用于检测SARS-CoV-2抗原的高通量免疫测定和方法与流程

用于检测sars-cov-2抗原的高通量免疫测定和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2021年10月28日提交的美国临时专利申请63/106,830的权益，该美国临时专利申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开总体上涉及用于检测病毒抗原的免疫测定和相关方法。更具体地，本公开涉及使用自动化和半自动化高通量免疫测定进行sars-cov-2病毒抗原检测。


背景技术：

4.在2020年3月11日，世界卫生组织宣布冠状病毒病(sars-cov-2，又名covid-19)爆发大流行。近年来，它已传播到全球超过216个国家和地区。快速病毒检测是防止病毒传播蔓延的最重要工具。抗原检测使流行病学家和公共卫生当局能够高度自信地确定那些即使在无症状时也能够传播疾病的个体。然而，对易感人群中数以万计的疑似携带者、有症状者和无症状者进行检测，是使用人工方法和快速测试(例如侧向流动设备)无法完成的。因此，迫切需要使用自动化和半自动化免疫测定设备的高特异性、高灵敏度免疫测定，所述自动化和半自动化免疫测定设备为例如ortho clinical diagnostics(crimson u.s.assets llc limited liability company delaware 1001us route 202raritan new jersey 08869的注册商标)免疫诊断产品。


技术实现要素：

5.本公开提供了可用于检测临床样品中的sars-cov-2抗原的免疫测定。
6.因此，本文公开了用于高通量测试样品中sars-cov-2核衣壳的存在的方法，所述方法包括：提供能够执行高通量测定的免疫测定系统；使患者样品与识别sars-cov-2核衣壳的捕获抗体、在不同于捕获抗体的位置处识别sars-cov-2核衣壳的检测抗体以及用于检测包含捕获抗体、检测抗体和sars-cov-2核衣壳的复合物的装置；以及检测包含捕获抗体、检测抗体和sars-cov-2核衣壳的复合物；其中所述反应和检测步骤在免疫测定系统中执行。
7.本文还公开了用于在高通量免疫测定系统中高通量测试患者样品中sars-cov-2核衣壳的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：识别sars-cov-2核衣壳的捕获抗体和与所述捕获抗体缔合的固体载体(solid support)；在与捕获抗体不同的位置处识别sars-cov-2核衣壳的检测抗体；用于检测包含捕获抗体、检测抗体和sars-cov-2核衣壳的复合物的装置；以及用于执行所述测定的使用说明。
8.在一些实施方式中，能够执行高通量测定的免疫测定系统是ortho clinical diagnostics 设备。
9.在一些实施方式中，捕获抗体与固体载体缔合。在一些实施方式中，捕获抗体是特异于sars-cov-2核衣壳的单克隆抗体。在一些实施方式中，捕获抗体是兔单克隆抗体。在一
些实施方式中，检测抗体是特异于sars-cov-2核衣壳的单克隆抗体。在一些实施方式中，检测抗体是小鼠单克隆抗体。
10.在一些实施方式中，捕获抗体和检测抗体不与除sars-cov-1以外的冠状病毒发生交叉反应。在一些实施方式中，检测抗体呈缀合物，其中每个缀合物包含约100个辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)分子和25个免疫球蛋白分子。
11.在一些实施方式中，患者样品是鼻咽拭子或前鼻拭子。
12.当结合附图考虑时，根据随后的描述，本公开的附加特征和优点将变得显而易见。
附图说明
13.将参考附图以示例方式描述本发明的非限制性实施方式，所述附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示出的每个相同或几乎相同的部件通常由单个数字表示。为了清楚起见，在不需要进行说明以使本领域的普通技术人员理解本发明的情况下，没有在每个附图中标记每个部件，也没有示出本发明的每个实施方式的每个部件。
14.图1描绘了本公开的一般sars-cov-2抗原测定结构。
