用于预测或诊断胃癌的包含MUC4基因突变检测制剂的组合物

cancer:a retrospective study based on the number of first-degree relatives.medicine(baltimore).2016；95(20):e3606.epub 2016/05/20.https://doi.org/10.1097/md.0000000000003606pmid:27196462；pubmed central pmci d:pmc4902404][sahasrabudhe r,lott p,bohorquez m,toal t,estrada ap,suarez jj,et al.germline mutations in palb2,brca1,and rad51c,which regulate dna recombination repair,in patients with gastric cancer.gastroenterology.2017；152(5):983-6e6.epub 2016/12/28.https://doi.org/10.1053/j.gastro.2016.12.010pmid:28024868；pubmed central pmci d:pmc5367981]揭示家族聚集的遗传基础。
[0004]
根据文献，通过候选基因法[ean mh,el-omar em.genetics of gastric cancer.nat rev gastroenterol hepatol.2014；11(11):664-74.epub 2014/08/20.https://doi.org/10.1038/nrgastr o.2014.143pmid:25134511][el-omar em,carrington m,chow wh,mccoll ke,bream j h,young ha,et al.interleukin-1polymorphisms associated with increased risk of gastric canc er.nature.2000；404(6776):398-402.epub 2000/04/04.https://doi.org/10.1038/35006081pm id:10746728]或全基因组关联研究(genome-wide association study，gwas)确认与胃癌相关的几种单核苷酸多态性(snp)[saeki n,saito a,choi ij,matsuo k,ohnami s,tot suka h,et al.a functional single nucleotide polymorphism in mucin 1,at chromosome 1q22,d etermines susceptibility to diffuse-type gastric cancer.gastroenterology.2011；140(3):892-902.epub 2010/11/13.https://doi.org/10.1053/j.gastro.2010.10.058pmid:21070779][study gro up of millennium genome project for c,sakamoto h,yoshimura k,saeki n,katai h,shimo da t,et al.genetic variation in psca is associated with susceptibility to diffuse-type gastric ca ncer.nat genet.2008；40(6):730-40.epub 2008/05/20.https://doi.org/10.1038/ng.152pmid:18488030]。其中最著名的一个是muc1与胃癌的关联性[saeki n,sakamoto h,yoshida t.mucin 1gene(muc1)and gastric-cancer susceptibility.int j mol sci.2014；15(5):7958-73.epub 2014/05/09.https://doi.org/10.3390/ijms15057958pmid:24810688；pubmed central p mcid:pmc4057712]。muc1属于粘蛋白家族，位于粘膜上皮细胞的顶面(apical surfac e)，并作为免受外源性损伤的保护屏障。有假设说如rs4072037等muc1的突变影响muc1蛋白的数量及质量，并由于个体之间的胃癌易感性差异导致胃屏障功能的差异[sa eki n,sakamoto h,yoshida t.mucin 1gene(muc1)and gastric-cancer susceptibility.int j mol sci.2014；15(5):7958-73.epub 2014/05/09.https://doi.org/10.3390/ijms15057958pmi d:24810688；pubmed central pmcid:pmc4057712]。
[0005]
然而，对这种单核苷酸多态性(snp)的研究尤其关于其他胃癌类型及民族性得出没有一致性的结果[saeki n,saito a,choi ij,matsuo k,ohnami s,totsuka h,et al.a functi onal single nucleotide polymorphism in mucin 1,at chromosome 1q22,determines susceptibilit y to diffuse-type gastric cancer.gastroenterology.2011；140(3):892-902.epub 2010/11/13.htt ps://doi.org/
10.1053/j.gastro.2010.10.058pmid:21070779][el-omar em,rabkin cs,gamm on md,vaughan tl,risch ha,schoenberg jb,et al.increased risk of noncardia gastric canc er associated with proinflammatory cytokine gene polymorphisms.gastroenterology.2003；124(5):1193-201.epub 2003/05/06.https://doi.org/10.1016/s0016-5085(03)00157-4pmid:12730860][kim n,cho si,yim jy,kim jm,lee dh,park jh,et al.the effects of genetic polym orphisms of il-1and tnf-a on helicobacter pylori-induced gastroduodenal diseases in korea.helicobacter.2006；11(2):105-12.epub 2006/04/04.https://doi.org/10.1111/j.1523-5378.2006.00384.x pmid:16579840][palmer aj,lochhead p,hold gl,rabkin cs,chow wh,lisso wska j,et al.genetic variation in c20orf54,plce1 and muc1 and the risk of upper gastroint estinal cancers in caucasian populations.eur j cancer prev.2012；21(6):541-4.epub 2012/07/19.https://doi.org/10.1097/cej.0b013e3283529b79 pmid:22805490；pubmed central pmc id:pmc3460062]。此外，从全基因组关联研究(gwas)得到的单核苷酸多态性(snp)的效应量通常小于2.0。近年来，通过使用全基因组测序及全外显子测序(whole-genom e and whole-exome sequencing，wes)来确认用于说明小部分家族性胃癌的包含palb2、brca1以及ctnna1的新的胃癌基因[sahasrabudhe r,lott p,bohorquez m,toal t,estra da ap,suarez jj,et al.germline mutations in palb2,brca1,and rad51c,which regulate dna recombination repair,in patients with gastric cancer.gastroenterology.2017；152(5):983-6e6.epub 2016/12/28.https://doi.org/10.1053/j.gastro.2016.12.010pmid:28024868；pu bmed central pmcid:pmc5367981][fewings e,larionov a,redman j,goldgraben ma,sc arth j,richardson s,et al.germline pathogenic variants in palb2 and other cancer-predisposi ng genes in families with hereditary diffuse gastric cancer without cdh1 mutation:a whole-ex ome sequencing study.lancet gastroenterol hepatol.2018；3(7):489-98.epub 2018/05/01.ht tps://doi.org/10.1016/s2468-1253(18)30079-7pmid:29706558；pubmed central pmcid:p mc5992580][majewski ij,kluijt i,cats a,scerri ts,de jong d,kluin rj,et al.an alpha-e-c atenin(ctnna1)mutation in hereditary diffuse gastric cancer.j pathol.2013；229(4):621-9.epub 2012/12/05.https://doi.org/10.1002/path.4152pmid:23208944]。以往对于胃癌的家族聚集性的大多数研究专注于遗传性弥漫型胃癌(hdgc)或弥漫型胃癌[sahasrabudhe r,lott p,bohorquez m,toal t,estrada ap,suarez jj,et al.germline mutations in palb2,b rca1,and rad51c,which regulate dna recombination repair,in patients with gastric c ancer.gastroenterology.2017；152(5):983-6e6.epub 2016/12/28.https://doi.org/10.1053/j.ga stro.2016.12.010pmid:28024868；pubmed central pmcid:pmc5367981][fewings e,lari onov a,redman j,goldgraben ma,scarth j,richardson s,et al.germline pathogenic variant s in palb2 and other cancer-predisposing genes in families with hereditary diffuse gastric can cer without cdh1 mutation:a whole-exome sequencing study.lancet gastroenterol hepatol.2018；3(7):489-98.epub 2018/05/01.https://doi.org/10.1016/s2468-1253(18)30079-7pmid:
