发明提供的配对单域重链抗体易制备、易修饰、成本低、批间差异低、配对抗体易筛选，可有效提高检测体系的精确性及准确性、减少检测试剂盒的批间差异、降低检测检测试剂盒的制作成本。
18.3、相比市面销售的胶体金试纸条及其他新型冠状病毒检测荧光试纸条，本发明基于荧光能量共振转移为检测体系提供检测信号，进一步提高了新型冠状病毒试纸条的检测灵敏度，为新型冠状病毒病毒的快速检测提供了更可靠的证据。
附图说明
19.图1：配对单域重链抗体的sds-page及elisa验证。
20.图2：夹心elisa鉴定配对单域重链抗体与新型冠状病毒rbd蛋白结合性能。
21.图3：供体微球的扫描电镜图。
22.图4：受体微球的透射电镜图。
23.图5：不同单域重链抗体w投入量，供体微球的表面zeta电位变化。
24.图6：不同单域重链抗体q投入量，受体微球的表面zeta电位变化。
25.图7：免疫层析试纸条检测新型冠状病毒rbd蛋白标准曲线的建立。
26.图8：免疫层析试纸条特异性的验证。
具体实施方案
27.为了使本发明更加容易理解，结合附图及实施例对本发明做出进一步的解释说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述实例为本发明一部分实施例，而不是全部实施例。
28.本发明所有实施例中所用材料、试剂及配方如下：
29.主要实验材料：
30.受体微球、供体微球(苏州海狸生物科技有限公司)，抗his标签单克隆抗体(英国abcam公司)，中国仓鼠卵巢细胞(cho)、受体结合区蛋白单域重链抗体、受体结合区蛋白由本实验室制备。
31.主要试剂：
32.脂质体3000(赛默飞世尔生物科技有限公司)，脱脂奶粉、四甲基联苯胺、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(上海生工生物科技有限公司)，1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺(edc)、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)、牛血清白蛋白(bsa)、吗啉乙磺酸(mes，美国sigma公司)。
33.主要试剂配方：
34.1、lb平板培养基：称取25g lb肉汤，18g固体琼脂溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15min；
35.2、buffera：称取29.25g nacl，4.44g磷酸钠溶解于900ml超纯水中，超声30s后定容至1l，ph调至7.2。
36.3、2m硫酸(h2so
4)
：取15ml h2so4，缓慢地边搅拌边加入超纯水中，定容至200ml。
37.4、保存液：称取0.785g tris，0.0053g氯化钠(nacl)，1g bsa，0.2％nan3。
38.下面结合附图对本发明的具体的实施例进行详细描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
39.首先通过重组蛋白表达手段制备新型冠状病毒rbd蛋白、重链单域抗体，验证制备蛋白活性；将单域重链抗体与受体、供体微球偶联，供体微球-重链单域抗体w点加在结合垫上，荧光微球-重链单域抗体q、抗组氨酸(his)单克隆抗体均匀划线于nc膜上的t线、c线；当样品中存在新型冠状病毒rbd蛋白，t线上荧光染料接收到激发态的能量转移给荧光微球，试纸条出现两条荧光线，结果为阳性；反之，当新型冠状病毒rbd不存在时，只有质控线显示荧光，此时试纸条出现一条荧光线，结果为阴性；如果质控线不显荧光，则表明该试纸条检测无效。
40.实施例1
41.新型冠状病毒rbd蛋白载体构建及真核表达，具体步骤如下：
42.1)根据哺乳动物密码子偏好性，优化rbd蛋白序列，构建pcdna-rbd真核表达载体。
43.2)复苏cho细胞，投入含有7ml dmem/f12培养基的t25细胞培养平皿中，37℃、5％二氧化碳(co2)静置培养过夜。
44.3)传两代之后，t 25细胞培养瓶中细胞转移至6孔板中，当细胞铺满瓶底面积为70％-90％，按照脂质体3000转染说明书，将pcdna-rbd转染至cho细胞中，并设置空白、阳性对照。
45.4)转染后24h，用倒置荧光显微镜拍照估算转染效率，继续培养2-4天，吸取细胞培养上清，8000-10000rpm离心过夜菌液，过ni-nat柱纯化。
46.5)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、酶连免疫吸附实验(elisa)检测表达蛋白纯度、生物学活性bca测定蛋白浓度，超滤除去咪唑分子。
47.实施例2
48.单域重链抗体载体构建及原核表达，具体步骤如下：
49.1)根据原核密码子偏好性，优化单域重链抗体w、q的序列，构建pet-单域重链抗体表达载体。
50.2)将bl21(de3)划线于lb平板，过夜培养；挑取单菌落接种于3-7ml lb培养基，过夜培养。
51.3)8000-10000rpm离心过夜菌液，0.1m cacl2处理bl21(de3)，将菌制备成感受态形式。
52.4)将pet-单域重链抗体载体转化至bl21，涂布lb/amp固体平板，挑起单菌落，接种3-7ml lb培养基，过夜培养。
53.5)按照1-3％接种量，接种80-120ml lb培养基，待菌生长至对数生长期，加入0.1-1m异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，24℃过夜培养。