具体实施方式
15.本文公开了一种用于检测患者样品中sars-cov-2病毒的存在的高通量测定，所述患者样品包括来自感染或疑似感染与被称为covid-19的疾病相关联的病毒sars-cov-2的患者的鼻咽拭子、鼻拭子样品，例如前鼻拭子样品和唾液样品。
16.高通量意指在生物和化学领域中所用的使用机器人、数据处理/控制软件、液体处置设备和灵敏检测器、高通量筛选的方法允许临床实验室科学家在短时段(例如一小时或一天)内快速进行数百、数千甚至数百万的化学、遗传或药理学测试。通过这种过程，人们可以快速鉴定出疾病过程中所涉及的活性化合物、抗体或基因。
17.在本公开的实施方式中，在高通量测定设备例如系统(ortho-clinical diagnostics,raritan,nj)中执行测定。参见美国专利号7,250,303，该美国专利的针对其所教导的相关免疫测定设备和方法的全部内容以引用方式并入本文。高通量设备的非限制性示例包括xt 7600和5600集成系统、3600免疫诊断系统以及它们的等同物。
18.一种测试样品中的sars-cov-2的方法涉及使用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,rt-pcr)来检测sars-cov-2核糖核酸(ribonucleic acid,rna)的存在。另一种方法是检测与病毒相关联的蛋白质抗原。在开发用于其他呼吸道病毒(例如流感、rsv或sars-cov-1)的测试方面有经验的诊断公司已经引入了几种此类测试。抗原测试通常检测核衣壳抗原，因为所述核衣壳抗原是独特的，对突变相对稳定的，并且以大拷贝数存在的。拷贝数(每个病毒粒子中存在的蛋白质的数量)被认为是每病毒约1000个核蛋白分子。核蛋白也被称为核衣壳蛋白。
19.上呼吸道试样，例如鼻咽拭子或前鼻拭子，可用于诊断测试。在一些实施方式中，唾液样品也可用于检测sars-cov-2抗原。
20.本发明人已经开发了一种测试，所述测试包括裂解缓冲液手动预处理步骤，之后
是在使用化学发光检测的免疫诊断分析仪上进行测试。测定方案利用两步免疫测定来在病毒已用预处理方案裂解后检测抗原。所述免疫测定使用包含捕获抗体和检测抗体的抗体对，这两种抗体都特异于sars-cov-2核蛋白。在某些实施方式中，这两种抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以来自选自小鼠、大鼠、山羊、兔的物种或可以产生单克隆抗体的任何其他物种。在一些实施方式中，捕获抗体是兔抗sars-cov-2核蛋白单克隆抗体，并且检测抗体是小鼠抗sars-cov-2核蛋白单克隆抗体，然而相应抗体所来源于的物种是非限制性的。在一些实施方式中，抗体由重组表达系统产生。在一些实施方式中，抗体可与sars-cov-1冠状病毒发生交叉反应，但不与其他冠状病毒发生交叉反应。
21.测定试剂的特征是使用聚辣根过氧化物酶(hrp)检测抗体缀合物来放大检测信号。据估计每个缀合物分子含有约100个hrp分子和25个免疫球蛋白分子，因此每个结合事件生成的信号为标准hrp缀合物信号的高达20倍。典型hrp缀合物含有共价附接至2-5个hrp分子的一个免疫球蛋白分子。
22.目前公开的测定是涉及两阶段反应的免疫测定技术。在第一阶段中，样品中存在的sars-cov-2核衣壳抗原与包被在微孔上的单克隆抗sars-cov-2结合。通过洗涤去除未结合的样品。在第二阶段中，将hrp标记的单克隆抗sars-cov-2添加到缀合物试剂中。所述缀合物特异性地结合在第一阶段中捕获在孔上的任何sars-cov-2核衣壳。通过后续洗涤步骤去除未结合的缀合物。通过发光反应测量结合的hrp缀合物。向孔中添加含有发光底物(鲁米诺衍生物和过酸盐)和电子转移剂的试剂。结合的缀合物中的hrp催化鲁米诺衍生物的氧化，从而产生光。电子转移剂(经取代的乙酰苯胺)增加了所产生的光的水平并延长了光的发射。随着样品中存在的sars-cov-2抗原量的增加，信号截止数值将增大。
23.实施例1.测定程序
24.测定程序在下文和图1中描述。
25.1.从患者收集鼻或鼻咽拭子样品，并保藏在装有1-3ml病毒运送介质(viral transport medium,vtm)的试管中以便短期存储达至多三天。