29706558；pubmed central pmcid:pmc5992580]，但相当部分的肠型胃癌发生在胃癌家族群中[choi yj,kim n,jang w,seo b,oh s,shin cm,et al.familial clustering of gastric cancer:a retrospective study based on the number of first-degree relatives.medicine(balt imore).2016；95(20):e3606.epub 2016/05/20.https://doi.org/10.1097/md.0000000000003606pmid:27196462；pubmed central pmcid:pmc4902404][kaurah p,macmillan a,boyd n,senz j,de luca a,chun n,et al.founder and recurrent cdh1 mutations in families with h ereditary diffuse gastric cancer.jama.2007；297(21):2360-72.epub 2007/06/05.https://doi.org/10.1001/jama.297.21.2360pmid:17545690]。并且，肠型胃癌的患病率高的亚洲对于胃癌的全外显子测序(wes)研究并不多见。


技术实现要素：

[0006]
技术问题
[0007]
本发明人招募患有胃癌的家族成员及未患有胃癌的家族成员，确认了muc4作为具有巨大效果的候选易感基因。本发明人在具有大量病例及对照组的集体中通过分析mu c4在正常胃粘膜以及胃癌组织中的表达来进一步进行验证。
[0008]
因此，一方面，本发明的目的在于，提供一种用于预测或诊断胃癌的生物标志物。
[0009]
另一方面，本发明的目的在于，提供一种用于预测或诊断胃癌的生物标志物的突变。
[0010]
解决问题的方案
[0011]
一方面，本发明提供一种用于预测或诊断胃癌的组合物，包含粘蛋白4(mucin 4，muc4)基因突变检测制剂，上述突变为muc4基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中的突变。
[0012]
再一方面，本发明提供一种包含上述组合物的用于预测或诊断胃癌的试剂盒。
[0013]
另一方面，本发明提供一种用于预测或诊断胃癌的信息提供方法，包括如下步骤：从受试者的样本中提取基因组dna；以及检测所提取的上述基因组dna中粘蛋白4(mucin 4，muc4)基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中的突变。
[0014]
发明的效果
[0015]
一方面，本发明发掘muc4基因作为用于预测或诊断胃癌的生物标志物，与正常对照组不同，胃癌患者的上述muc4基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中存在突变，尤其，确认到muc4在具有muc4生殖细胞系(germline)错义突变(rs547775645错义突变)的受试者的非癌性胃粘膜(noncancerous gastric mucosa)中的表达下调(downregulated)，muc4的功能丧失导致胃癌，并且与正常组织相比，muc4在癌组织中的表
达增加，因此包含muc4基因突变检测制剂的组合物对于大多数受试者具有可以在成本及时间方面有效地预测或诊断胃癌的优异效果。
附图说明
[0016]
图1为本发明一方面的具有muc4突变的家谱图。在图1中，根据本发明一方面分析dna的受试者用以“#”开头的编号表示，被诊断胃癌时的年龄记载到gc后的括号中。图1的箭头表示渊源者(proband)，十字形表示死亡的受试者，mut表示伴随基因突变的受试者。受试者中，#34具有c.5005a》g；p.s1669g的另一种muc4突变。图1的缩写如下：gc，胃癌(gastric cancer)(lauren分型未知)；igc，肠型胃癌(intesti nal-type gastric cancer)；dgc，弥漫型胃癌(diffuse-type gastric cancer)；rcc，肾细胞癌(renal cell cancer)；ca，癌症(cancer)；ta，管状腺瘤(tubule adenoma)；f，家族(family)。
[0017]
图2a至图2c示出本发明一方面的通过组合pvaast和关联分析得到的胃癌的候选易感基因。图2a示出检测到的易感基因，进行基于胃癌病例以及对照组的等位基因数量的二项分布似然(binomial likelihood)的复合似然比检验(clrt)，这由通过基因下调法(gene drop method)对106个被替换的样本进行的功能预测似然比(functional pr ediction likelihood)加权。图2b示出从pvaast运行中得到的所有蛋白质编码基因的l od的p值的曼哈顿图(manhattan)，在图2b中，图的每个点表示相对于一个基因的p值，x轴示出基因组排列在染色体上的位置。图2c示出从pvaast得到的lod的p值的分位数-分位数(quantile-quantile，qq)图。
[0018]
图3为no.14家族的对于非癌性及癌性胃粘膜组织中muc4的免疫组织化学(ihc)的代表性显微镜图像(a部分至f部分为原始倍率，h部分以及i部分为
×
400)。在图3中，a部分为#50(受试者编号)的组织；b部分以及c部分为#51的组织；d部分为#54的组织；e部分以及f部分为#52的组织；h部分以及i部分为#53的组织。通过与m uc4突变-阳性胃癌患者(b部分、e部分以及h部分)的非癌性组织的缺乏或微弱的免疫反应性比较来呈现代表性的muc4突变-阴性对照组的非癌性组织(a部分、d部分)中muc4的染色强度(棕色)。b部分、e部分以及h部分的一对癌组织(c部分、f部分以及i部分)表现出muc4的强烈且弥漫性染色。与muc4突变-阴性相比，mu c4突变-阳性非癌性粘膜中的muc4免疫强度弱(g部分的左侧柱形图)。尽管muc4突变-阳性癌组织中的免疫强度呈增加趋势，但未观察到统计显著性(g部分的右侧柱形图)。g部分中白色柱子表示muc4突变-阴性，黑色柱子表示muc4突变-阳性。
[0019]
图4示出本发明一方面的基因muc4、magec1以及retsat的lod的p值qq图。
具体实施方式
[0020]
以下，详细说明本发明。
[0021]
本发明一方面，“突变(mutant)”包括该基因的核苷酸以及氨基酸序列发生碱基替换、缺失、插入、扩增以及再排列，核苷酸突变是指相对于参考序列(例如，野生型序列)的核苷酸序列的变化(例如，一个以上的核苷酸的插入、缺失、倒位或替换，例如，单核苷酸多态性(snp))。除非另有说明，否则上述术语还包括核苷酸序列的互补序列的相应变化。核苷酸突变可以为体细胞突变或种系多态性，本发明中突变可以与变异(variant)互换使用。
[0022]
并且，本发明一方面，氨基酸突变是指与参考序列(例如，野生型序列)比较的氨基
酸序列的变化(例如，一个以上的氨基酸的插入、替换或缺失，例如，内部缺失或者n-或c-末端的末端截断(truncation))。
[0023]
并且，本发明一方面，“预测胃癌”可以是指预测或诊断受试者是否有引发胃癌的可能性、是否引发胃癌的可能性比较高、胃癌的发病原因是什么、或者是否已经患有胃癌等。并且，本发明一方面，“诊断胃癌”是指确认受试者的病理状态的存在或特征，根据本发明一方面的目的，诊断可以是指确认是否引发胃癌。本发明一方面的组合物、试剂盒或方法可以用于任意特定患者，以使胃癌发病风险高的患者通过特殊且合适的管理延迟发病时期或不发病。并且，本发明一方面的组合物、试剂盒或方法可以在临床上用于通过早期诊断胃癌并选择合适的治疗方式来确定治疗方案。
[0024]
一方面，本发明提供一种用于预测或诊断胃癌的组合物，包含粘蛋白4(mucin 4，muc4)基因突变检测制剂，上述突变为muc4基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中的突变。
[0025]
本发明一方面的muc4基因突变可以抑制muc4基因在非癌性胃粘膜(noncancero us gastric mucosa)中的表达。
[0026]
并且，与正常胃组织相比，本发明一方面的muc4基因突变可以增加muc4基因在胃癌组织中的表达。
[0027]
根据本发明一实施例，表现出muc4-染色的细胞在非癌性胃粘膜中减少的趋势，这意味着与具有正常muc4基因的受试者相比，muc4在具有muc4突变的受试者的正常胃粘膜中的表达减少，具有muc4突变的受试者表现出muc4的表达减少，由此可见，muc4突变抑制muc4在正常胃粘膜中的表达导致不利效果。并且，如上所述的趋势在具有muc4的c.5375g》a：p.r1792h突变的家族成员中最突出(图1的第14号家族(no.14))，与正常组织相比，muc4在癌组织中的表达增加，由此可见，muc4在癌组织中的过度表达表明muc4基因作为肿瘤基因(oncogene)起到双重作用(实施例4以及图3)。
[0028]
本发明一方面的muc4基因突变可以为生殖细胞系(germline)中的突变，具体地，可以为muc4基因的外显子区域中的突变，更具体地，可以为muc4基因的选自由外显子2以及外显子24组成的组中的一个以上区域中的突变。