54.6)8000-10000rpm离心过夜菌液，180-220w破碎表达菌体，ni-nat纯化表达上清，sds-page、elisa检测表达蛋白纯度、生物学活性bca测定蛋白浓度，超滤除去咪唑分子。如图1所示，表达的单域重链抗体w、q具有优良的生物学活性。
55.实施例3
56.elisa法验证配对单域重链抗体检测rbd蛋白的性能，具体步骤如下：
57.1)每孔取50-200μl的浓度为1-3μg/ml单域重链抗体w包被至酶标板，37℃封闭2h。
58.2)0.05％pbst洗板，加入3-5％脱脂牛奶封闭，37℃孵育1-2h。
59.3)0.05％pbst洗板，加入0-10ng/ml的新型冠状病毒rbd蛋白，37℃孵育40-60min。
60.4)0.05％pbst洗板，加入1-5μg/ml单域重链抗体q，37℃孵育40-60min。
61.5)0.05％pbst洗板，加入1：2000-5000hrp酶标记的抗strep ii单克隆抗体，37℃孵育40-60min。
62.6)0.05％pbst洗板，加入tmb显色液，显色一段时间后，2m h2so4终止，测定od450 nm吸光值。
63.如图2所示，重链单域抗体w、q做为配对抗体，检测新型冠状病毒rbd蛋白具有较高的检测灵敏度。
64.实施例4
65.单域重链抗体偶联至微球的表面，具体步骤如下：
66.1)如图3-4所示，高分辨透射电镜(tem)显示供体微球和受体微球的粒径为200nm。吸取20-40μl供体/受体微球，超声清洗仪超声1-5min，加入500-1000μlmes溶液，加入5-10μl edc和5-10μlnhs，10-40rpm、25℃在旋转混合仪反应20-40min。
67.2)15000-20000rpm离心20-30min，pbs缓冲液冲洗一次后重悬，分别向受体/供体微球加入100-150μg单域重链抗体w、q，10-40rpm、25℃在旋转混合仪反应20-40min。
68.3)称取0.01-0.03g的bsa溶解于受体/供体微球中，进行封闭。
69.4)15000-20000rpm离心20-30min，pbs缓冲液冲洗2次后，使用1ml保存液进行重悬。在偶联之后，使用动态光散射仪测量材料表面zeta电位。如图5-6所示，偶联之后材料表面的zeta电位下降，表面单链重域抗体成功偶联至材料表面。
70.实施例5
71.基于供体微球-单链重域抗体w、受体微球-单链重域抗体q构建了检测新型冠状病毒rbd蛋白的免疫荧光试纸条，具体步骤如下：
72.1)将nc膜先干燥，按照pvc底板在底部，样品垫，结合垫、nc膜、吸水垫从左往右的顺序组装好试纸条。
73.2)喷金划膜仪吸取受体微球-单链重域抗体q、抗his单克隆抗体分别划于t线和c线，37℃干燥1-3h。
74.3)试纸条切割机切割试纸条，按照2-6mm宽度的规格切割试纸条，在试纸条的结合垫上点加供体微球-单链重域抗体w，干燥1-3h。
75.4)使用pbs缓冲液，将新型冠状病毒rbd蛋白稀释为0.01-1000ng/ml，点50-100μl稀释液加入组装好的试纸条的样品垫上，滴加人血清、bsa、ova做为阴性对照、pbs做为空白对照，等待10-20min，根据微球的说明书指示，680nm的激发光下观察检测线和质控线的荧光情况。如图7-8所示，基于重链单域抗体试纸条的检测新型冠状病毒rbd蛋白的最低检测线为0.1ng/ml，呈现良好的检测特异性。
76.以上所述实施例为本发明的实施方法，对于领域内的技术人员，在不脱离本明构思前提下，可以做出若干的应用及改进，但都属于本发明的保护范围。
77.seq id no:1
78.ccatggatcaccatcatcatcatcatcaccaccaagtacagctagttgaatcaggtggagggttggttcaggcaggcggctcgctgcgtttgagctgtgcggtgtccggtgccggtgcgcaccgtgttggttggtttcgtcgcgcaccgggtaaagagagagaattcgtggcggcgatcggcgcgagcggcggtatgaccaactatctggacagcgtgaagggccgtttcaccattagccgtgacaacgccaagaacaccatctacctgcaaatgaattctctgaaaccgcaggataccgcagtctattactgcgctgcgcgcgatattgagacggctgaatatatctactggggtcaaggtactcaggttaccgtaagctccgactacaaagatgatgacgataaataataactcgag
79.seq id no:2
80.ccatggatcaccatcatcatcatcatcaccaccacgtacaactagttgaatcaggtggagggttggttcaggcgggtggcagcctgcgtctgagctgtgctgcgagcggtggtacgttcaccaccttccgcatggcatggtttcgccagaccccgggcaaagaaagagagttcgtggccgcgtcctcttggggctttgttaattatgcggatccggtaaaaggtcgttttactatcagccgtgataacgcaaagaacaccgtctacctggaaatgagctccctcaagaccgaggacaccgctgtgtattactgcgccgcgcgtaacccgggcacgggtcaatatgactactggggccaaggtacacaggttaccgtgtcttcggactacaaagatgatgacgataaataataactcgag。