26.2.通过将400μl的在拭子样品周围的vtm流体与100μl的10x裂解缓冲液组合，预处理样品以裂解病毒。将vtm/裂解缓冲液混合物涡旋，然后置于分析仪上进行立即测试。
27.3.在分析仪上，执行以下方案。
28.a.将80μl样品(4份vtm+1份10x裂解缓冲液)和20μl的测定试剂(含有ph缓冲液和蛋白质的稀释剂)在经包被的微孔中组合
29.b.在37℃下孵育30min。
30.c.抽吸孔并洗涤。
31.d.添加125μl的hrp缀合物试剂(含有与含蛋白质的ph缓冲液中的检测抗体缀合的聚hrp)。
32.e.在37℃下孵育8min。
33.f.添加100μl的信号试剂(50μl的sr-a加50μl的sr-b)
34.g.孵育5min，然后在光度计中读取信号。
35.经包被的微孔包括链霉亲和素包被的孔，所述孔已经用生物素标记的针对sars cov-2核蛋白的捕获抗体外包被。外包被(overcoat)步骤应用生物素缀合物浓度为1mg/kg
的140μl/孔的包被溶液。在孵育过夜后，将孔进行洗涤，然后用蛋白质-糖溶液(protein-sugar solution,tssb)外包被，然后干燥并装入试剂包中。
36.该测定使用在-20℃下冻存的在含3％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,pbs)中配制的重组sars-cov-2核衣壳抗原进行校准。
37.实施例2.检测限的确定
38.通过评估添加到合并鼻洗液中的不同稀释度的热灭活sars-cov-2病毒来确定检测限(limit of detection,lod)。将50μl的病毒粒子溶液添加到干拭子中，然后将所述拭子放入2ml的运送介质中。使用sars-cov-2抗原测试对带有洗脱的病毒粒子的运送介质进行重复测试(n＝20)。lod被定义为最低病毒浓度，在该最低病毒浓度下，20个平行测定中至少有19个平行测定生成反应性结果。对七种运送介质类型执行测试，并且所得lod范围为5.0
×
102tcid
50
(中值组织培养感染剂量)/ml至3.0
×
103tcid
50
/ml(表1)。
39.表1.lod确定
40.运送介质tcid
50
/mlcdc病毒运送介质5.0
×
102copan通用运送介质5.0
×
102hardy病毒运送介质1.5
×
103flextrans运送介质3.0
×
103who病毒运送介质7.6
×
102盐水(pbs和0.9％nacl)1.5
×
10341.实施例3.鼻咽试样的临床性能特性
42.使用来自疑似已经在症状发作的七天内感染sars-cov-2病毒的患者的残留样品评估sars-cov-2抗原测试的临床性能特性。如下在两次临床试验中收集样品：
43.表2.患者特性
[0044][0045][0046]
鼻咽样品在收集时间与测试时间之间冻存。将fda紧急使用授权的用于检测sars-cov-2的高灵敏度实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,rt-pcr)测定用作用于这些研究的比较法。
[0047]
由对rt-pcr测试结果不知情的操作员执行测试。在测试的每一天都执行使用sars-cov-2抗原对照进行外部对照测试。sars-cov-2抗原
测试的性能是用从疑似为covid-19的个体有症状患者(在发作的7天内)收集的105份鼻咽试样建立的，并与配对np拭子上的rt-pcr进行比较。
[0048]
表2a.针对比较法在症状发作的7天内收集的rt-pcr阳性和阴性鼻咽样品中的sars-cov-2抗原性能-研究1
[0049][0050]
表2b.按症状发作后的天数细分的阳性结果—研究1
[0051][0052][0053]
表3a.针对比较法在症状发作的7天内收集的rt-pcr阳性和阴性鼻咽样品中的sars-cov-2抗原性能-研究2
[0054][0055]
*一个非反应性结果在替代rt-pcr方法上也是阴性的
[0056]
**一个反应性结果在替代rt-pcr方法中也是阳性的
[0057]
表3b.按症状发作后的天数细分的阳性结果—研究2
[0058][0059][0060]
收集并评定sars-cov-2抗原测试的性能以及根据比较法循环阈值(ct)计数分层的阳性结果，以更好地了解测定性能与循环阈值的相关性。
[0061]
表4.