[0029]
本发明一方面的muc4基因的rs547775645区域中的突变可以为错义(missense)突变。
[0030]
本发明一方面的muc4基因突变可以为选自由nm_018406.7：c.5375c》t、nm_018406.7：c.5005t》c、nm_018406.7：c.7658g》a、nm_018406.7：c.11180g》c、nm_018406.7：c.15884g》a、nm_018406.7：c.10673g》a、nm_018406.7：c.6064g》a、nm_018406.7：c.7648g》t、nm_018406.7：c.6638c》t、nm_018406.7：c.6640g》t以及nm_018406.7：c.3053g》c组成的组中的一种以上突变。
[0031]
本发明一方面，说明与正常对照组受试者相比，在胃癌受试者中特异性地检测到m uc4基因突变，基于此，提供muc4基因突变作为用于预测或诊断胃癌的生物标志物。
[0032]
本发明一方面的检测制剂可以是指可以用于检测样本中muc4基因突变的存在的物质，muc4基因用作预测或诊断胃癌的标志物。可以为选自由与上述突变特异性结合的反
义寡核苷酸、引物对、探针、抗体、肽以及多核苷酸组成的组中的一个以上。
[0033]
本发明一方面的组合物可以应用于受试者的样本，上述样本是指从可以检测到本发明一方面的生物标志物的表达的个体中得到的所有试样，具体地，上述样本可以为选自由唾液(saliva)、活检(biopsy)、血液、皮肤组织、液体培养物、粪便以及尿液组成的组中的一种以上，但不限于此，可以通过本发明所属技术领域常用的方法处理来制备。
[0034]
本发明一方面的检测制剂可以为选自由与上述突变特异性结合的反义寡核苷酸、引物对、探针以及多核苷酸组成的组中的一个以上。即，核酸的检测可以通过使用编码基因的核酸分子或与上述核酸分子的互补物杂交的一个以上寡核苷酸引物的扩增反应来进行。例如，利用引物的核酸的检测可以通过使用如pcr等扩增方法来扩增基因序列之后，通过本领域已知方法确认是否扩增基因来进行。
[0035]
本发明一方面，“引物(primer)”是指用于通过pcr扩增相当于基因的靶位点的特定区域的具有可以与基因特定区域的末端互补结合的序列的碱基的多核苷酸或其变异体。上述引物不需要与特定区域末端完全互补，只要足以与上述末端杂交形成双链结构的程度互补就可以使用。
[0036]
本发明一方面，“探针(probe)”是指包括具有可以与基因的靶位点互补结合的序列的碱基的多核苷酸、其变异体、或多核苷酸以及与其结合的标志物。
[0037]
本发明一方面，“杂交(hybridization)”是指通过两条单链核酸互补的碱基序列的配对(pairing)形成双链体结构(duplex structure)。
[0038]
不仅可以在单链核酸序列之间的互补性完整的情况(完美匹配，perfect match)发生杂交，也可以在存在一些错配(mismatch)的情况下发生杂交。
[0039]
本发明一方面的检测制剂可以为选自由与上述突变的氨基酸位点特异性结合的抗体以及肽组成的组中的一个以上。
[0040]
本发明一方面的muc4突变可以为选自由p.arg1792his、p.ser1669gly、p.ala2553val、p.thr3727ser、p.thr5295met、p.ala3558val、p.leu2022phe、p.pro2550thr、p.ser2213asn、p.pro2214thr以及p.ser1018cys组成的组中的一种以上氨基酸突变，本发明一方面的检测制剂可以为能够检测上述突变的上述氨基酸突变的制剂。
[0041]
本发明一方面，上述抗体可以为选自由多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体以及它们的组合组成的组中的一种以上。具体地，上述抗体不仅可以包括多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体以及具有两条全长轻链以及两条全长重链的完整形态，还可以包括所有抗体分子的功能性片段，例如，fab、f(ab')、f(ab')2以及fv。可以利用本发明所属领域已知的技术容易地制备抗体，也可以利用制备好的市售抗体。
[0042]
本发明一方面的组合物不仅可以包括用于测定上述muc4基因突变是否存在或表达的制剂，还可以包括能够定量或定性测定抗原-抗体复合物形成的标志物、免疫学分析的常规工具、试剂等。
[0043]
本发明一方面，能够定量或定性测定上述抗原-抗体复合物形成的标志物包括酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒(microparticle)、氧化还原分子以及放射性同位素等，但不限于此。能够用作检测标志物的酶包括β葡萄糖醛酸酶、β葡萄糖苷酶、β半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、gdp酶(gdpase)、核糖核酸酶(rnase)、葡萄糖氧化酶及荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬
氨酸氨基转移酶、磷酚丙酮酸脱羧酶、β拉脱马酶等，但不限于此。荧光物质包括荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺等，但不限于此。配体包括生物素衍生物等，但不限于此。发光物质包括吖啶酯、萤光素、萤光素酶等，但不限于此。微粒包括胶体金、着色乳胶等，但不限于此。氧化还原分子包括二茂铁、钌络合物、紫精、醌、ti离子、cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、氢醌、k4w(cn)8、[os(bpy)3]
2+
、[ru(bpy)3]
2+
、[mo(cn)8]
4-等，但不限于此。放射性同位素包括3h、
14
c、
32
p、
35
s、
36
cl、
51
cr、
57
co、
58
co、
59
f e、
90
y、
125
i、
131
i、
186
re等，但不限于此。
[0044]
本发明一方面，作为上述工具或试剂的一例包括合适的载体、增溶剂、清洁剂、缓冲剂、稳定剂等，但不限于此。当标志物为酶时，可以包含能够测定酶活性的底物以及反应终止剂。载体包括可溶性载体以及不溶性载体，作为可溶性载体的一例有如磷酸盐缓冲液(pbs)等本领域已知的生理学上可接受的缓冲液，作为不溶性载体的一例可以包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、其他纸、玻璃、金属、琼脂糖以及它们的组合。
[0045]
本发明一方面的胃癌可以为选自由弥漫型(diffuse-type)胃癌、肠型(intestinal-typ e)胃癌以及混合型(mixed-type)胃癌组成的组中的一种以上，但只要是胃癌不限制其类型。与现有家族史相关的胃癌的生物标志物局限于弥漫型胃癌或遗传性弥漫型胃癌(hereditary diffuse gastric cancer，hdgc)，但本发明一方面的组合物可以根据muc4基因突变是否存在来预测或诊断胃癌，而与胃癌的类型无关，因此具有可以预测或诊断更广泛类型的胃癌的优异效果。
[0046]
本发明一方面的组合物可以用于预测或诊断患有选自由胃腺癌(stomach adenocarci noma，stad)、大肠癌(colorectal cancer，crc)以及子宫内膜癌(uterine corpus end ometrial cancer，ucec)组成的组中的一种以上癌症的受试者的胃癌，但不限于此。
[0047]
本发明一方面的受试者可以为有胃癌家族史的受试者或没有胃癌家族史的受试者，上述有胃癌家族史可以是指三代以内有2名以上目前患有胃癌或过去患过胃癌的家族成员。
[0048]
再一方面，本发明一方面提供一种用于预测或诊断胃癌的试剂盒，包含用于预测或诊断胃癌的组合物，上述组合物包含上述粘蛋白4(mucin 4，muc4)基因的突变检测制剂。对于上述muc4基因、muc4基因突变、检测制剂、胃癌、受试者、样本等的说明如上所述。
[0049]
本发明一方面的试剂盒还可以包含说明书。
[0050]
本发明一方面的上述说明书中可以描述：若在上述muc4基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中存在突变，则预测或诊断为胃癌。
[0051]
本发明一方面的试剂盒可以应用于有胃癌家族史或没有胃癌家族史的受试者，上述有胃癌家族史可以是指三代以内有2名以上目前患有胃癌或过去患过胃癌的家族成员。
[0052]
本发明一方面的试剂盒可以应用于患有癌症的受试者，具体地，可以应用于患有选自由胃腺癌(stomach adenocarcinoma，stad)、大肠癌(colorectal cancer，crc)以及子宫内膜癌(uterine corpus endometrial cancer，ucec)组成的组中的一种以上癌症的受
试者。
[0053]
另一方面，本发明提供一种用于预测或诊断胃癌的信息提供方法，包括如下步骤：从受试者的样本中提取基因组dna；以及检测所提取的上述基因组dna中粘蛋白4(mucin 4，muc4)基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中的突变。对于上述muc4基因、muc4基因突变、检测制剂、胃癌等的说明如上所述。
[0054]
本发明一方面的上述突变检测步骤可以包括：检测上述muc4基因的上述区域中的选自由p.arg1792his、p.ser1669gly、p.ala2553val、p.thr3727ser、p.thr5295met、p.al a3558val、p.leu2022phe、p.pro2550thr、p.ser2213asn、p.pro2214thr以及p.ser1018cy s组成的组中的一种以上氨基酸突变，该步骤可以为利用可以检测到本发明一方面的上述突变的上述氨基酸突变的检测制剂来检测氨基酸突变的步骤。
[0055]
本发明一方面的上述突变检测步骤可以包括：使对选自一个以上区域的核苷酸序列中的连续核苷酸序列具有特异性的引物进行反应，上述一个以上区域选自由上述muc4基因的nm_018406.7：c.5375c》t、nm_018406.7：c.5005t》c、nm_018406.7：c.7658g》a、nm_018406.7：c.11180g》c、nm_018406.7：c.15884g》a、nm_018406.7：c.10673g》a、nm_018406.7：c.6064g》a、nm_018406.7：c.7648g》t、nm_018406.7：c.6638c》t、nm_018406.7：c.6640g》t以及nm_018406.7：c.3053g》c组成的组中；以及扩增上述反应的产物。
[0056]