技术特征：
1.一种基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包含pvc底板、样品垫、结合垫、nc膜、吸水垫，供体微球-单域重链抗体w点样于结合垫，受体微球-单域重链抗体q、抗his单克隆抗体分别划线于检测线与质控线。2.根据权利1所述的基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条，其特征在于，靶标为新型冠状病毒受体结合区蛋白。3.根据权利1所述的基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条，其特征在于，其中的单域重链抗体w、q序列分别为：seq id no:1、seq id no:2。4.权利要求1-3任一项所述的基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条检测新型冠状病毒受体结合区蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)按照哺乳动物的密码子偏好性，构建了pcdna-rbd真核表达载体，转染至cho细胞，ni-nat柱纯化表达培养基上清，bca试剂盒测定纯化蛋白浓度，sds-page、elisa鉴定蛋白的纯度、生物学活性；2)根据rbd蛋白的空间结构，选用针对rbd蛋白不同表位的单域重链抗体-单域重链抗体w、单域重链抗体q，表达载体并转化至bl21，ni-nat柱纯细胞破碎上清，bca试剂盒测定纯化蛋白浓度，sds-page、elisa鉴定单域重链抗体的纯度、生物学活性；3)取一定量的供体/受体微球稀释于至mes溶液中，edc/nhs活化微球表面的羧基；投入单域重链抗体w、q，使得单域重链抗体w、q分别偶联至供体/受体表面；bsa封闭多余位点，保存液重悬制备的纳米探针，4℃保存；4)nc膜放置真空干燥箱烘干，将nc膜粘贴于底板上，样品垫压结合垫、结合垫压nc膜、吸水垫压nc膜约2-6mm，真空干燥箱烘干；将制备的受体微球-单域重链抗体q、抗his单克隆抗体分别划线于检测线与质控线，烘干后，按照试纸条的尺寸切割试纸条，将供体微球-单域重链抗体w点加于结合垫，4℃备用；5)pbs缓冲液将制备rbd蛋白稀释成不同浓度的，投入一定浓度pbst，吸取一定体积rbd稀释蛋白点样于试纸条的样品垫上，将试纸条静置一段时间后；在680nm紫外灯照射下，观察t、c线检测结果，评估试纸条的检测灵敏度。5.根据权利4所述的基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条检测新型冠状病毒受体结合区蛋白的方法，其特征在于，真核表达载体的转染方法为脂质体转染法，原核表达载体的转化方法为钙转法。6.根据权利4所述的基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条检测新型冠状病毒受体结合区蛋白的方法，其特征在于，mes浓度为0.01-0.1m；edc/nhs浓度为1-20mg/ml；bsa的浓度为1-3％。7.根据权利4所述的基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条检测新型冠状病毒受体结合区蛋白的方法，其特征在于，切割试纸条的尺寸为4-6
×
60-100mm；检测线与质控线的间距为2-6mm；检测线上受体微球-单域重链抗体q划线浓度为0.1-1mg/ml；质控线上抗his单克隆抗体的浓度为0.1-1mg/ml；供体微球-单域重链抗体w浓度为0.1-1mg/ml。8.根据权利4所述的基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条检测新型冠状病毒受体结合区蛋白的方法，其特征在于，rbd蛋白的稀释浓度为0.01-1000ng/ml；pbst的浓度为0.01-0.1％；稀释样品的点样体积为30-100μl。

技术总结
一种基于配对单域重链抗体的免疫层析试纸条及检测新型冠状病毒受体结合区蛋白的方法，属于免疫层析检测领域。本发明提供的免疫荧光试纸条包含PVC底板、样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫，供体微球-单链重域抗体W点样于结合垫，受体微球-单域重链抗体Q、抗His单克隆抗体分别划线于检测线与质控线；哺乳动物细胞制备RBD蛋白、原核表达制备单域重链抗体；将抗体分别偶联至供体/受体微球表面，0.01-1000ng/mL新型冠状病毒RBD蛋白上样制备的试纸条，评估试纸条的灵敏度。本发明提供的免疫荧光试纸条可快速、灵敏检测新型冠状病毒受体结合区蛋白，与市售的胶体金试纸条检测新型冠状病毒抗原相比，有着更高的灵敏度、更好的检测精确性及稳定性、更低的检测成本。更低的检测成本。更低的检测成本。


技术研发人员：罗义 胡文进 毛大庆 袁青彬 蔺怀 刘奕辰
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2022.08.25
技术公布日：2023/8/9