[0062][0063]
ct值在rt-pcr测定之间没有标准化，并且不能在测定之间进行比较。ct值不应用于确定患者的病毒载量、一个人的传染性可为如何、或一个人何时可以解除隔离或检疫。因此，来自sars-cov-2抗原测试的阴性结果并不能证明个体没有传染性，并且不应将其用于做出隔离或感染控制决策。所有阴性结果都是针对sars-cov-2诊断推定的，并且可能需要用分子sars-cov-2测定来确认。
[0064]
实施例4.前鼻试样的临床性能特性
[0065]
使用来自疑似已经在症状发作的七天内感染sars-cov-2病毒的患者的残留样品评估sars-cov-2抗原测试的临床性能特性。样品是从41名女性患者和111名男性患者收集的。六个样品来自小于21岁的患者，116个样品来自21岁至60岁的患者，并且30个样品来自大于60岁的患者。在收集时间与测试时间之间，将鼻腔样品冻存。将fda紧急使用授权的用于检测sars-cov-2的高灵敏度rt-pcr测定用作用于此研究的比较法。
[0066]
由对rt-pcr测试结果不知情的操作员执行测试。在测试的每一天都执行使用sars-cov-2抗原对照进行外部对照测试。sars-cov-2抗原测试的以下性能是用从疑似为covid-19的个体有症状患者(在发作的7天内)收集的105份鼻试样建立的，并与配对前鼻拭子上的rt-pcr进行比较。与np拭子上的配对rt-pcr相比的性能也列于以下表5a至表5b中。
[0067]
表5a.针对比较法在症状发作的7天内收集的rt-pcr阳性和阴性鼻样品中的sars-cov-2抗原性能
[0068]
[0069]
*两个非反应性结果在替代rt-pcr方法上也是阴性的
[0070]
表5b.按症状发作后的天数细分的阳性结果
[0071][0072][0073]
收集并评定sars-cov-2抗原测试的性能以及根据比较法循环阈值(ct)计数分层的阳性结果，以更好地了解测定性能与循环阈值的相关性(表6)。
[0074]
表6.sars-cov-2抗原测试的性能以及根据比较法循环阈值(ct)计数分层的阳性结果
[0075][0076]
*6个单反应性结果之一在替代rt-pcr方法上也是阴性的实施例5.鼻对比rt-pcr鼻咽结果的临床一致性
[0077]
所公开的与比较rt-pct鼻咽结果相比的一致性列于以下表7a至表7b中。
[0078]
表7a.针对比较法在症状发作的7天内收集的rt-pcr阳性和阴性鼻样品中的sars-cov-2抗原性能
[0079][0080]
*当与np拭子相比时，ppa降低可归因于前鼻拭子中存在的病毒载量较低。当将rt-pcr前鼻样品结果与rt-pcr鼻咽样品结果进行比较时，配对的rt-pcr试样显示出为90.8％的ppa。
[0081]
表7b.按症状发作后的天数细分的阳性结果
[0082][0083]
收集并评定sars-cov-2抗原测试的性能以及根据鼻咽样品中的比较法c)计数分层的鼻样品中的阳性结果，以更好地了解测定性能与不同样品类型中的循环阈值的相关性(表8)。
[0084]
表8.sars-cov-2抗原测试的性能以及根据比较法循环阈值(ct)计数分层的阳性结果
[0085][0086]
实施例6.测定的交叉反应性
[0087]
在sars-cov-2存在和不存在的情况下，使用人为样品评估sars-cov-2抗原测试的潜在微生物交叉反应性。将潜在交叉反应性生物体以针对细菌大于或等于10cfu/ml的浓度和针对病毒大于或等于10pfu/ml的浓度掺加到溶液中。结果汇总在下表9中。
[0088]
表9.