本发明一方面的上述突变检测步骤可以利用本领域熟知的技术来进行靶分子克隆以及序列分析。例如，可以包括利用选自由dna序列分析；包括等位基因-特异性核苷酸掺入分析以及等位基因-特异性引物延伸分析(例如，等位基因-特异性pcr、等位基因-特异性连接酶链反应(lcr)以及缺口-连接酶链反应)在内的引物延伸分析；等位基因-特异性寡核苷酸杂交分析(例如，寡核苷酸连接分析)；利用裂解剂的保护来检测核酸双螺旋中错配碱基的裂解保护分析；muts蛋白结合分析；比较变异体以及野生型核酸分子的迁移率的电泳分析；变性梯度凝胶电泳(dgge，例如与文献[myers et al.(1985)nature 313：495]中相同)；错配碱基对中的rnase切割的分析；异源双螺旋dna的化学或酶切割分析；质谱法(例如，malditof)；遗传位点分析(gba)；5'核酸酶分析(例如，taqman)；以及使用分子信标的分析组成的组中的一种以上技术的突变检测步骤，但不限于此。
[0057]
本发明一方面的上述muc4基因突变可以为选自由nm_018406.7：c.5375c》t、n m_018406.7：c.5005t》c、nm_018406.7：c.7658g》a、nm_018406.7：c.11180g》c、n m_018406.7：c.15884g》a、nm_018406.7：c.10673g》a、nm_018406.7：c.6064g》a、nm_018406.7：c.7648g》t、nm_018406.7：c.6638c》t、nm_018406.7：c.6640g》t以及nm_018406.7：c.3053g》c组成的组中的一种以上突变。
[0058]
在本发明一方面的信息提供方法中，可以在上述muc4基因突变检测步骤之后，若检测到上述muc4基因的突变，则预测或诊断为胃癌。
[0059]
本发明一方面的信息提供方法可以为用于预测或诊断选自由弥漫型(diffuse-type)胃癌，肠型(intestinal-type)胃癌以及混合型(mixed-type)胃癌组成的组中的一种以上胃癌的信息提供方法，但只要是胃癌不限制其类型。与现有家族史相关的胃癌的生物标志物局限于弥漫型胃癌或遗传性弥漫型胃癌(hereditary diffuse gastric cancer，
hdg c)，但本发明一方面的信息提供方法可以提供根据muc4基因突变是否存在来预测或诊断胃癌的信息，而与胃癌的类型无关，因此具有可以预测或诊断更广泛类型的胃癌的优异效果。
[0060]
本发明一方面的受试者可以为有胃癌家族史或没有胃癌家族史的受试者，上述有胃癌家族史可以是指三代以内有2名以上目前患有胃癌或过去患过胃癌的家族成员。
[0061]
本发明一方面的受试者可以为患有癌症的受试者，具体地，可以为患有选自由胃腺癌(stomach adenocarcinoma，stad)、大肠癌(colorectal cancer，crc)以及子宫内膜癌(uterine corpus endometrial cancer，ucec)组成的组中的一种以上癌症的受试者。
[0062]
以下，通过实施例更详细地说明本发明的结构以及效果。然而，以下实施列仅以示例的目的提供，以便于理解本发明，但本发明的范畴以及范围不限于此。
[0063]
实施例1.受试者的特征
[0064]
为了识别新的胃癌-易感基因，对14个3代以内发生两例以上胃癌病例(case)的家庭的家族中19名胃癌患者以及36名没有患有胃癌的直系亲属进行全外显子组测序(whole-exome sequencing，wes)。为此进行的受试者入组方法以及已入组的受试者的特征如下。
[0065]
用于外显子组测序的患者入组
[0066]
2017年4月至2018年3月将盆塘首尔大学医院的家族中3代以内有2名以上被诊断胃癌的胃癌患者以及其直系亲属(first-degree relatives，fdrs)入组到本发明一实施例的研究中。非胃癌对照组(以下，对照组)定义为过去6个月内接受正常胃镜检查的超过50岁的人。胃癌的诊断以通过内窥镜活检(endoscopic biopsy)或外科样本(surgi cal specimen)的病例诊断为依据。
[0067]
通过问卷调查得到胃癌的家族史、吸烟、饮酒、饮食喜好(dietary preference)、社会经济状态、胃肠道症状以及过去幽门螺杆菌根除史。进行通过吉姆萨染色法(giemsa staining)以及抗幽门螺杆菌测试的组织学评价以确认幽门螺杆菌感染状态[choi yj,ki m n,jang w,seo b,oh s,shin cm,et al.familial clustering of gastric cancer:a retrospect ive study based on the number of first-degree relatives.medicine(baltimore).2016；95(20):e3606.epub 2016/05/20.https://doi.org/10.1097/md.0000000000003606pmid:27196462；pubmed central pmcid:pmc4902404.][kim n,cho si,yim jy,kim jm,lee dh,park j h,et al.the effects of genetic polymorphisms of il-1and tnf-aon helicobacter pylori-indu ced gastroduodenal diseases in korea.helicobacter.2006；11(2):105-12.epub 2006/04/04.htt ps://doi.org/10.1111/j.1523-5378.2006.00384.x pmid:16579840]。
[0068]
与受试者相关的所有流程均按照机构及国家研究委员会的伦理标准以及1964年赫尔辛基宣言进行。本研究经盆塘首尔大学医院临床试验审查委员会的批准(b-1610-366-303)。参与本研究的所有家族成员均签署具体事先同意书。
[0069]
受试者的特征
[0070]
受试者总数包括14个家庭的独立家族的55名受试者(19名胃癌患者以及36名非胃癌亲属)。14个家庭的家族中的家谱图如图1所示。包括符合国际胃癌联合协会2010(international gastric cancer linkage consortium 2010)临床标准的3个家庭的遗传性弥漫型胃癌(hereditary diffuse gastric cancer，hdgc)家族(no.7、8以及13)
[fitzgera ld rc,hardwick r,huntsman d,carneiro f,guilford p,blair v,et al.hereditary diffuse gastr ic cancer:updated consensus guidelines for clinical management and directions for future resea rch.j med genet.2010；47(7):436-44.epub 2010/07/02.https://doi.org/10.1136/jmg.2009.074237pmid:20591882；pubmed central pmcid:pmc2991043]。受试者的临床特征如下表1所示(表1)。
[0071]
表1
[0072]
胃癌患者以及非胃癌受试者的临床以及人口统计学特征
[0073]
[0074]
central pmcid:pmc3083463]。合并基因组vcf(gvcf)文件并与gatk生成联合基因型。以集体频率使用a nnovar进行基因突变的功能性注释。通过桑格测序(sanger sequencing)确认muc4基因在外显子24(exon 24)上的突变，用综合基因浏览器(integrative genomes viewe r)检查所有突变读数[robinson jt,thorvaldsdottir h,winckler w,guttman m,lander es,getz g,et al.integrative genomics viewer.nat biotechnol.2011；29(1):24-6.epub 2011/01/12.https://doi.org/10.1038/nbt.1754pmid:21221095；pubmed central pmcid:pmc3346182]。
[0083]
连锁(linkage)以及关联(association)分析
[0084]
在常染色体显性遗传模型以及0.005的疾病最大可接受流行率下，进行与谱系变异注释(pedigree variant annotation)、分析(analysis)以及搜索工具(search tool)(pvaast)之间的连锁分析以及基于基因的关联性测试来确认疾病易感基因的基因座(loci)[hu h,roach jc,coon h,guthery sl,voelkerding kv,margraf rl,et al.a unified testof linkage analysis and rare-variant association for analysis of pedigree sequence data.nat biot echnol.2014；32(7):663-9.epub 2014/05/20.https://doi.org/10.1038/nbt.2895pmid:24837662；pubmed central pmcid:pmc4157619]。使用基因下调法(gene-drop method)从106个被替换的样本中计算基于通过功能预测被加权的病例及对照组的等位基因数量的二项分布似然(linomial likelihood)的连锁系数(logarithm of odds，lod)分数以及基于基因的负荷类型(burden-type)复合似然比检验(composite likelihood ratio test，clrt)的p值。在连锁分析中，考虑到每个家族结构，本发明人将19名胃癌患者中的突变与36名在所有14个家庭的家族中未患胃癌的对照组进行比较。在基于基因的关联性试验中，本发明人将19名胃癌患者的全部外显子的等位基因数量与397个从韩国国立保健院(national institute of korea)的韩国国立生物银行中得到的韩国对照组的全部基因组的等位基因数量进行比较。分析总共19491种基因，邦弗朗尼(bonferroni)校正的0.05水平为2.57
×
10-6
。对于muc4，由于106个被替换的样本中clrt分数的p值为1.0
×
10-6
，因此使用108个被替换的样本。
[0085]
确定等位基因频率
[0086]
使用gnomad数据库(http://gnomad.broadinstitute.org/)确认全部及东亚对照组集体的特定突变频率。
[0087]
癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，tcga)数据分析
[0088]
从基因组数据共享遗留(grch37/hg19)档案以及基因组共享数据网站(https://portal.gdc.cancer.gov)的系统生物学癌症基因组云研究所(institute for systems biology cancer genomics cloud)中下载tcga数据。从基因型与表型数据库中得到(dbgap)序列信息。
[0089]
分析效应量
[0090]
通过逻辑回归预测邦弗朗尼校正的0.05显著性水平的所有显著基因的比值比(oddsratio，or)。用gmmat预测家族关系[chen h,wang c,conomos mp,stilp am,li z,sofer t,et al.control for population structure and relatedness for binary traits in genetic asso ciation studies via logistic mixed models.am j hum genet.2016；98(4):653-66.epub 2016/03/29.https://doi.org/10.1016/
j.ajhg.2016.02.012pmid:27018471；pubmed central pmcid:pmc4833218]，预测说明家族关系的随机效果的分散为0。因此，假设家族成员之间的胃癌状态为独立的，使用rex version 2.1(http://rexsoft.org)应用于标准逻辑回归分析。对于每个基因，当在相应的基因中观察到一个以上稀有等位基因时，将遗传风险评分(genetic risk scores)编码为1，否则编码为0。包括性别、年龄、吸烟状态以及hdgc作为协变量以调整效果。
[0091]
发现与胃癌相关的生殖细胞系(germline)外显子突变
[0092]
从上述基因分析得到的wes数据是从55名靶外显子组区域中平均深度(mean depth)为96倍的受试者中生成的。平均97％的所有靶区域至少达20倍。为了探索对于胃癌的罕见突变候选物，进行与关联性试验结合的连锁分析。基于lod的p值，确认muc4、magec1以及retsat作为与胃癌相关的预测基因，并如图2a至图2c所示。在结合连锁信息、病例对照组关联性以及功能性突变预测的基于基因的clrt分析中，粘蛋白4达到全基因组显著性水平(p值≤9.9
×
10-9
，全基因组邦弗朗尼校正的0.05显著性水平为2.6
×
10-6
)(图2a)。图2b以及图2c分别示出当前连锁分析的曼哈顿(manhattan)图以及分位数-分位数(quantile-quantile，qq)图，表明统计分析保持名义上的显著性水平。图4示出3种其他大小基因组的lod的p值的qq图，确认上述分析不受基因大小的影响。
[0093]
muc4突变
[0094]
使用上述pvaast分析整个数据集，显示出muc4的14种突变对lod分数有贡献，最终选择其中lod值大于0的10种。从14个家庭的独立家族中确认muc4的10种突变(表2)。
[0095]
表2
[0096]
通过连锁分析导出的所研究的14个家庭的家族中与胃癌相关的生殖细胞系muc4突变的特征
[0097]
[0098][0099]
如上述表2所述，除了病例#16、#37以及#39以外，具有muc4突变的受试者都是胃癌患者。具有muc4突变的胃癌患者除了#23以外大多数是肠型胃癌(图1)。3名未患胃癌的受试者(#16、#37以及#39)都是女性且都是非吸烟者。在没有关联的3个家庭的家族中确认到c.7658c》t p.a2553v以及c.5005a》g p.s1669g这2种突变。#15、#16、#19、#34以及#51受试者分别具有2种不同的突变。东亚裔群体的变异识别率高于大多数全部群体中观察到的变异识别率(表2)。
[0100]
另一方面，上述实施例1的受试者中muc1的rs4072037的a等位基因的频率为90.9％，与1124名中国人胃癌患者相似[qiu lx,hua rx,cheng l,he j,wang my,zhou f,et al.genetic variant rs4072037of muc1 and gastric cancer risk in an eastern chinese popul ation.oncotarget.2016；7(13):15930-6.epub 2016/02/26.https://doi.org/10.18632/oncotarge t.7527pmid:26910281；pubmed central pmcid:pmc4941287]，相反，a以及g等位基因的频率在美国群体中分别为57.9％以及42.1％，在非洲群体中分别为49.2％以及50.8％[reis ca,david l,seixas m,burchell j,sobrinho-simoes m.expression of fully and und er-glycosylated forms of muc1 mucin in gastric carcinoma.int j cancer.1998；79(4):402-10.epub 1998/08/12.https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0215(19980821)79:4《402::aid-ijc16》3.0.co；2-6pmid:9699534]。这种结果表现出东亚群体由于muc1突变在遗传上可能脆弱。从上述分析结果确认的大多数muc4突变的频率在东亚群体遗传上高于包括西方群体在内的全球群体(表2)。并且，tcga中确认到1种东亚胃癌患者的粘蛋白4突变(rs774527434)。总体而言，本发明中预测的muc4突变可以贡献于与muc1突变平行的胃癌发病率的地理差异。
[0101]
并且，由于胃癌具有异质性病因(heterogeneous etiology)，因此胃癌家族中的个体可能表现出遗传易感性以及临床表现之间的不一致。上述基因组分析结果中，在4个家庭的独立家族中确认到没有muc4突变的5名胃癌患者：#20、#28、#43、#45以及#46(图1)。满足hdgc标准的弥漫型胃癌患者#28在cdh1中具有新的错义突变(n m_001317184：exon8：c.g1057a：p.e353k)。即使家族#46满足hdgc标准，但没有发现cdh1或ctnna1中的突变[majewski ij,kluijt i,cats a,scerri ts,de jong d,kluin rj,et al.an alpha-e-catenin(ctnna1)mutation in hereditary diffuse gastric cancer.j pathol.2013；229(4):621-9.epub 2012/12/05.https://doi.org/10.1002/path.4152pmid:23208944][hansford s,kaurah p,li-chang h,woo m,senz j,pinheiro h,et al.hereditary diffuse gast ric cancer syndrome:cdh1 mutations and beyond.jama oncol.2015；1(1):23-32.epub 2015/07/17.https://doi.org/10.1001/jamaoncol.2014.168pmid:
26182300]。患者#43以及#45属于有2名肾细胞癌患者的相同家庭，这表现出其他遗传性综合征的可能性。尤其，可以知道当胃癌大多数为肠型时muc4突变与胃癌发病具有很强的关联性，而不只是韩国人的hdgc。
[0102]
胃癌发病中muc4突变的效应量
[0103]
通过调整性别、吸烟以及hdgc来将标准逻辑回归分析应用于55名所有受试者，其结果如下述表3所示。
[0104]
表3
[0105]
通过二项逻辑回归分析的胃癌的独立风险因素的比值比(odds ratios)
[0106][0107]
如上述表3所示，可以知道具有任意muc4突变与患胃癌的风险增加相关。
[0108]
实施例3.验证大型队列中的muc4与胃癌的关联性
[0109]
从上述实施例2的以上述实施例1的受试者为对象进行基因组分析的结果确认到具有muc4突变的受试者的患胃癌的风险增加，在更大的大型队列中用如下方法验证上述muc4突变与胃癌的关联性。
[0110]
位于muc4的突变的全基因组关联性
[0111]
从盆塘首尔大学医院以及首尔大学医院健康管理系统江南中心收集组织学上确认的597名胃癌患者及9758名非胃癌患者(对照组)的血液样本。对上述样本通过由827783个突变组成的affymetrix axiom korean chip指定基因分型。
[0112]
在此情况下，排除属于下述情况的受试者：1)通过基因组预测的性别与临床信息
不同，2)受试者的检出率(call rates)小于97％，3)杂合率为平均到标准偏差的3倍，4)与其他受试者的同源一致性(identity-by-descent，ibd)预测值大于0.185且与其伴侣受试者相比缺失率(missing rate)更高。
[0113]
并且，排除下述突变：1)缺失率(missing rate)大于3％或胃癌患者与对照组之间显著不同(p《1
×
10-5
)，2)次等位基因频率(minor allele frequency)小于5％，3)按照anderson et al.等提出的哈迪-温伯格平衡精密测试中的p值小于0.001[anderson ca,p ettersson fh,clarke gm,cardon lr,morris ap,zondervan kt.data quality control in geneti c case-control association studies.nat protoc.2010；5(9)：1564-73.epub 2010/11/19.https：//doi.org/10.1038/nprot.2010.116pmid：21085122；pubmed central pmci d：pmc3025522]。
[0114]
然后，使用密歇根基因型填补服务器(michigan imputation server)填补(impute)未分类的突变[das s,forer l,schonherr s,sidore c,locke ae,kwong a,et al.next-genera tion genotype imputation service and methods.nat genet.2016；48(10)：1284-7.epub 2016/08/30.https：//doi.org/10.1038/ng.3656pmid：27571263；pubmed central p mcid：pmc5157836]。填补(imputation)之后，通过调整样本相关矩阵的性别、年龄以及前10种主要因素的影响使用逻辑回归(logistic regression)来分析位于muc4的4224个突变以及其0.5mb侧翼区域(flanking region)。邦弗朗尼校正的0.05显著性水平为1.18
×
10-5
，这过程中使用plink(v1.90b4.5)以及r(v3.5.2)[chang cc,chow c c,tellier lc,vattikuti s,purcell sm,lee jj.second-generation plink：rising to the challen ge of larger and richer datasets.gigascience.2015；4：7.epub 2015/02/28.https：//d oi.org/10.1186/s13742-015-0047-8pmid：25722852；pubmed central pmcid：pmc4342193]。
[0115]
在大型病例对照组队列中验证muc4与胃癌的关联性
[0116]
假设遗传性以及散发性胃癌可以共享胃癌的遗传背景，由上述597名用单核苷酸多态性(snp)微阵列进行基因分型的胃癌患者以及9759名健康的对照组组成的大型队列中进一步分析muc4的突变是否与胃癌相关。分析包含0.5mb的侧翼区域的muc4区域(chr3：195、473、637-195、539、149)的共同单核苷酸多态性(snp)，邦弗朗尼校正的0.05显著性水平为1.18
×
10-5
。在muc4病变中检测到2种共同突变(rs148735556以及rs11717039)(表4)，这表示muc4与胃癌的关联性。
[0117]
表4
[0118]
包含0.5mb侧翼区域的muc4区域(chr3：194、473、637-195、539、149)
[0119]
chrsnpbpporl95u95a1a2maf_amaf_umaf_dbhwemiss3rs1487355561950524261.27e-074.3432.5197.487ta0.02350.00540.01130.351503rs117170391954017371.071e-051.3861.1981.603ct0.47820.40260.45340.070020
[0120]
经确认，在muc4的外显子2以及外显子24区域中，具有25个单核苷酸多态性(snp)，在外显子2中rs547775645错义突变在0.05/25＝2
×
10-3
显著性水平上显著(表5)。
[0121]
表5muc4区域(外显子2以及外显子24)
[0122][0123]
由于muc4中上述提及的10种罕见突变的填补质量(imputation quality)较差(info《0.5)，因此无法在单核苷酸多态性(snp)芯片分析中进行试验。然而，确认muc4错义突变作为胃癌的家族聚集(familial aggregation)的易感因素，确认在与胃癌具有显著关联性的muc4中存在共同突变。
[0124]
即，在胃癌的大型病例对照组队列中发现与胃癌显著关联的muc4区域的共同突变，由此可见muc4与胃癌存在关联性。
[0125]
muc4生殖细胞系(germline)在各种癌症类型的患者中突变的频率
[0126]
muc4不仅在胃中表达，还在如结肠、食道、小肠、子宫以及肺等其他组织中表达，据报道异常muc4在包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及胃癌的各种类型的癌症中表达[chaturvedi p,singh ap,batra sk.structure,evolution,and biology of the muc4 mucin.fas eb j.2008；22(4)：966-81.epub 2007/11/21.https：//doi.org/10.1096/fj.07-9673rev pmid：18024835；pubmed central pmcid：pmc2835492]，因此在各种癌症类型患者的生殖细胞系(germline)样本中调查muc4突变的等位基因频率，确认到具有生殖细胞系muc4突变的患者患各种类型的癌症的风险更高。并且，使用从上述实施例2的tcga数据的血液中得到的生殖细胞系突变来测试muc4基因的10种罕见突变是否与癌症存在关联，确认到胃癌以及4种癌症类型与muc4的3种罕见突变存在关联(表6)。
[0127]
表6
[0128]
来自tcga的各种癌症类型中的3种单核苷酸多态性(snp)的频率
[0129][0130]
如上述表2所示的与家族性胃癌关联的muc4基因的10种关联突变中，在295个胃腺癌(stomach adenocarcinoma)生殖细胞系样本中的1名患者(0.17％)中确认到杂合rs774527434单核苷酸多态性(snp)(表6)，这比一般群体高出大约4倍(0.04％，表2)。在372名大肠癌(crc)患者中确认到rs534779185以及rs77250903这2种突变，频率分别为4.0％以及0.13％，这比一般群体更高(分别为0.26％以及0.06％，表2)。在265个子宫内膜癌
(uterine corpus endometrial cancer)样本中发现rs534779185这1种突变，频率为0.56％。408名肺鳞状细胞癌(lung squamous cell cancer)患者及495名肺腺癌(lung adenocarcinoma)患者中未确认到muc4基因的10种突变。由此可见，muc4突变可能与胃肠道或泌尿生殖道癌症关联。
[0131]
实施例4.确认通过免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)分析的胃组织中的功能性效果
[0132]
通过上述实施例2以及实施例3确认到具有muc4突变的受试者的患胃癌的风险增加，为了确认muc4突变在实际胃组织中具有怎样的功能性效果，如下述进行免疫组织化学(ihc)分析。
[0133]
非癌性胃粘膜以及胃癌组织的免疫组织化学分析
[0134]
使用ihc对同意内窥镜活检的15名胃癌患者以及8名非胃癌患者的胃窦(antral)非癌性粘膜进行评价。还对胃癌患者的癌组织进行染色。对ihc使用muc4检测用抗体(克隆：8g7)(以1：100稀释，zeta corporation，阿卡迪亚，加利福尼亚，美国)。用于上述ihc的抗体检测muc4α区域。通过先前的研究已经证明了抗体的特异性。通过benchmark xt staining系统以及ultraview universal dab detection kit(vent ana medical systems，inc.，图森，亚利桑那，美国)对切片(4μm的厚度)进行整体染色。使用科学显微镜通过面积依赖强度的乘积(％)如下评价muc4表达，其中在上皮腺(epithelial glands)中观察到如下染色(0至300)：如果未观察到染色则为0；如果微弱或几乎无法察觉的部分染色则为1+；如果微弱或中度染色则为2+；如果强染色则为3+。在癌组织中，对强染色面积进行评分。由一位病理学家(李慧胜)以盲检的方式对各样本进行评分。
[0135]
muc4在具有muc4突变的受试者的胃组织中的表达
[0136]
为了调查确认到的突变的功能性效果而进行的muc4在上述胃粘膜中的表达的ihc分析结果如下。
[0137]
首先，与muc4突变(rs774527434)表现出完整的共聚且包括最多的胃癌患者的家族no.14的5名受试者的代表性免疫化学性结果如图3所示。muc4突变-阴性的非癌性胃粘膜(#50、#54)(图3的a部分以及图3的d部分)表现出高强度，相反，具有muc4突变的3名患者(#51、#52以及#53)的muc4突变-阳性非癌性粘膜的ihc结果较弱或呈阴性(图3的b部分、图3的e部分以及图3的h部分)。相比之下，3名胃癌患者(#51、#52以及#53)的癌组织表现出高的ihc分数(图3的c部分、图3的f部分以及图3的i部分)。
[0138]
通常，与具有野生型的非癌性粘膜相比，具有muc4突变的非癌性粘膜表现出更低的muc4-阳性染色分数(图3的g部分；中值[四分位数范围]：0[10.0-30.0]vs.70[9.5-165.0]，p＝0.023)。在癌组织中，与野生型相比，ihc染色在具有muc4突变的组织中更突出(图3的g部分；中值[四分位数范围]：(75.0(0-240.0)vs.30(0-105.0)，p＝0.287)。
[0139]
根据上述ihc分析结果，muc4-染色的细胞在非癌性胃粘膜中表现出减少的趋势，这意味着与具有野生型的受试者相比，muc4在具有muc44突变的受试者的正常胃粘膜中的表达减少。muc4结构上与muc1相似，具有muc4突变的受试者表现出muc4的表达减少，表明muc4突变抑制muc4在正常胃粘膜中的表达，造成不利影响，这种趋势在具有muc4的c.5375g》a：p.r1792h突变的家族成员中最突出(famil y no.14)。并且，与正常组织相比，muc4在癌组织中的表达增加，因此，确认到mu c4在癌组织中的过表达证实muc4基因作为肿瘤基因
(oncogene)发挥双重作用。
[0140]
实施例5.预测muc4蛋白质结构
[0141]
通过上述实施例2至实施例4确认到muc4突变为用于预测或诊断胃癌的生物标志物，为了预测muc4蛋白的结构如下进行计算机分析。
[0142]
muc4结构计算机分析
[0143]