[0089]
[0090][0091]
为了估计在无法进行湿测试的生物体存在下与sars-cov-2病毒的交叉反应性的可能性，使用由国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)管理的基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool,blast)进行计算机模拟分析以评定蛋白质序列同源性程度。
[0092]
在结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、肺孢子菌(p.jirovecii)、或hcov-hku1之间未发现蛋白质序列同源性，因此可以排除交叉反应性。
[0093]
sars-cov-2核衣壳蛋白与sars-cov-1之间的比较显示90.52％的同源性，并且表
明在此测试中将存在显著的交叉反应性。
[0094]
实施例7.不干扰测定的物质
[0095]
评估sars-cov-2抗原测试的干扰。在所测试的化合物中，未发现在表10所示浓度下干扰非反应性和弱反应性样品中测试的临床解释。
[0096]
表10
[0097]
[0098][0099]
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、性质(例如分子量)、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，所述近似值可以根据本发明寻求获得的所需性质而变化。无论如何并非试图限制权利要求书范围的等同物的原则的应用，每个数值参数应至少根据报告的有效位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中列出的数值是尽可能精确报告的。然而，任何数值固有地含有必然由其各自相应的测试测量中存在的标准偏差引起的某些误差。
[0100]
除非在此另外指明或者明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个(种)”、“该”以及类似的指示词应被解释为涵盖单数和复数两者。本文中对值范围的描述仅旨在用作为引用落入该范围的每个单独值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有示例、或例示性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何不要求保护的要素对于本发明的实践为必不可少的。
[0101]
本文公开的本发明的替代要素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与该组中的其他成员或本文中找到的其他要素任意组合地被提及和要求保护。预期组中的一个或多个成员可以出于方便和/或可专利性的原因而被包括在组中或从组中删除。当发生任何此类包括或删除时，本说明书被视为包含经修改的组，从而满足对所附权利要求书中使用的所有马库什组的书面描述。
[0102]
本文描述了本发明的某些实施方式，包括本发明人已知的用于实现本发明的最佳方式。当然，对于本领域普通技术人员来说，在阅读前面的描述后，这些描述的实施方式的变型将变得显而易见。本发明人希望技术人员适当地采用此类变型，并且本发明人希望以
不同于本文具体描述的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的本文所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变型的任何组合。
[0103]
最后，应理解，本文公开的本发明的实施方式是对本发明原理的说明。可以采用的其他修改在本发明的范围内。因此，举例来说而非限制，可以根据本文的教导使用本发明的替代配置。因此，本发明不限于精确地如所示和所述的那些。

技术特征：
1.一种用于高通量测试样品中sars-cov-2核衣壳的存在的方法，所述方法包括：提供能够执行高通量测定的免疫测定系统；使患者样品与识别所述sars-cov-2核衣壳的捕获抗体、在不同于所述捕获抗体的位置处识别所述sars-cov-2核衣壳的检测抗体以及用于检测包含所述捕获抗体、所述检测抗体和所述sars-cov-2核衣壳的复合物的装置；以及检测包含所述捕获抗体、所述检测抗体和所述sars-cov-2核衣壳的所述复合物；其中所述反应和检测步骤在所述免疫测定系统中执行。2.根据权利要求1所述的方法，其中能够执行高通量测定的所述免疫测定系统是ortho clinical diagnostics设备。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述捕获抗体与固体载体缔合。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述捕获抗体是特异于所述sars-cov-2核衣壳的单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述捕获抗体是兔单克隆抗体。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述检测抗体是特异于所述sars-cov-2核衣壳的单克隆抗体。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述检测抗体为小鼠单克隆抗体。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述测定不与除sars-cov-1以外的冠状病毒发生交叉反应。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述检测抗体呈缀合物，其中每个缀合物包含约100个辣根过氧化物酶(hrp)分子和25个免疫球蛋白分子。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述患者样品为鼻咽拭子或前鼻拭子。11.一种用于在高通量免疫测定系统中高通量测试样品中sars-cov-2核衣壳的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：识别所述sars-cov-2核衣壳的捕获抗体和与所述捕获抗体缔合的固体载体；在与所述捕获抗体不同的位置处识别所述sars-cov-2核衣壳的检测抗体；用于检测包含所述捕获抗体、所述检测抗体和所述sars-cov-2核衣壳的复合物的装置；以及用于执行所述测定的使用说明。12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述高通量免疫测定系统是ortho clinical diagnostics装置。13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中所述捕获抗体与固体载体缔合。14.根据权利要求11-13中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体是特异于所述sars-cov-2核衣壳的单克隆抗体。15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述捕获抗体为兔单克隆抗体。16.根据权利要求11-15中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体为特异于所述sars-cov-2核衣壳的单克隆抗体。17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述检测抗体为小鼠单克隆抗体。18.根据权利要求11-17中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体和所述检测抗体不
与除sars-cov-1以外的冠状病毒发生交叉反应。19.根据权利要求11-18中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体呈缀合物，其中每个缀合物包含约100个hrp分子和约25个免疫球蛋白分子。

技术总结
本文公开了用于使用高通量方法快速检测临床样品中的SARS-CoV-2核衣壳抗原的方法、试剂和设备。剂和设备。


技术研发人员：菲利普
受保护的技术使用者：奥索临床诊断有限公司
技术研发日：2021.10.28
技术公布日：2023/8/9