为了分析muc4结构，使用从ncbi参考序列数据库得到的蛋白质序列(refseqid：np_001191215)以及mrna序列(refseqid：nm_018406.6)进行基序搜索、肽切割(cleavage)、糖基化(glycosylation)以及蛋白结构预测[o'leary na,wright mw,brister jr,ciufo s,haddad d,mcveigh r,et al.reference sequence(refseq)database at ncbi:current status,taxonomic expansion,and functional annotation.nucleic acids res.2016；44(d1):d733-45.epub 2015/11/11.https://doi.org/10.1093/nar/gkv1189 pmid:26553804；pub med central pmcid:pmc4702849]。利用genomenet(https://www.genome.jp)的motif finder工具进行基序搜索。在蛋白质参考序列(np_001191215)以及突变序列的muc4α区域中进行peptidecutter[wilkins mr,gasteiger e,bairoch a,sanchez jc,williams kl,appel rd,et al.protein identification and analysis tools in the expasy server.methods mol biol.1999；112:531-52.epub 1999/02/23.https://doi.org/10.1385/1-59259-584-7:531pmid:10027275]来进行肽切割预测。使用netoglyc[steentoft c,vakhrushev sy,joshi hj,kongy,vester-christensen mb,schjoldager kt,et al.precision mapping of the human o-galnac glycoproteome through simplecell technology.embo j.2013；32(10):1478-88.epub 2013/04/16.https://doi.org/10.1038/emboj.2013.79pmid:23584533；pubmed central pmcid:pmc3655468]以及netnglyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/)分别预测o-galnac(n-乙醯半乳糖胺)(n-acetylgalactosamine)以及n-galnac修饰的位置。将使用modeller[eswar n,webb b,marti-renom ma,madhusudhan ms,eramian d,shen my,et al.comparative protein structure modeling using modeller.curr protoc bioinformatics.2006；chapter 5:unit-5 6.epub 2008/04/23.https://doi.org/10.1002/0471250953.bi0506s15 pmid:18428767；pubmed central pmcid:pmc4186674][waterhouse a,bertoni m,bienert s,studerg,tauriello g,gumienny r,et al.swiss-model:homology modelling of protein structures and complexes.nucleic acids res.2018；46(w1):w296-w303.epub 2018/05/23.https://doi.org/10.1093/nar/gky427 pmid:29788355；pubmed central pmcid:pmc6030848]以及swiss-model的同源建模进行蛋白质结构预测。
[0144]
蛋白质结构预测结果
[0145]
从上述实施例2至实施例4中确认的10种muc4突变中9种位于外显子2中，这包含串联重复区域(tandem repeat region)[chaturvedi p,singh ap,batra sk.structure,evolution,and biology of the muc4 mucin.faseb j.2008；22(4):966-81.epub 2007/11/21.https://doi.org/10.1096/fj.07-9673rev pmid:18024835；pubmed central pmcid:pmc2835492]，其他突变存在于外显子24中。但是，由于已建立的muc1或muc4模型以及缺乏富含o-糖基化位点的螺旋结构，同源建模或首次(从头算，ab initio)结构建模并不
成功。
[0146]
根据糖基化预测[steentoft c,vakhrushev sy,joshi hj,kong y,vester-christensen mb,schjoldager kt,et al.precision mapping of the human o-galnac glycoproteome through simplecell technology.embo j.2013；32(10):1478-88.epub 2013/04/16.https://doi.org/10.1038/emboj.2013.79pmid:23584533；pubmed central pmcid:pmc3655468][gupta r,brunaks.prediction of glycosylation across the human proteome and the correlation to protein functio n.pac symp biocomput.2002:310-22.epub 2002/04/04.pmid:11928486]，外显子2中的大多数muc4突变位于o-糖基化位点或与其物理上接近的位置(表7)。
[0147]
表7
[0148]
利用netoglyc以及netnglyc的糖基化位点预测
technology.embo j.2013；32(10):1478-88.epub 2013/04/16.https://doi.org/10.1038/emboj.2013.79pmid:23584533；pubmed central pmcid:pmc3655468]。单一密码子从这种预测的切割位点的g到a的变化(c.5375g》a:p.r1792h)可能潜在性地抑制蛋白分解活性。单一密码子从c到t的变化(c.15884c》t)阻碍muc4β亚单位的第二以及第三表皮生长因子(epider mal growth factor，egf)样结构域之间的潜在n-糖基化位点的苏氨酸合成。
[0152]
即，从muc4结构中糖基化的生物信息学(in silico)预测得到的信息表现出由muc4突变编码的大多数区域可能是o-糖基化位点。具有聚糖微异质性(glycan micro-heter ogeneity)的o-糖基化对于粘蛋白结构以及功能很重要。粘蛋白型聚糖参与特定配体-受体相互作用且可以赋予吸湿性，并与各种小分子及蛋白质结合，从而最终可以稳定蛋白质结构[jayaprakash ng,surolia a.role of glycosylation in nucleating protein folding and sta bility.biochem j.2017；474(14):2333-47.epub 2017/07/05.https://doi.org/10.1042/bcj20170111pmid:28673927]。尽管muc4α亚单位中存在几百个o-糖基化位点，一个特定位点中的一个氨基酸差异可以改变编码的突变蛋白的功能[van der post s,thomsson ka,ha nsson gc.multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the c-terminus of the intestinal muc2mucin.j proteome res.2014；13(12):6013-23.epub 2014/11/19.https://doi.org/10.1021/pr500874f pmid:25406038；pubmed central pmcid:pmc4261943]。基于o-糖基化位点周围的氨基酸位置偏好[thanka christlet th,veluraja k.databas e analysis of o-glycosylation sites in proteins.biophys j.2001；80(2):952-60.epub 2001/02/13.https://doi.org/10.1016/s0006-3495(01)76074-2pmid:11159462；pubmed central pmcid:pmc1301293]以及丝氨酸或苏氨酸中的变化[chaturvedi p,singh ap,batra sk.structure,e volution,and biology of the muc4 mucin.faseb j.2008；22(4):966-81.epub 2007/11/21.h ttps://doi.org/10.1096/fj.07-9673rev pmid:18024835；pubmed central pmcid:pmc2835492]，muc4的糖基化可能被改变。
[0153]
另一方面，以往的研究提出muc4可以在胃癌发病过程中激活erbb2肿瘤蛋白[yok oyama a,shi bh,kawai t,konishi h,andoh r,tachikawa h,et al.muc4 is required for act ivation of erbb2 in signet ring carcinoma cell lines.biochem biophys res commun.2007；355(1):200-3.epub 2007/02/13.https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2007.01.133pmid:17292332][s enapati s,chaturvedi p,sharma p,venkatraman g,meza jl,el-rifai w,et al.deregulation of muc4 in gastric adenocarcinoma:potential pathobiological implication in poorly differentiate d non-signet ring cell type gastric cancer.br j cancer.2008；99(6):949-56.epub 2008/09/11.https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6604632pmid:18781152；pubmed central pmcid:pmc253875247,48]。并且，由于突变导致egf样结构域之间的n-糖基化位点的氨基酸变化，因此外显子24中的p.thr5295met突变可以参与erbb2信号传递。
[0154]
综合分析结果显示，muc4的预测性第三egf样结构域的结构模型跨越f5300到l5362的残基，这非常接近突变残基t5295m。这位点与建模成的egf样结构域仅相距5个残基，因此这突变可以影响egf样结构域的功能。
[0155]
实施例6.验证muc4突变与胃癌的关联性
[0156]
从上述实施例2至实施例4确认到具有muc4突变的受试者的患胃癌的风险增加，通过下述方法的基因分型(genotyping)以及免疫组织化学(ihc)分析结果重新验证上述muc4突变与胃癌的关联性。
[0157]
首先，从盆塘首尔大学医院共筛选288名患者，从中筛选完成胃窦(antrum)及胃癌组织的免疫组织化学(ihc)分析的237名受试者(胃癌患者为103名，非胃癌患者(对照组)为134名)。采集上述筛选的237名受试者的胃窦(antrum)，在胃癌患者的情况下采集血液及胃癌组织，从中分离并提取基因组dna(genomic dna)(qiagen dneasy血液和组织试剂盒(qiagen dneasy blood and tissue kit，qiagen，希尔登，德国))。
[0158]
利用所提取的上述dna对muc4的rs774527434以及rs531395109这2种的单核苷酸多态性(snp)进行基因分型。结果，具有muc4基因突变的受试者为共14名，其中非胃癌患者为5名，胃癌患者为9名。
[0159]
作为参考，用于基因分型的引物及报告序列如下。
[0160]
测定muc4的rs774527434的单核苷酸多态性(snp)
[0161]-正向引物(forward primer)：ctttcttcagcttccacagatgac(序列1)
[0162]-反向引物(reverse primer)：tggatgccgaggaaacgt(序列2)
[0163]-报告序列1：accacccgtcttcct(序列3)
[0164]-报告序列2：accacccatcttcct(序列4)
[0165]
测定muc4的rs531395109的单核苷酸多态性(snp)
[0166]-正向引物(forward primer)：gccatcgcatctgaagtaagc(序列5)
[0167]-反向引物(reverse primer)：ggttgctttctgtgttaatctgtgt(序列6)
[0168]-报告序列1：ttcagcgtgctcacg(序列7)
[0169]-报告序列2：cttcagcatgctcacg(序列8)
[0170]
用12.5μl的taqman
tm genotyping master mix(cat no.4371353)、1.25μl的genot yping assay mix(正向引物(forward primer)、反向引物(reverse primer)、报告序列1(reporter 1)、报告序列2(reporter 2))、10.25μl的无酶无菌水(dnase-free water)制备pcr反应液。其中加入1μl(10-50ng)的基因组dna(genomic dna)使总量达25μl，并在95℃的温度下保持(holding)10分钟，然后在92℃的温度下变性(denat ure)15秒钟，在60℃的温度下循环(cycling)50次退火(anneal)/延伸(extend)共1分钟，使用viia 7实时pcr系统(viia7real-time pcr system，applied biosystem s，美国)进行实时(real-time)pcr反应来进行基因分型。
[0171]
另一方面，如实施例4进行免疫组织化学分析。
[0172]
即，通过benchmark xt staining系统以及ultraview universal dab detection kit(ventana medical systems，inc.，图森，亚利桑那，美国)对切片(4μm的厚度)进行整体染色。使用科学显微镜通过面积依赖强度的乘积(％)来如下评价muc1以及mu c4表达，其中在上皮腺(epithelial glands)中观察到如下染色(0至300)：如果未观察到染色则为0；如果微弱或几乎无法察觉的部分染色则为1+；如果微弱或中度的染色则为2+；如果强染色则为3+。在癌组织中，对强染色面积进行评分。由一位病理学家以盲检的方式对各样本进行评分。
[0173]
根据免疫组织化学分析的存在muc4的上述突变的情况下的表达量结果如下述表8所述。
[0174]
表8
[0175]
有muc4突变的受试者的分析结果
[0176][0177]
如上述表8所示，经确认，在具有muc4突变的受试者为胃癌患者的情况下，mu c4在胃窦中的表达减少，在胃癌组织中表现出muc4表达增加的趋势。
[0178]
由此可见，即使利用可以在费用以及时间方面更有效并简单地进行基因分析的基因分型也可以在具有muc4突变的情况下预测或诊断胃癌。
[0179]
综上所述，根据本发明一实施例，与正常对照组不同，胃癌患者在muc4基因的特定的13个区域(rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、r s11717039以及rs547775645)中的一个区域存在突变，尤其，muc4在具有粘蛋白4生殖细胞系(germline)错义突变(rs547775645错义突变)的受试者的非癌性胃粘膜(no ncancerous gastric mucosa)中的表达下调(downregulated)，由于muc4的功能丧失导致胃癌，与正常组织相比，muc4在癌组织中的表达增加，由此可见，当利用muc4基因突变检测制剂时可以预测或诊断胃癌。

技术特征：
1.一种用于预测或诊断受试者的胃癌的组合物，其特征在于，包含粘蛋白4(muc4)基因突变检测制剂，上述突变为muc4基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中的突变。2.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，上述受试者为有胃癌家族史的受试者。3.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，上述突变抑制muc4基因在非癌性胃粘膜中的表达。4.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，与正常胃组织相比，上述突变增加muc4基因在胃癌组织中的表达。5.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，上述rs547775645区域中的突变为错义突变。6.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，上述突变为选自由nm_018406.7：c.5375c>t、nm_018406.7：c.5005t>c、nm_018406.7：c.7658g>a、nm_018406.7：c.11180g>c、nm_018406.7：c.15884g>a、nm_018406.7：c.10673g>a、nm_018406.7：c.6064g>a、nm_018406.7：c.7648g>t、nm_018406.7：c.6638c>t、nm_018406.7：c.6640g>t以及nm_018406.7：c.3053g>c组成的组中的一种以上突变。7.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，上述检测制剂选自由与上述突变特异性结合的反义寡核苷酸、引物对、探针、抗体、肽以及多核苷酸组成的组中的一种以上。8.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，上述胃癌选自由弥漫型胃癌、肠型胃癌以及混合型胃癌组成的组中的一种以上。9.根据权利要求1所述的用于预测或诊断胃癌的组合物，其特征在于，上述组合物用于预测或诊断患有选自由胃腺癌、大肠癌以及子宫内膜癌组成的组中的一种以上癌症的受试者的胃癌。10.一种用于预测或诊断胃癌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至9中的任一项所述的组合物。11.根据权利要求10所述的用于预测或诊断胃癌的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包含说明书，上述说明书中描述：若在检测到的上述muc4基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中存在突变，则预测或诊断为胃癌。12.根据权利要求10所述的用于预测或诊断胃癌的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒应用于患有选自由胃腺癌、大肠癌以及子宫内膜癌组成的组中的一种以上癌症的受试者。13.一种用于预测或诊断胃癌的信息提供方法，其特征在于，包括如下步骤：从受试者的样本中提取基因组dna；以及检测所提取的上述基因组dna中粘蛋白4(muc4)基因的选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、
rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中的突变。14.根据权利要求13所述的用于预测或诊断胃癌的信息提供方法，其特征在于，上述受试者为有胃癌家族史的受试者。15.根据权利要求13所述的用于预测或诊断胃癌的信息提供方法，其特征在于，上述突变检测步骤包括如下步骤：使对选自上述区域的核苷酸序列中的连续核苷酸序列具有特异性的引物进行反应；以及扩增上述反应的产物。16.根据权利要求13所述的用于预测或诊断胃癌的信息提供方法，其特征在于，上述突变为选自由nm_018406.7：c.5375c>t、nm_018406.7：c.5005t>c、nm_018406.7：c.7658g>a、nm_018406.7：c.11180g>c、nm_018406.7：c.15884g>a、nm_018406.7：c.10673g>a、nm_018406.7：c.6064g>a、nm_018406.7：c.7648g>t、nm_018406.7：c.6638c>t、nm_018406.7：c.6640g>t以及nm_018406.7：c.3053g>c组成的组中的一种以上突变。17.根据权利要求13所述的用于预测或诊断胃癌的信息提供方法，其特征在于，在上述信息提供方法中，在上述muc4基因突变检测步骤之后，若检测到上述muc4基因的突变，则预测或确定为胃癌。

技术总结
本发明涉及一种组合物、试剂盒以及信息提供方法，其发现MUC4基因可作为生物标志物用于预测或诊断胃癌，并且能够在上述基因中存在突变时预测或诊断胃癌，本发明一方面的组合物用于检测MUC4基因上的突变，所述突变选自由rs774527434、rs534579185、rs77250903、rs868067409、rs531395109、rs754808151、rs1304612772、rs774907241、rs771925912、rs745342765、rs148735556、rs11717039以及rs547775645组成的组中的一个以上区域中的突变，因此对于大多数受试者显示出以具有成本及时间效益的方式预测或诊断胃癌的优异效果。时间效益的方式预测或诊断胃癌的优异效果。时间效益的方式预测或诊断胃癌的优异效果。


技术研发人员：金那英
受保护的技术使用者：首尔大学校医院
技术研发日：2021.07.09
技术公布日：2023/8/9